一种用于高温发酵生产γ‑聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法

技术领域

本发明属于微生物工程领域，特别涉及到一株用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamic acid）是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键结合而成的微生物源阴离子型胞外高分子化合物。γ-聚谷氨酸分子量可达1,000kDa以上，其分子主链上大量游离亲水性羧基使其具有水溶性聚羧酸性质，并可作为活性位点进行广泛的化学修饰，因此赋予其强吸水保湿、絮凝性和优良的可塑性；另一方面，γ-聚谷氨酸分子主链中的酰胺键易被酶解，降解产物可被生物体吸收，因此赋予其优良的生物降解性和生物相容性，对人体和环境无毒害。这些优良生化特性使得γ-聚谷氨酸及其衍生物可广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和环境保护等领域。

γ-聚谷氨酸最早于1937年在炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）荚膜成分中发现，该物质能伴随着菌体细胞的裂解而释放到培养液中。1942年，γ-聚谷氨酸被发现可作为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产物自由分泌到培养液中，随后多株芽孢杆菌属菌株被报道可合成胞外γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸生产菌株依据发酵培养基中是否需要添加谷氨酸，分为谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株两类。其中，研究比较深入地谷氨酸依赖型菌株有：B. subtilis F-2-01、B. subtilis IFO3335、B. subtilis NX-2、B.licheniformis ATCC 9945A、B. licheniformis WX-02，在此类菌株中谷氨酸既是γ-聚谷氨酸合成诱导剂，又是γ-聚谷氨酸合成底物。谷氨酸非依赖型菌株有：B. subtilis TAM-4、B. licheniformis A35、B. amyloliquefaciens LL3，在此类菌株中底物谷氨酸主要是利用葡萄糖或蔗糖等糖质原料经糖酵解途径和三羧酸循环转化而来。

目前，γ-聚谷氨酸发酵生产研究主要使用谷氨酸依赖型菌株，并采用合成培养基，其中碳氮源和L-谷氨酸是必需组分，pH值一般维持在6.5~7.5，温度30℃~40℃，产物产量与适宜的碳氮比、谷氨酸添加量以及生物量密切相关，各种无机盐比例对γ-聚谷氨酸高效生产也至关重要。相对于谷氨酸依赖型菌株而言，谷氨酸非依赖型菌株的报道和研究相对较少，主要是由于其γ-聚谷氨酸产量相对较低。但是，从发酵原料成本的角度考虑，谷氨酸非依赖型菌株可以利用廉价的糖质原料作为底物生产γ-聚谷氨酸，而不需要使用价格相对较高的谷氨酸或谷氨酸盐作为底物。因此，如果能够选育获得一株γ-聚谷氨酸产量较高的谷氨酸非依赖型菌株，将从节约原料成本角度为γ-聚谷氨酸工业化大规模生产提供另外一种选择。

此外，γ-聚谷氨酸产生菌的发酵温度一般在30℃~40℃，然而在发酵过程中，由于微生物生长和代谢会产生大量的热量，尤其是在夏天或者南方地区，需要提供大量的冷却水对发酵罐进行热交换从而保持发酵过程所需要的特定温度。因此，如果能够从菌种角度出发，选育获得一株能够在较高温度下发酵生产γ-聚谷氨酸的菌株，将从节约发酵工艺成本的层面为γ-聚谷氨酸工业化大规模生产提供另外一种选择。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法。该枯草芽孢杆菌可在较高温度下利用糖质原料作为底物发酵生产γ-聚谷氨酸，最高发酵温度可为55℃，发酵时间48~72h，产量最高可达15g/L以上。本发明提供的枯草芽孢杆菌可不依赖于外源性谷氨酸发酵生产γ-聚谷氨酸，与以往的谷氨酸依赖型菌株相比，能够有效降低发酵生产成本，且具有发酵温度高、营养要求简单和培养方法简便易行等优点，这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明谷氨酸非依赖型产生菌，分类命名枯草芽孢杆菌GXG-5Bacillus subtilisGXG-5， 保藏编号为CCTCC NO：M 2017083，保藏日期为2017年3月6日，保藏单位：中国典型培 养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。该培养物的存活性保藏中心于2017年3月16日检测结果为存活。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG-5，具有如下性状特征：

菌体形态特征：在固体斜面培养基上50℃培养16h后扫描电子显微镜观察，菌体呈杆状，大小0.7-0.9×2.0-3.0μm，可运动，革兰氏染色阳性。在固体斜面培养基上50℃培养30h后芽孢染色观察，可见明显芽孢。

菌落形态特征：在固体平板培养基上50℃培养16h后，菌落圆形、隆起、表面湿润、菌落直径0.5-1.0cm、平板倒置时菌落呈悬滴状；培养30h后，菌落中心开始变干、扁平，边缘分泌粘稠物。

固体平板培养基的浓度组成为：葡萄糖22.5g/L，大豆蛋白胨3g/L，NH4Cl17g/L，KNO35g/L，NaCl5g/L，K2HPO42.5g/L，琼脂15g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。

生理生化如下表所示

注：所列表中的“+”为生长良好或呈阳性；“-”为不生长或呈阴性。

16S rDNA序列分析：

利用通用扩增引物1540r（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）和7f（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’）对该菌株16S rDNA进行扩增测序，测得序列长度1447bp。将所得序列提交至GenBank数据库，获得序列编号GenBank ID: KY711183，与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析，构建系统发育树。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）同源性为99%。结合菌体、菌落形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，可以将该菌株分类鉴定为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GXG-5。

本发明另外还提供了所述枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5在高温发酵条件下，利用糖质原料作为底物发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，该方法包括如下步骤：

（1）菌种活化、保藏

将枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5接于固体斜面培养基上，45~50℃培养12-24h；所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10~15g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨3~6g/L，NaCl 3~6g/L，琼脂15~20g/L，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制。

（2）种子液制备

将上述斜面上1~3cm2的菌苔接入装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160~200rpm，45~50℃培养12~24h至菌株对数生长中期；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10~20g/L，酵母膏2~5g/L，胰蛋白胨5~10g/L，NaCl 5~10g/L，pH值6.5~7.5，蒸馏水配制。

（3）液体摇瓶发酵

将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量1~10%，摇瓶装液量20~80mL/250mL，摇床转速160~250rpm，40~55℃培养48~72h；所述液体发酵培养基浓度组成为：糖质原料10~50g/L，氮源5~30g/L，KNO₃>2HPO₄>

所述液体发酵培养基中糖质原料为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。所述液体发酵培养基中氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄和NH₄NO₃中的任意一种或几种混合物。

（4）γ-聚谷氨酸提取纯化

收集成熟的发酵液，加入2~5倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为10~50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30~50%，加入2~4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。

本发明所获得的γ-聚谷氨酸产品具有如下理化性质：

（1）本发明产品易溶于水，不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂。

（2）本发明产品茚三酮显色反应呈阴性，盐酸水解产物茚三酮反应呈阳性；盐酸完全水解产物经薄层层析分析，氨基酸组分只有谷氨酸；上述说明本产品为谷氨酸的均聚物。

（3）本发明产品在216nm下具有特征吸收峰，在280nm下无吸收峰；双缩脲显色反应呈阴性；上述说明本产品没有典型的肽链结构。

（4）本发明产品经核磁共振（1H-NMR）和红外光谱检测，图谱结果显示与γ-聚谷氨酸标准品结构相符。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明分离获得一株谷氨酸非依赖型的γ-聚谷氨酸产生菌，可以利用廉价的糖质原料作为底物生产γ-聚谷氨酸，而不需要外源添加价格相对较高的谷氨酸或谷氨酸盐作为底物，从节约原料成本角度为γ-聚谷氨酸工业化大规模生产提供了另外一种选择。

2.该枯草芽孢杆菌可在较高温度下利用糖质原料作为底物发酵生产γ-聚谷氨酸，最高发酵温度可为55℃，发酵时间48~72h，产量最高可达15g/L以上，营养要求简单、培养方法简便易行，在大规模生产中能够大大节约冷却水的消耗，对降低发酵工艺成本具有明显的实际应用价值。

附图说明

图1为γ-聚谷氨酸标准品的核磁共振（¹H-NMR）图。

图2为本发明的产品γ-聚谷氨酸的核磁共振（¹H-NMR）图。

图3为γ-聚谷氨酸标准品的红外谱图。

图4为本发明的产品γ-聚谷氨酸的红外谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5的分离

（1）制备菌悬液：称取1g土壤样品接入装有50mL无菌生理盐水的250mL三角瓶中，室温下磁力搅拌25分钟，制成菌悬液，于100℃处理15min。

（2）菌悬液稀释、菌落挑取：将上述所得菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，选择10⁵、10⁶、10⁷倍的菌悬液100μL涂布于固体平板培养基上；50℃恒温培养20h后，挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落。

（3）划线纯化：用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，将获得的单菌落在固体平板培养基上连续划线纯化，50℃恒温培养15h后，挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面，经培养后保存。

（4）摇瓶发酵：用平整、圆滑的接种环挑取斜面上1cm²的菌苔接入装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160rpm，50℃培养10h至菌株对数生长中期，将种子液按2%接种量接入装有50mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160rpm，50℃培养48h。

（5）γ-聚谷氨酸产量测定：收集上述摇瓶发酵液，加入3倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为20KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%，加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸产量。

其中，固体平板培养基的浓度组成为：葡萄糖22.5g/L，大豆蛋白胨3g/L，NH₄Cl17g/L，KNO_{3>5g/L，NaCl>2}HPO_{4>2.5g/L，琼脂15g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖22.5g/L，大豆蛋白胨3g/L，NH4Cl>3>5g/L，NaCl>2}HPO_{4>2.5g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。}

本发明依此方法筛选获得一株用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖型菌株——枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5。

实施例2：枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5的鉴定

（1）菌体形态特征

在固体斜面培养基上50℃培养16h后电镜观察，菌体呈杆状，大小0.7-0.9×2.0-3.0μm，可运动，革兰氏染色阳性。在固体斜面培养基上50℃培养30h后芽孢染色观察，可见明显芽孢。

（2）菌落形态特征

在固体平板培养基上50℃培养16h后，菌落圆形、隆起、表面湿润、菌落直径0.5-1.0cm、平板倒置时菌落呈悬滴状；培养30h后，菌落中心开始变干、扁平，边缘分泌粘稠物。

固体平板培养基的浓度组成为：葡萄糖22.5g/L，大豆蛋白胨3g/L，NH₄Cl17g/L，KNO₃5g/L，NaCl5g/L，K₂HPO₄2.5g/L，琼脂15g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。

（3）生理生化如下表所示

（4）16SrDNA序列分析

利用通用扩增引物1540r（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）和7f（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’）对该菌株16S rDNA进行扩增测序，测得序列长度1447bp。将所得序列提交至GenBank数据库，获得序列编号GenBank ID: KY711183，与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析，构建系统发育树。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus>subtilis）同源性为99%。结合菌体、菌落形态特征、生理生化特征和16S>Bacillus>）GXG-5。

以下为本发明所述枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5的16S rDNA核苷酸序列信息：

实施例3：枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5发酵产物γ-聚谷氨酸的鉴定与表征

（1）化学组成分析：取本发明产品500mg于水解管中，加入10mL6M盐酸，抽真空，105℃水解8h，冷却后，用6M氢氧化钠调节pH至7.0，得到水解液，定容至100mL并经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。将上述水解液进行薄层层析分析，展开剂：正丁醇：乙酸：嘧啶：水=4：1：1：2（v/v），显色剂：0.2%茚三酮溶于丙酮溶液。结果显示，水解液在硅胶板上只有一个斑点，且与谷氨酸标准液一致，说明本产品为谷氨酸的聚合物。

（2）红外光谱分析：将少量本发明产品与干燥KBr粉末混合后，研磨压片，利用傅里叶红外光谱仪在4000~400cm^-1范围内扫描分析其红外吸收波谱。结果显示，与γ-聚谷氨酸标准品红外图谱基本一致。

（3）核磁共振波谱分析：用D₂O溶解本发明产品制备成0.2mg/mL溶液，利用傅里叶核磁共振波谱仪在600MHz条件下进行氢谱扫描分析。结果显示，与γ-聚谷氨酸标准品核磁图谱基本一致。

（4）肽链结构分析：用去离子水将本发明产品制备成1mg/mL水溶液，利用紫外可见分光光谱仪在190~390nm波长范围下扫描分析产物紫外吸收波谱，结果显示，本发明产品在216nm下具有特征吸收峰，在280nm下无吸收峰。此外，将本发明样品5mg溶于1mL去离子水中，缓慢滴加双缩脲试剂（NaOH溶液（0.1g/mL）：CuSO4溶液（0.01g/mL）=5：1，v/v），结果显示双缩脲显色反应呈阴性。上述结果说明本发明产品没有典型的肽链结构。

（5）溶解性分析：取本发明样品5mg，结果显示其易溶于水，不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂。

实施例4：枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5高温发酵生产γ-聚谷氨酸

（1）菌种活化、保藏：将枯草芽孢杆菌（Bacillus>）GXG-5接于固体斜面培养基上，50℃培养16h；所述固体斜面培养基的浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。

（2）种子液制备：将上述斜面上1cm²的菌苔接入装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180rpm，50℃培养16h至菌株对数生长中期；所述液体种子培养基浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl>

（3）液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中，接种量5%，摇瓶装液量50mL/250mL，摇床转速180rpm，55℃培养48h；所述液体发酵培养基浓度组成为：葡萄糖30g/L，大豆蛋白胨5g/L，NH₄NO_{3>25g/L，KNO3>5g/L，NaCl>2HPO4>2.5g/L，pH值7.0，蒸馏水配制。}

（4）γ-聚谷氨酸产量测定：收集上述摇瓶发酵液，加入3倍体积蒸馏水稀释，利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，上清液采用截留分子量为20KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%，加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀，收集沉淀，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量，换算成发酵液中γ-聚谷氨酸产量为15.6±0.5g/L。

核苷酸序列表

<110>广西大学

<120>一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1447

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400>1

acttccccca atcatctgtc ccaccttcgg cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga 60

cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta 120

ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc 180

agactgcgat ccgaactgag aacagatttg tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg 240

ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt 300

gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc accttagagt gcccaactga 360

atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga 420

cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc 480

tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa 540

ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac 600

cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc 660

taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc 720

cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt 780

tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac 840

tcaagttccc cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact 900

taagaaaccg cctgcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg 960

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt 1020

accgccctat tcgaacggta cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac 1080

cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca gactttcgtc cattgcggaa gattccctac 1140

tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc 1200

aggtcggcta cgcatcgttg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatgcgccg 1260

cgggtccatc tgtaagtggt agccgaagcc accttttatg tttgaaccat gcggttcaaa 1320

caaccatccg gtattagccc cggtttcccg gagttatccc agtcttacag gcaggttacc 1380

cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaaca tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg 1440

acttgca 1447