一种快速评估睾丸生精功能的免疫荧光染色法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生殖医学技术领域，具体地说，是一种用于快速、准确评估睾丸组织生精功能情况的抗体组合、染色方法及其试剂盒。

背景技术

非梗阻性无精子症(Non-obstructive azoospermia，NOA)在不育男性中的发病率约10％，占到无精子症的60％，其特征表现为睾丸组织不同程度的生精损害。非梗阻性无精子症病人的睾丸组织的病理分类主要分为：1.生精低下；2.生精阻滞；3.唯支持细胞综合征；等。目前，手术中(包括睾丸穿刺、睾丸活检和睾丸显微取精术)判断病人睾丸生精情况的方法主要是：将睾丸组织在HTF液(一种人输卵管液模拟物)中尽量剪碎成单个细胞或细胞团块后，将细胞悬液制成玻片放置在带相差的正置显微镜下直接观察，寻找是否有精子及各级生精细胞。这种方法虽然比较简单快速，但是破坏了生精小管的正常结构，因为操作人员是根据各级生精细胞的大小、折光度和核质比等指标进行辨认区分，所以检测结果的准确性很大程度上依赖于检验人员的经验水平，对于术中及术后患者的评估和治疗具有一定的局限性。现阶段临床上使用的另一种评估患者生精功能的方法，也是现行公认的“金标准”是患者睾丸组织的术后石蜡切片的HE染色，但这种方法所需要的准备时间长，患者和医务人员通常需要两周时间才能知道检查结果，对于患者的术中评估以及术后治疗方案的选择不具有即时性。另外，睾丸生精小管是长形的管道结构，管腔内的生精灶并不是均匀分布的，特别是对于生精受损的病人而言，常常会在睾丸整体生精功能下降甚至丧失的情况下仍然保留小范围的局灶性的生精灶，而病理切片是管腔的横断面，所以病理切片能观察到生精灶的概率等于生精灶占整个生精小管长度的比例，当病人生精情况较差，这一比例较小时，病理切片的横断面很容易避开生精灶而导致假阴性的结论。另一方面，对于在手术中将睾丸组织剪碎成单个细胞或细胞团块后放置在带相差的正置显微镜下直接观察的方法，当生精灶占整体生精小管的比例较小时，也可能由于生精细胞被过度稀释导致假阴性的结论。

因此根据现有技术的缺点，有必要研发一种用于评估患者睾丸生精功能情况的方法，可以在术中快速有效查找和区分患者睾丸生精小管内的生殖细胞。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中耗时长或主观性强等不足，提供一种快速、准确评估睾丸组织生精功能的方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的荧光染色试剂盒。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，结合睾丸各种生精细胞的特异性标志物相关规律，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合。

本发明的第四个目的是针对现有技术中结果的解读依赖于操作人员经验的主观判断的不足，提供如上所述抗体组合的用途，并根据染色结果对无精子症患者进行更加细致、客观的分类。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种快速评估睾丸组织生精功能的方法，以生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c-KIT、SCP3和PNA表达情况，根据检测结果评估患者生精功能。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒，所述试剂盒包括抗体染料试剂D1和试剂D2，所述试剂D1由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成；所述试剂D2由荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成。

进一步，所述试剂盒还包括阴性对照抗体染料试剂D3，所述试剂D3由488驴抗兔IgG荧光二抗及555驴抗鼠IgG荧光二抗组成。

进一步，所述试剂D1或试剂D2中的抗体不同的荧光标记，所述荧光标记为FITC标记或PE标记。

进一步，所述试剂盒还包括染色辅助试剂。试剂A:红细胞裂解液；试剂B：4％多聚甲醛固定液；试剂C：含5％胎牛血清(BSA)，)和0.5％Triton X-100的PBS液；试剂E：荧光封片剂；试剂F：PBS液。

进一步，所述试剂盒还包括使用说明书，染色所需的改良EP管。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合，所述抗体组合由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体和荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成的抗体组合物和荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成的抗体组合物组成。其中，GFRA1是一种精原干细胞的表面标志物，c-KIT是一种分化型精原细胞的表面标志物，SCP3是一种精母细胞核减数分裂前特异表达的蛋白，PNA则标记一种精子细胞和精子的顶体蛋白。

进一步，所述阴性对照抗体组合还包括由488驴抗兔荧光二抗及555驴抗鼠荧光二抗组成的抗体组合物，当非特异性染色较多(某些特殊病例)或睾丸自发荧光较强时，对比阴性对照后可以避免假阳性结果。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的抗体组合制备快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒中的应用。

进一步，还包含说明书，所述说明书记载以下内容：试剂准备阶段：用试剂C分别按一定比例(推荐1:500，可根据染色情况调整)稀释试剂D1、D2、D3，制成工作液。生精小管玻片制备阶段：(1)获取人生精小管(长度在3-5cm即可充分供检测使用)，放入改良EP管的上层滤网中，在试剂F(PBS液)中漂洗3分钟；(2)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂B，室温孵育10min；(3)(可选步骤，用于取得的睾丸组织含血块、血液较多的情况)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂A，室温摇床放置10分钟；(4)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；(5)(可选步骤，当染色背景较高时选做)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂C，室温孵育30-60min；(6)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其分成三等份，分别放入三个新的改良EP管滤网中，分别放入D1、D2、D3工作液500ml室温孵育15-30min；(7)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；(8)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其尽量铺展开，使用试剂E封片处理，在荧光显微镜下观察，根据观察结果，判断受试者的生精功能情况。

进一步，说明书还包括典型的染色结果图和常用的睾丸生精情况分类方法以供参考，所述分类方法记载以下内容：睾丸生精情况的病理分类主要分为三种类型，分别为生精正常、生精阻滞、无生精或生精低下；(1)所述生精正常判断标准为：所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性；(2)所述生精阻滞判断标准为：①所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阴性；②所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阴性和PNA阴性；③所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阴性、SCP3阴性和PNA阴性；(3)所述无生精或生精低下判断标准为：①无生精：所有生精小管GFRA1阴性、c-KIT阴性、SCP3无性、PNA阴性；②生精低下：所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性但是数量偏低或者生精灶只存在于生精小管的部分区域。本发明提供了一种全新的术中评估患者睾丸生精情况的方法，可以在术中快速有效查找和区分患者睾丸生精小管内的生殖细胞，包括1.精原干细胞；2.分化型精原细胞；3.精母细胞；4.精子细胞及精子。本发明将方便临床医生了解患者的睾丸损害发生于生精过程的哪一阶段，评价生精损害发生的范围，为手术和术后的后续治疗提供参考。

本发明的优点：

1、本发明首次在术中/术后把生殖细胞表面标志物的免疫荧光化学染色用于快速评价患者的生精功能。并将四种生殖细胞表面标记物的荧光直标抗体组合起来制成试剂盒，方便快速检测。

2、本发明将取得的组织整个置于显微镜下观察，理论上不会遗漏所检测组织的任何一个生精灶，所以具有极高的敏感性。除此之外，本方法所得的结果还包括了生精灶占整个生精小管的比例，这对于评估患者的生精功能是一个非常重要的指标，是通过之前的传统检查方法所无法得到的。

3、本发明的评估方法用时少，传统石蜡病理结果取得报告需要两周左右的时间，而本方法从取得睾丸组织到完成封片观察在1小时之内便可完成。

4、操作方便，通过将抗体、红细胞裂解液和穿透封闭液等制成试剂盒，不仅实验室专业人员甚至非专业人员通过简单培训也可以完成检测。

5、检测结果直观易懂，通过我们提供的标准图谱和阴性对照，经过简单培训的人员即可读懂检测结果图。

6、染色材料容易获得，本试剂盒所用的试剂均比较容易生产，每一份样品所需要的试剂不多，检测成本相对低廉。因为不需要使用传统石蜡切片染色所用到的有机溶剂(二甲苯、乙醇等有机溶剂具有易挥发、易燃和有毒等特点，操作均需在通风橱中进行)，所以对操作场所要求不高，同时可以避免有机溶剂对操作人员的健康伤害。

7、结果解读不依赖于操作人员经验的主观判断，所以能准确、客观地将各阶段的生精细胞区分开来，具有极高的敏感度和可靠的特异度，对于患者的评估和后续治疗有着重要的价值。

8、本发明还提出了评估患者生精功能情况的新方法，通过观察生精灶的范围和生精灶内部生精细胞的情况，对患者的生精功能情况做出更加全面的评估。

附图说明

附图1为制作完成的睾丸生精小管玻片。

附图2为生精正常组病人的睾丸生精小管染色结果。

附图3为生精阻滞组病人的睾丸生精小管染色结果。

附图4为无生精(唯支持细胞综合征)病人生精小管染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1检测试剂盒

试剂A:红细胞裂解液；

试剂B：4％多聚甲醛固定液；

试剂C：含5％胎牛血清(BSA)和0.5％Triton X-100的PBS液

试剂D1：FITC标记的兔抗人源GFRA1抗体；PE标记的鼠抗人源c-KIT抗体；

试剂D2：FITC标记的兔抗人源SCP3抗体；PE标记的鼠抗人源PNA抗体；

试剂D3：488驴抗兔荧光二抗；555驴抗鼠荧光二抗；

试剂E：荧光封片剂；

试剂F：PBS液。

实施例2检测步骤

试剂准备阶段：用试剂C分别按一定比例(推荐1:500，可根据染色情况调整)稀释试剂D1、D2、D3，制成工作液。

生精小管玻片制备阶段：

(1)获取人生精小管(长度在3-5cm即可充分供检测使用)，放入改良EP管的上层滤网中，在试剂F(PBS液)中漂洗3分钟；

(2)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂B，室温孵育10min；

(3)(可选步骤，用于取得的睾丸组织含血块、血液较多的情况)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂A，室温摇床放置10分钟；

(4)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；

(5)(可选步骤，当染色背景较高时选做)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂C，室温孵育30-60min；

(6)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其分成三等份，分别放入三个新的改良EP管滤网中；

(7)分别放入D1、D2、D3工作液500ml室温孵育15-30min；

(8)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；

(9)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其尽量铺展开，使用试剂E封片处理，在荧光显微镜下观察，根据观察结果，判断受试者的生精功能情况。

实施例3检测方法

使用荧光标记的IgG抗体特异性结合目前较为公认的精原干细胞、分化型精原细胞、精母细胞以及精子(或精子细胞)的标志性蛋白，通过观察其染色的结果来确定睾丸生精小管内各种生精细胞的数量以及分布情况，从而判定患者睾丸的生精功能。试剂D1孵育的生精小管中：未分化精原细胞表面标志物GFRA1在荧光显微镜下激发出绿色荧光，分化精原细胞表面标志物c-KIT在荧光显微镜下激发出绿色荧光；试剂D2孵育的生精小管中：精母细胞减数分裂前标志物SCP3在荧光显微镜下激发出绿色荧光，精子(精子细胞)顶体标志物PNA在荧光显微镜下激发出红色荧光。试剂D3孵育的生精小管作为阴性对照。

实施例4临床实验

通过对58例临床样本的初步试验，在对于病理类型的判断上，58例中56例(96.6％)与手术中直接将单个细胞或细胞团块后放置在带相差的倒置显微镜下观察的结果符合，58例中57例(98.3％)与术后石蜡病理结果符合。其中，根据病人是否有精子(精子细胞)以及其他生精细胞分为三组：生精正常组、生精阻滞组、无生精或生精低下组。其染色结果分别为图2、图3和图4。其中各小图片含义为：A：绿色荧光代表GFRA1阳性细胞(未分化精原细胞)；B：红色荧光代表c-KIT阳性细胞(分化精原细胞)；C：图A和图B进行叠加后的效果；D：绿色荧光代表SCP3阳性细胞(精母细胞)；E：红色荧光代表PNA阳性细胞(精子及精子细胞)；F：图D和图E进行叠加后的效果；G：单纯使用488驴抗兔荧光二抗进行染色后的阴性对照；H：单纯使用555驴抗鼠荧光二抗进行染色后的阴性对照；I：图G和图H进行叠加后的效果。各个生殖细胞表面标志物染色的特点为：GFRA1和c-KIT定位于细胞膜，GFRA1阳性的染色应为中空的圆形、类圆形或多边形，大小约10um，常常相互紧靠并成串或成簇排列；SCP3定位于细胞核，SCP3阳性的染色应为实心的类圆形，大小约8um，相互之间不接触；PNA定位于精子或精子细胞的顶体，呈月牙(精子)或空心圆形(圆形精子细胞)，大小约为2um，相互不接触。根据上述标准，图2结果为：GFRA1阳性(有未分化精原细胞)、c-KIT阳性(有分化型精原细胞)、SCP3阳性(有精母细胞)、PNA阳性(有精子及精子细胞)。图3结果为：GFRA1阳性(有未分化精原细胞)、c-KIT阳性(有分化型精原细胞)、SCP3阳性(有精母细胞)、PNA阴性(无精子及精子细胞)。图4结果为：GFRA1阴性(无未分化精原细胞)、c-KIT阴性(无分化型精原细胞)、SCP3阴性(无精母细胞)、PNA阴性(无精子及精子细胞)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。