一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法

技术领域

本发明涉及微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒病是主要暴发在鳜身上的一种疫病，由虹彩病毒科肿大细胞病毒属中的传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)引起，致死率超90％。患病鳜鱼的脾脏和肾脏出现出血和肿大等临床症状。该病每年给鳜养殖业带来巨大经济损失。

鳜弹状病毒病由弹状病毒科中的鳜弹状病毒(Siniperca Chuatsi Rhabdovirus，SCRV)引起，致死率超80％。患病鳜鱼主要表现出皮肤出血的临床症状。该病每年给鳜养殖业带来巨大经济损失。

目前疫苗预防是预防病毒病最有效的方法。

本实验室建立的鳜鱼脑组织细胞系(Chinese Perch Brain Cell Line，CPB)属于贴壁依赖型细胞，对鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒敏感，可用于生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒。

目前常用转瓶工艺培养细胞生产病毒，转瓶培养的环境条件难以监测和控制，细胞密度较低，且劳动强度大、成本较高和各批次病毒效价差异较大。而微载体悬浮培养工艺则优于转瓶培养工艺。

1967年，Van Wezel提出微载体概念，目前微载体培养技术在国外被广泛应用。微载体是指直径在60-250μm之间，表面可供细胞黏附生长的微球，在适当搅拌下可悬浮于培养液中。最初Van Wezel et al设计的微球DEAE-Sephadex A50因电荷量过大而对细胞有毒性，可抑制细胞生长，Levine et al合成的带电量2.0meq DEAE/g干重的DEAE-Sephadex，降低了带电量，可用于较高浓度的微载体培养细胞。微载体研究热点是新材料的研发，目前有十几种已经商品化，根据材料大致分为葡聚糖、明胶、纤维素、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲壳胺、藻酸盐凝胶以及磁性微载体等，应用最广的为Cytodex系列、Cytopore系列和Cytoline系列。

目前对于鳜传染性脾肾坏死病毒液和鳜弹状病毒液的疫苗研究报道较少，主要难题在于获得高滴度病毒存在技术困难，成本高、时间久。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，其特征在于，以搅拌瓶和生物反应器微载体培养的CPB细胞作为鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的生产细胞。

进一步的，上述方法具体包括以下步骤：

1)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：

将CPB单一细胞悬液接种至含0.28～0.32g已预处理微载体的125mL细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上28～32个细胞；以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为100ml；以39～41r/min进行连续搅拌；

2)CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后转移至含已预处理微载体的500mL细胞培养搅拌瓶中，新旧微载体数的比例为2.8～3.2：1，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液使微载体浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为400ml；以44～46r/min进行连续搅拌；

3)CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后移至含3.3g已预处理微载体的3L生物反应器中进行二次放大培养，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液至终体积1.5L，此时微载体浓度为2.8～3.2g/L，以54～56r/min进行连续搅拌；

4)鳜传染性脾肾坏死病毒或鳜弹状病毒制苗液的制备：

鳜传染性脾肾坏死病毒制苗液的制备：CPB细胞二次放大培养后的第71～73h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，洗涤后以感染复数MOI为4.8～5.2加入鳜传染性脾肾坏死病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～ 41r/min每11～13min搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加剩余含血清的孵育液至终体积，接毒后第118～122h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液；

鳜弹状病毒制苗液的制备：CPB二次放大培养后的第95～97h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，吸出孵育液，以感染复数MOI为0.09～0.11加入鳜弹状病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～41r/min每11～13min 搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加含血清的孵育液至终体积；接毒后第35～37h 沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液。

进一步的，上述微载体为Cytodex 1微载体。

进一步的，步骤4)中，所述孵育液为L15培养基。

进一步的，步骤4)中，所述终体积中血清浓度为5％。

进一步的，CPB细胞在生物反应器中培养时，pH为7.0-7.4，温度为27-28℃，DO为50％。

进一步的，搅拌瓶和生物反应器使用前均经过硅化处理。

上述任一项所述的方法制备得到的鳜传染性脾肾坏死病毒液和/或鳜弹状病毒液。

上述所得鳜传染性脾肾坏死病毒液和/或鳜弹状病毒液在制备预防相应病毒疫苗中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明方法所制得的ISKNV效价高达8.34LgTCID₅₀/mL，SCRV效价高达10.25LgTCID₅₀/mL。操作简单，污染概率小，培养相同毒量下相对于转瓶培养方式劳动力小，生产成本低于转瓶等其他培养方式。

附图说明

图1为各搅拌方式下的细胞贴壁率；

图2为相差显微镜下细胞接种5h后贴壁情况(10×)，图A和图B分别为H组和E组；

图3为各活细胞接种密度下的细胞生长曲线；

图4为各微载体浓度下细胞生长曲线；

图5为不同新旧微载体数放大比例下细胞生长曲线；

图6为初期培养搅拌瓶中各搅拌速度下细胞生长曲线；

图7为初次放大培养搅拌瓶中各搅拌速度对应的细胞生长曲线；

图8为二次放大培养生物反应器中各搅拌速度对应的细胞生长曲线；

图9为ISKNV不同接毒时间下病毒增殖曲线；

图10为SCRV不同接毒时间下病毒增殖曲线；

图11为ISKNV不同感染复数下病毒增殖曲线；

图12为SCRV不同感染复数下病毒增殖曲线；

图13显微镜下Cytodex1上CPB细胞的贴附情况(20×)；A：空微载体；B：第1d； C：第2d；D：第3d；E：细胞在Cytodex1上贴满单层后出现“架桥”现象；

图14为显微镜下CPB细胞接种ISKNV后的病变状态(40×)；A：Cytodex1上细胞未出现明显变化；B：细胞开始肿大，聚缩变圆；C：90％以上细胞出现CPE；D：细胞几乎全部脱落；

图15为显微镜下CPB细胞接种SCRV后的病变状态(40×)；A：部分细胞出现脱落；B：细胞出现“拉丝”现象；C：细胞几乎全部脱落。

具体实施方式

一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，其特征在于，以搅拌瓶和生物反应器微载体培养的CPB细胞作为鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的生产细胞。

优选的，上述方法具体包括以下步骤：

1)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：将CPB单一细胞悬液接种至含0.28～0.32g已预处理微载体的125mL细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上28～32个细胞；以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为100ml；以39～41r/min进行连续搅拌；

2)CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后转移至含已预处理微载体的500mL细胞培养搅拌瓶中，新旧微载体数的比例为2.8～3.2：1，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液使微载体浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为 400ml；以44～46r/min进行连续搅拌；

3)CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后移至含3.3g已预处理微载体的3L生物反应器中进行二次放大培养，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液至终体积1.5L，此时微载体浓度为2.8～3.2g/L，以54～56r/min进行连续搅拌；

4)鳜传染性脾肾坏死病毒或鳜弹状病毒制苗液的制备：

鳜传染性脾肾坏死病毒制苗液的制备：CPB细胞二次放大培养后的第71～73h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，洗涤后以感染复数MOI为4.8～5.2加入鳜传染性脾肾坏死病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～ 41r/min每11～13min搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加剩余含血清的孵育液至终体积，接毒后第118～122h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液；

鳜弹状病毒制苗液的制备：CPB二次放大培养后的第95～97h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，吸出孵育液，以感染复数MOI为0.09～0.11加入鳜弹状病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～41r/min每11～13min 搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加含血清的孵育液至终体积；接毒后第35～37h 沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液。

优选的，上述方法具体包括以下步骤：

1)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：将CPB单一细胞悬液接种至含0.3g 已预处理微载体的125mL细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上30个细胞；以每隔42min搅拌3min的方式间歇搅拌5h后；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为3g/L，此时培养液体积为100ml；以40r/min进行连续搅拌；

2)CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后转移至含已预处理微载体的500mL细胞培养搅拌瓶中，新旧微载体数的比例为3：1，以每隔42min搅拌3min的方式间歇搅拌5h后，补加细胞培养液使微载体浓度为3g/L，此时培养液体积为400ml；以45r/min进行连续搅拌；

3)CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后移至含3.3g已预处理微载体的3L生物反应器中进行二次放大培养，以每隔42min搅拌3min的方式间歇搅拌5h后，补加细胞培养液至终体积1.5L，此时微载体浓度为3g/L，以55r/min进行连续搅拌；

4)鳜传染性脾肾坏死病毒或鳜弹状病毒制苗液的制备：

鳜传染性脾肾坏死病毒制苗液的制备：CPB细胞二次放大培养后的第72h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，洗涤后以感染复数MOI为5加入鳜传染性脾肾坏死病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以40r/min每12min 搅拌3min，持续进行2h后，补加剩余含血清的孵育液至终体积，接毒后第120h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液；

鳜弹状病毒制苗液的制备：CPB二次放大培养后的第96h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，吸出孵育液，以感染复数MOI为0.1加入鳜弹状病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以40r/min每12min搅拌3min，持续进行2h后，补加含血清的孵育液至终体积；接毒后第36h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液。

优选的，上述微载体是预处理后的微载体，预处理的具体操作为：将微载体粉末放入经二氯二甲基硅烷硅化过的普通玻璃瓶中，添加无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS，室温水合，然后静止沉降微载体，移除PBS，用新鲜的PBS洗涤，最后加入新鲜的PBS，盖上瓶口进行高压蒸汽灭菌，冷却至室温后，用含血清的L15培养基洗涤，再补加含血清的L15培养基；转移至经二氯二甲基硅烷硅化过的搅拌瓶中平衡过夜，或者导入硅化的罐体，设置温度28℃、pH为7.2，溶氧DO为50％，并通过8％NaHCO₃溶液稳定pH，平衡过夜，。

优选的，上述微载体为Cytodex 1微载体。

优选的，步骤1)中，CPB单一细胞悬液的制备方法为：取刚长满单层且生长良好的CPB 细胞，用质量浓度为0.25％胰蛋白酶液润洗细胞后立即吸出，待细胞正脱落时加入10％FBS 的L15培养液终止消化制成均匀的单一细胞悬液。

优选的，所述细胞消化液为28℃的0.01％EDTA-0.25％的胰蛋白酶液。

优选的，进行细胞消化时，以50r/min的搅拌速度消化细胞，待70％以上的细胞脱落时，以含10％PBS的L15培养基终止消化。

优选的，步骤4)中，所述孵育液为L15培养基。

优选的，步骤5)中，所述终体积中血清浓度为5％。

优选的，所有细胞培养的温度均为28℃。

优选的，搅拌瓶和生物反应器使用前均经过硅化处理。

优选的，CPB细胞在生物反应器中培养时，pH为7.0，温度为28℃，DO为50％。

上述任一项所述的方法制备得到的鳜传染性脾肾坏死病毒液和/或鳜弹状病毒液。

上述所得鳜传染性脾肾坏死病毒液和/或鳜弹状病毒液在制备预防相应病毒疫苗中的应用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法

主要实验材料：

1.细胞：CPB细胞(见CN 104694483A)；

2.毒种：鳜传染性脾肾坏死病毒ISKNV(QY)株，鳜弹状病毒SCRV；

3.微载体：Cytodex1，GE Health care公司产品；

4.搅拌瓶：双侧臂搅拌瓶，Wheaton，USA；

5.生物反应器：BC型3L生物反应器，广州齐志生物工程设备有限公司。

一、实验器材的处理

1.搅拌瓶的处理：用自来水冲洗搅拌瓶3遍以上，超纯水冲洗3遍以上，121℃高压蒸汽灭菌；

2. 3L生物反应器的处理

(1)清洗

a.罐体和玻璃瓶：先用洗洁精浸泡清洗，再用自来水冲去残留洗洁精，纯水冲洗6遍以上。

b.罐盖、瓶盖、快接头和硅胶管等材料：先用洗洁精浸泡清洗，再用自来水冲去残留洗洁精，再用1％NaOH溶液浸泡过夜，取出后用自来水冲洗10遍以上，纯水冲洗6遍以上。硅胶管清洗时用自来水冲洗内壁，碱液浸泡时用虹吸效应将碱液注入管内。

(2)电极矫正

a.pH电极：分别用稳定的pH＝4.01、7.00、9.21的缓冲液矫正pH电极。

b.温度电极：用100℃沸水矫正温度电极。

c.溶氧电极：用饱和NaHSO₃溶液矫正溶氧电极。

(3)气密性检验：往罐体中加入1LPBS，将反应器各部位组装连接，将罐体放入水中，往罐体不断充气，观察水中是否产生气泡，无气泡则说明罐体完全密闭，气密性良好。

(4)灭菌：将已检验气密性的反应器置于高压灭菌锅中，121℃灭菌50min。

(5)无菌检验：灭完菌后取出反应器降至室温，将1L无菌培养基注入罐体内37℃静止 3d，如培养基不变浑浊，且无菌落生产，则无菌检验合格，可用于细胞培养。

3.硅化

在通风厨中用二氯二甲基硅烷润湿搅拌瓶和生物反应器罐体内壁10min以上，烘干后自来水冲洗10次以上，去离子水冲洗3次以上，烘干备用。

二、微载体的预处理

水化：按培养的终体积称取微载体适量，使微载体终浓度为3g/L，称取适量干重的微载体Cytodex1粉末到经二氯二甲基硅烷硅化过的普通玻璃瓶中，每克干重Cytodex1添加50～100mL无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(50～100mL/g>2+和Mg²⁺)，用新鲜的PBS(30-50mL/g>3溶液稳定pH，平衡过夜，第2d用于接种细胞。

三、微载体悬浮培养CPB细胞

1.CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养

取刚长满单层且生长良好的CPB细胞，用质量浓度为0.25％胰蛋白酶液润洗细胞并及时吸出，待细胞刚要脱落时加入10％FBS的L15培养液终止消化制成均匀的单一细胞悬液，用台盼蓝染色法计数活细胞，按30cells/球(细胞的接种量为每个微载体上30个细胞)的活细胞接种密度接种至含预处理过的微载体Cytodex1的125mL搅拌瓶中，并使培养液体积为最终培养体积的一半，将搅拌瓶置于低速磁力搅拌器上28℃恒温培养，以每隔42min搅拌3min 的方式间歇搅拌5h，记为3min/42min/5h(下文均采用这种表述)，补加培养液至终体积 100mL，使微载体Cytodex1的浓度为3g/L，以40r/min进行连续搅拌。

2.CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养

微载体上细胞长至平台期时，细胞在第三天可达到平台期，浓度可达2.26×10⁶个/mL，静置沉降微载体，吸出上清液，用PBS洗涤两次，加入28℃预热的0.01％EDTA-0.25％的胰蛋白酶液，以50r/min的搅拌速度消化细胞，取样于显微镜下观察，待70％以上的细胞脱落时，以含10％PBS的L15培养基终止消化，保持微载体浓度不变的情况下，按新旧微载体数>

3.CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养

细胞在500mL搅拌瓶中第4天可生长至平台期，浓度可达2.25×10⁶个/mL，在微载体上形成致密单层，静置沉降微载体，吸出上清液，用PBS洗涤两次，加入28℃预热的0.01％EDTA-0.25％的胰蛋白酶液，以50r/min的搅拌速度(50r/min)消化细胞，取样于显微镜下观察，待70％以上的细胞脱落时，以含10％PBS的L15培养基终止消化，保持微载体浓度不变的情况下，将细胞液放大至含微载体和培养液的3L生物反应器中，28℃下>

四、病毒制苗液的制备

ISKNV制苗液的制备：细胞在3L生物反应器中培养至72h时，停止搅拌，静置沉降微载体，吸出上清液，用等体积孵育液洗涤2遍，吸出孵育液，以MOI为5接种ISKNV病毒液，并补加无血清的孵育液使体积为终体积的一半，28℃下3min/12min/2h间歇搅拌吸附后补加剩余病毒维持液(含10％FBS的L15培养液)至终体积，使血清FBS终浓度为5％。在第120h收获病毒，离心去除细胞碎片，过滤，置-80℃备用，病毒滴度可达8.34LgTCID₅₀/mL。

SCRV制苗液的制备：细胞在3L生物反应器中培养至96h时，停止搅拌，静置沉降微载体，吸出上清液，用等体积孵育液洗涤2遍，吸出孵育液，以MOI为0.1接种SCRV病毒液，并补加无血清的孵育液使体积为终体积的一半，28℃下3min/12min/2h间歇搅拌吸附后补加剩余病毒维持液(含10％FBS的L15培养液)至终体积，使血清FBS终浓度为5％。在第36h 收获病毒，离心去除细胞碎片，过滤，置-80℃备用，病毒滴度可达10.25LgTCID₅₀/mL。

实施例2：一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法

1)微载体的预处理；将Cytodex 1微载体粉末放入经二氯二甲基硅烷硅化过的普通玻璃瓶中，添加无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS，室温水合，然后静止沉降微载体，移除PBS，用新鲜的PBS>

2)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：将微载体和CPB单一细胞悬液接种至含细胞培养液的细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上30个细胞；以每隔42min 搅拌3min的方式间歇搅拌5h；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为3g/L，以 40r/min进行连续搅拌；搅拌瓶和生物反应器使用前均经过硅化处理。

CPB单一细胞悬液的制备方法为：取刚长满单层且生长良好的CPB细胞，用质量浓度为 0.25％胰蛋白酶液润洗细胞后立即吸出，待细胞正脱落时加入10％FBS的L15培养液终止消化制成均匀的单一细胞悬液。

3)CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，静置沉降微载体，去除上清液，用PBS洗涤，加入细胞消化液进行细胞消化，将消化后的细胞在搅拌瓶中进行初次放大培养，按新旧微载体数3:1的比例加入新的微载体，同时加入细胞培养液使微载体浓度为3g/L；以每隔42min搅拌3min的方式间歇搅拌5h后，以45r/min进行连续搅拌；

所述细胞消化液为28℃的0.01％EDTA-0.25％的胰蛋白酶液。进行细胞消化时，以50r/min的搅拌速度消化细胞，待70％以上的细胞脱落时，以含10％PBS的L15培养基终止消化。

4)CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养：

当上步细胞生长至平台期时，静置沉降微载体，去除上清液，用PBS洗涤，加入细胞消化液进行细胞消化，将消化后的细胞移至生物反应器中进行二次放大培养，按新旧微载体数 3:1的比例加入新的微载体，同时加入细胞培养液使微载体浓度为3g/L；以每隔42min搅拌 3min的方式间歇搅拌5h后，以55r/min进行连续搅拌；CPB细胞在生物反应器中培养时， pH为7.0，温度为28℃，DO为50％

所述细胞消化液为28℃的0.01％EDTA-0.25％的胰蛋白酶液。进行细胞消化时，以50r/min 的搅拌速度消化细胞，待70％以上的细胞脱落时，以含10％PBS的L15培养基终止消化。

5)鳜传染性脾肾坏死病毒或鳜弹状病毒制苗液的制备：

鳜传染性脾肾坏死病毒制苗液的制备：CPB细胞二次放大培养后的第72h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液(L15培养基)洗涤，洗涤后以感染复数MOI为5加入鳜传染性脾肾坏死病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体积为终体积的一半，以40r/min 每12min搅拌3min，持续进行2h后，补加剩余含血清的孵育液至终体积，终体积中血清浓度为5％，接毒后第120h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液；

鳜弹状病毒制苗液的制备：CPB二次放大培养后的第96h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液(L15培养基)洗涤，吸出孵育液，以感染复数MOI为0.1加入鳜弹状病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体积为终体积的一半，以40r/min每12min搅拌3min，持续进行2h后，补加含血清的孵育液至终体积；终体积中血清浓度为5％，接毒后第36h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液。

上述过程中，所有细胞培养的温度均为28℃。

实施例3：对比研究

在本发明研究过程中，发明人还设计了大量的对比实验，其制备ISKNV和SCRV效果均不及本发明方法。

一、培养初期间歇搅拌方式对细胞在微载体上的贴壁率和分布的影响

方法：以每个微载体上30个细胞(30cells/球)的活细胞初始密度接种细胞，微载体浓度3g/L，培养液体积为50mL，于28℃生化培养箱中培养，在培养初期通过低速磁力搅拌器以不同的间歇搅拌方式(见表1)培养细胞，间歇搅拌时间结束后立刻取样，用结晶紫染色法计数细胞，计算细胞培养初期不同搅拌方式下的细胞贴壁率，综合空载率(微载体上细胞数低于5个的微载体数占总的微载体数的百分比)和贴壁率等因素选出最佳培养初期搅拌方式。贴壁率计算公式为：贴壁率＝(培养初期结束时细胞数/接种活细胞数)×100％。

结果：检测结果如图1和2所示，从中可以看出A、D和G组间歇搅拌时间2h，虽采用不同搅拌时间/静置时间，但贴壁率仅在60％左右，明显低于其它组，较多细胞未能贴附在微载体上而悬浮在培养液中，或贴附不稳而脱落。分别比较A、B、C组、D、E、F组和G、 H、I组，发现提高间歇搅拌时间能有效提高贴壁率，5h和8h间歇搅拌时间下贴壁率相差不大。H、I组(3min/57min间歇搅拌)的细胞贴壁率虽然维持在80％以上，但微载体的空载率超过10％，细胞分布不均匀(图2A)。E组(3min/42min/5h间歇搅拌)贴壁率最大，达 88.2％，且细胞均匀分布于微载体上，空载率不到10％(图2B)。说明搅拌瓶和微载体初期培养CPB细胞时每隔42min以40r/min的转速搅拌3min，持续进行5h，细胞贴壁率最大，且分布均匀，微载体空载率不到10％。

表1不同培养初期搅拌方式

二、活细胞接种密度对CPB细胞增殖的影响

不同活细胞接种密度下各批次的细胞浓度见表2，细胞生长曲线见图3。活细胞接种密度为20cells/球时，细胞每天缓慢增殖，第5d也未达到平台期；当活细胞接种密度为40cells/ 球时，细胞分布不均匀，有聚团现象，而把活细胞密度提高到50cells/球，细胞聚团现象更加突出，并在第3d达到最大细胞浓度后出现细胞脱落；而以活细胞接种密度为30cells/球接种细胞，细胞分布相对均匀，少有聚团现象，微球的空载率低于5％，最大细胞浓度高达2.3× 10⁶个/mL，可见本发明的30cells/球为最佳活细胞接种密度。

表2各活细胞接种密度下不同批次细胞浓度(×10⁵个/mL)

三、微载体浓度对CPB细胞增殖的影响

分别以2g/L、3g/L、4g/L和5g/L的微载体浓度进行细胞微载体悬浮培养，四组实验细胞的增殖情况如图4和表3所示，四组实验细胞在第3d开始进入平台期，2g/L、3g/L、4g/L和5g/L下细胞最大密度分别达1.52×10⁶个/mL、2.26×10⁶个/mL、2.67×10⁶个/mL和2.87×10⁶个/mL，最大细胞浓度随微载体浓度而增大。表3比较了四个实验组的细胞扩增倍数和指数期比生长速率，如表所示，随着微载体浓度的增大，细胞扩增倍数减小，细胞指数期比生长速率下降。4g/L和5g/L组细胞在第3d达到最大浓度后开始缓慢下降，且观察到微载体上细胞有收缩现象，悬浮液中有脱落的细胞和碎片。为了得到高毒价的病毒，必须在细胞状态良好的情况前提下得到最大细胞浓度，可见本发明的微载体浓度3g/L为最佳微载体浓度。

表3各微载体浓度下的细胞扩增倍数和比生长速率

^a)细胞扩增倍数α＝最高细胞密度/接种时活细胞密度

^b)指数期每天的细胞比生长速率μ_n的平均值作为指数期比生长速率μ。μ_n＝(LnX_n-LnX_n-1)>n-t_n-1)，式中X为细胞浓度，t为培养时间，n和n-1为取样记数时间点。

四、新旧微载体数放大比例对CPB细胞增殖的影响

细胞在微载体上长满单层后，分别按照新旧微载体数为2：1、3：1、4：1和5：1的比例进行放大，并保持微载体浓度为3g/L，检测新旧微载体数放大比例对CPB细胞增殖的影响。

检测结果如图5所示，各组细胞在第1d均出现数量下降。2:1和3：1下，细胞在第4d达到生长稳定期，最大细胞浓度分别为2.27×10⁶个/mL和2.24×10⁶个/mL；4：1和5：1下，细胞度过了较长的生长潜伏期，细胞比生长速率低，第6d依旧在缓慢增殖。3：1的放大比例下，细胞状态良好，且培养体积大于2：1下的培养体积，能获得更多的细胞，故3：1的新旧微载体放大比例进行放大是最经济的选择。

五、不同培养体系中搅拌速度对CPB细胞增殖的影响

CPB细胞在初期培养、初次放大、二次放大这三种不同培养体系中搅拌瓶分别以不同搅拌转速培养细胞，检测不同搅拌转速对细胞增殖的影响，其中初期培养搅拌瓶中分别以30、 40和50r/min搅拌速度搅拌，初次放大培养体系中搅拌瓶中分别以30、45和60r/min搅拌速度搅拌，二初次放大培养体系中生物反应器分别以40、55和70r/min搅拌速度连续搅拌。

结果如图6～8所示，从中可以看出初期培养、初次放大、二次放大培养中搅拌转速分别为40r/min、45r/min和55r/min时，细胞平台期浓度最大。

六、病毒接毒时间对病毒效价的影响

CPB细胞二次放大培养后，分别于48h、72h和96h进行接毒，检测病毒接毒时间对病毒效价的影响。

检测结果如图9～10所示，细胞二次放大培养后第1d，细胞数出现明显下降，第3d开始进入对数生长期。当ISKNV在第72h接种时，病毒滴度明显较高，在接毒后第5d达到最大滴度8.12LgTCID₅₀/mL，而SCRV的最佳接种时间为第96h，在接毒后第36h达到最大滴度9.83LgTCID₅₀/mL。说明以MOI为1在72h接种ISKNV时，病毒可获得最大滴度；以>

七、病毒感染复数和收毒时间对病毒效价的影响

CPB细胞二次放大培养后，在72h分别以MOI为0.1、1、5和10的ISKNV感染细胞，在96h分别以MOI为0.001、0.01、0.1和1的SCRV感染细胞，检测病毒感染复数和收毒时间对病毒效价的影响。

检测结果如图11～12所示，结果显示ISKNV病毒的MOI为5感染细胞时，病毒于第5d达到最大滴度8.34LgTCID₅₀/mL。SCRV病毒的MOI为0.1感染细胞时，病毒于第36h达到最大滴度10.25LgTCID₅₀/mL。

实施例4效果检测

下面对本发明方法的效果作进一步的检测。

一、微载体Cytodex1上CPB细胞的生长状态

在本研究所得最佳培养参数下，CPB在微载体上实现了良好生长，如图13所示，其显示了CPB细胞在微载体上的生长状况。CPB细胞接种在微载体Cytodex1上后，5h基本贴壁牢固，第1d细胞以纤维状均匀分布(图13B)，第2d微载体上接近一半面积被细胞粘附(图13C)，第3d细胞在微载体上长满单层(图13D)，另外微载体之间出现了“架桥”现象(图13E)，此时应及时进行细胞放大以免更多微载体出现架桥而导致细胞大量聚集，影响细胞正常生命活动。说明本发明方法实现了CPB细胞最佳的生长状态。

二、病毒感染微载体Cytodex1上CPB细胞的病变

将病毒接终至微载体上长满单层的CPB细胞后，病毒慢慢进入细胞内开始复制，消耗细胞内的相关蛋白、ATP以及其它所需营养物质，影响细胞正常生理活动，检测本发明方法中 ISKNV、SCRV感染CPB细胞后的状态。

检测结果如图14～15所示，从中可以看出，ISKNV感染CPB细胞的一般第1～2d，细胞观察不到明显变化，只有极少数细胞形态出现由纤维状慢慢聚拢变圆趋势，(图14A)，第3～4d部分细胞开始聚缩，出现肿大，部分细胞发生脱落(图14B)，第5d 90％以上细胞出现CPE(图14C)，细胞脱落现象加剧，直至几乎全部脱落(图14D)，培养液变得浑浊。

SCRV感染CPB后的第12h，少数细胞出现脱落(图15A)，第24h后可观察到细胞出现拉丝现象(图15B)，细胞脱落现象加剧，第48h后90％以上的细胞都从微载体上脱落(图15C)。

上述结果说明，本发明培养方法，在实现了CPB细胞最佳生长状态的基础上，也实现了 ISKNV、SCRV感染细胞能力以及在细胞内快速、高浓度地增殖，为制备ISKNV、SCRV病毒的疫苗溶液打下很好的基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。