基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用。

背景技术

慢性肾脏病(CKD)是由各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，包括肾脏病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或肾小球滤过率(GFR)下降(<60ml/min·1.73m2)超过3个月。肾脏纤维化是慢性肾脏病(CKD)进展为终末期肾病(ESKD)的关键病理改变，其特征为肾脏固有细胞受损、丢失，并出现大量胶原沉积和积聚。肾功能指标(如血清肌酐等)、尿蛋白定量以及肾穿刺活检是目前临床上最常用的慢性肾脏病及肾脏纤维化诊断方法。然而由于肾脏有较强的代偿能力，肾功能指标不能反映早期纤维化及其严重程度。尿蛋白检测受诸多因素影响，且主要反映肾小球损害，不能反映肾脏间质纤维化程度。而肾活检为创伤性检查，可引起出血等并发症，不宜用于早期筛查及长期监测。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。已有大量研究证明在慢性肾脏病发生发展过程中，肾脏固有细胞内众多mRNA表达水平改变。研究表明，VIM、BCL2、PODLX以及TGFB1基因在慢性肾脏病发生发展过程中起重要作用，检测相应mRNA水平对慢性肾脏病的分子病理分型及预后监测具有独特价值。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过Taqman探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性率低，特异性好。

发明目的

发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。该荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病相关发病基因的快速检测。

本发明还提供该基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO 4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 12-15所示。

其中，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。

所述PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNase inhibitor混合液。

所述MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl₂，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBR>

其中，所述VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ1。

进一步地，所述探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。

更进一步地，所述淬灭基团为BHQ 1非荧光淬灭基团。

本发明所述的基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒在分别检测基因VIM、BCL2、PODLX、TGFB1和B2M中的应用。

其中，所述检测基因时PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA 1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix 5ul。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度为0.6uM～1.5uM，探针浓度为0.3uM～1uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为200～3000U/ul,RNase inhibitor浓度为40～1200U/ul；MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl2，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBR>

所述检测基因时荧光定量PCR反应条件为：42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。

本发明根据NCBI上的VIM、BCL2、PODLX、TGFB1以及B2M(内参基因)基因全序列，并据此设计特异性引物和TaqMan探针，设计特点如下：1、引物的设计通过跨内含子设计引物的方式最大程度避免了基因组的干扰；2、引物和探针都和全转录组、全基因组进行细致比对，有效避免了非特异的结合；3、引物和探针结构都进行了小心的设计，避免互相之间的干扰；4、引物尽量覆盖目标基因的各种转录本，以达到最佳检测效果。最后采用荧光定量PCR快速技术检测基因表达。

有益效果：与现有技术相比，本发明荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于慢性肾脏病相关发病基因的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测慢性肾脏病相关基因的mRNA表达水平。

附图说明

图1是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测VIM、BCL2、PODLX及TGFB1四种mRNA在慢性肾脏病患者及健康人群尿液中的差异表达示意图；

图2是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测VIM溶解曲线图；

图3是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测BCL2溶解曲线图；

图4是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测PODLX溶解曲线图；

图5是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测TGFB1溶解曲线图；

图6是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测B2M溶解曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒，包括检测VIM基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测BCL2基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4-6所示；检测PODLX基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 7-9所示；检测TGFB1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 10-12所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO 12-15所示。序列SEQ ID NO 1-15如下表1所示：

表1引物序列和探针序列

试剂盒中还包括所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。

PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNase inhibitor混合液。

试剂盒中配置好上下游引物和探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度为0.6uM～1.5uM，探针浓度为0.3uM～1uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为200～3000U/ul,RNase inhibitor浓度为40～1200U/ul；MasterMix包含浓度为75mM～125mM的KCl，浓度为4mM～8mM的MgCl2，浓度为20mM～100mM、pH为7.9～8.3的Tris-HCl，浓度为0.2uM～0.8uM的dNTPs，浓度为0.02U～0.1U/ul的热启动Taq酶，0.125×到1×之间的SYBR>

PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA 1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix 5ul。

荧光定量PCR反应条件为：42℃ 5min；95℃ 10min；95℃ 20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。

实施例2

样本：选取2016年8月至2017年1月东南大学附属中大医院肾脏内科收治的80慢性肾脏病患者晨尿标本及相关临床资料为试验组。另随机选择来自东南大学附属中大医院35位健康体检者的尿液样本为对照组。

尿沉渣RNA提取：将留取的晨尿3000g离心30min得尿沉渣，参照TAKARA公司RNA提取操作流程提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280)。

配置PCR反应体系：RNA(浓度约100ug/ml)1ul；采用实施例1的试剂盒经行检测，每组基因上下游引物、探针混合液：3.5ul；PCR酶混合液：0.5ul；MasterMix:5ul；PCR扩增时VIM、BCL2、PODLX、TGFB1以及B2M(内参基因)分别通过各自的上下游引物和探针分别进行扩增。

按如下反应条件进行逆转录PCR扩增：

42℃ 5min完成反转录，95℃预变性 10min，95℃变性20s,60℃退火/延伸45s,变性和退火/延伸步骤循环45次，40℃冷却30s。

PCR扩增得到产物，收集荧光信号，检测Ct值。并对4个样本进行了重复性试验，结果如表2所示，经计算其平均变异系数为0.61％。以B2M为内参基因，按公式2^(Ct内参基因-Ct检测基因)，分别计算检测试验组和对照组的VIM、BCL2、PODLX及TGFB1四种mRNA相对表达水平，结果如图1所示。

表2试剂盒重复性验证

由图1结果表明试验组与正常对照组相比，CKD患者尿液中上述四种mRNA水平显著升高，同时表2的结果表明本发明实施例1的试剂盒重复性好。

为进一步测试试剂盒的敏感度，分别用试剂盒检测了5种mRNA VIM、BCL2、PODLX、TGFB1及B2M在total RNA为500ng、50ng及5ng/10ul反应体系中的CT值，并重复三次，结果如表3所示，VIM、BCL2、PODLX、TGFB1及B2M的溶解曲线如图2至图6所示。由上可知，实施例1的试剂盒可以检测在total RNA为5ng/10ul反应体系中检测到所述的5种mRNA，可满足临床检测的需要。

表3试剂盒敏感性测试

同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测慢性肾脏病相关基因的mRNA表达水平。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学 上海境象生物科技有限公司

<120> 基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其

应用

<130> 2017

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

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ctgcgaagaa ccttgtgtga 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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catggttcac acggcaggca tact 24