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一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB的等位基因及应用

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本发明公开了一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB的等位基因及应用。本发明提供了一种蛋白，为将琥珀酸脱氢酶B亚基的氨基酸序列第280位I突变为V，其他氨基酸残基保持不变，得到的蛋白。本发明在采集自辽宁省的多主棒孢菌种群中发现了一种新的未曾报道的等位基因突变，导致菌株对氟吡菌酰胺产生了较高水平的抗药性。该突变的发现，对于田间SDHIs抗药性的检测及后期的抗药性治理具有重要的指导意义。

著录项

公开/公告号CN107384884A

专利类型发明专利
公开/公告日2017-11-24

原文格式PDF
申请/专利权人中国农业科学院蔬菜花卉研究所;
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申请/专利号CN201710739490.0
发明设计人李宝聚;朱发娣;石延霞;谢学文;柴阿丽;
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申请日2017-08-22
分类号
代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人关畅
地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号
入库时间 2023-06-19 03:47:06

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2020-01-31

授权

授权
2017-12-22

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/02 申请日:20170822

实质审查的生效
2017-11-24

公开

公开

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB的等位基因及应用。

背景技术

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola(Berk.&M.A.Curtis)C.T.Wei)引起的叶斑病是一种世界性病害。该菌分布于全球共95个国家和地区，可侵染530多种植物，包括经济作物如大豆，棉花和橡胶等，蔬菜作物如黄瓜，番茄和豇豆等以及其他植物。自2005年至今，本课题组已陆续在我国辽宁，河北，内蒙古自治区，黑龙江，山东，山西，河南，甘肃，天津，北京，湖南，湖北，广东，广西，重庆，四川，云南，海南，浙江，福建和新疆21个省市均发现了由多主棒孢菌侵染引起的病害，寄主主要为蔬菜和花卉，其中蔬菜包括黄瓜，番茄，茄子，苦瓜，菜豆，豇豆，辣椒，生菜，芸豆，甜瓜，西瓜，佛手瓜，紫背天葵等，花卉包括金叶女贞，口红吊兰，天堂鸟，棣棠花，一串红等。近年来，我国黄瓜生产上由该菌引起的黄瓜棒孢叶斑病已由一种次要病害上升为一种与黄瓜霜霉病危害相当的主要病害。田间发病严重时减产可达60％-70％，已成为保护地黄瓜生产中亟待解决的叶部病害之一。

多主棒孢菌具高度变异的特性，因此使用抗性品种进行病害防控存在持效期短的问题。目前化学药剂是防治该病害最重要的手段。目前国内外已报道的对黄瓜棒孢叶斑病有效的化学药剂主要包括琥珀酸脱氢酶类抑制剂(Succinate dehydrogenaseinhibitors，SDHIs),苯醌外部抑制剂(Quinone outside inhibitors,QoIs),甾醇生物合成抑制剂(Sterol biosynthesis inhibitors,SBIs)等。其中最具有代表性的是SDHIs，包括啶酰菌胺，氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺。SDHIs的作用靶标是病原真菌线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)，即复合物Ⅱ或琥珀酸：泛醌氧化还原酶(succinate：ubiquinone oxidoreductase，SQR)。该类杀菌剂活性高且杀菌谱广，在全世界范围内被广泛用于农作物病害的防治。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，为将琥珀酸脱氢酶B亚基的氨基酸序列第280位I突变为V，其他氨基酸残基保持不变，得到的蛋白。

上述蛋白中，所述琥珀酸脱氢酶B亚基来自多主棒孢菌；

或所述琥珀酸脱氢酶B亚基为如下1)或2)：

1)序列4所示的氨基酸残基；

2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

上述蛋白的氨基酸序列为序列2。

编码上述蛋白的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组菌也是本发明保护的范围。

上述编码蛋白的DNA分子为将编码所述琥珀酸脱氢酶B亚基的DNA分子的核苷酸序列第1020位A突变为G，其他核苷酸保持不变，得到的DNA分子。

上述编码蛋白的DNA分子的核苷酸序列为序列1。

上述的蛋白或上述的DNA分子或表达盒、重组载体或重组菌在提高多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种培育对氟吡菌酰胺抗性高的多主棒孢菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将对氟吡菌酰胺抗性敏感的多主棒孢菌中的琥珀酸脱氢酶B亚基编码基因替换为上述的蛋白的编码基因，得到目的多主棒孢菌；

所述目的多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性高于对氟吡菌酰胺抗性敏感的多主棒孢菌。

上述方法中，所述将对氟吡菌酰胺敏感的多主棒孢菌中的琥珀酸脱氢酶B亚基编码基因替换为上述的蛋白的编码基因为将序列7所示的DNA片段导入所述对氟吡菌酰胺敏感的多主棒孢菌中实现的。

本发明的实验证明，在采集自辽宁省的多主棒孢菌种群中发现了一种新的未曾报道的等位基因突变，导致菌株对氟吡菌酰胺产生了较高水平的抗药性。该突变的发现，对于田间SDHIs抗药性的检测及后期的抗药性治理具有重要的指导意义。

附图说明

图1为多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的敏感性测定结果。

图2为sdhB G1020目的载体片段扩增结果。

图3为sdhB同源替换突变株的PCR验证结果。

图4为sdhB同源替换突变株的Southern blot验证结果。

图5为亲本菌株(HG14102524-4)、田间抗性菌株及替换突变株(V2和V16)对氟吡菌酰胺的敏感性测定结果。

图6氟吡菌酰胺对多主棒孢菌田间株及SdhB-V280替换突变株的离体防效测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、突变位点的获得

一、多主棒孢菌田间菌株对氟吡菌酰胺的敏感性水平测定

供试菌株：1株敏感菌株HG14102524-4(未使用过任何琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的田间多主棒孢菌菌株)；2株疑似抗性菌株HG15050729-5和HG15050825-6。其中HG14102524-4采集自河北省，其他菌株采集自辽宁省，均经单孢分离纯化。

供试药剂：氟吡菌酰胺原药(纯度：96％)，沈阳化工研究院友情提供。

供试培养基：酵母蛋白胨醋酸盐培养基(YBA)：酵母粉10g，蛋白胨10g，醋酸钠20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L；

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L，以上培养基均于121℃湿热灭菌30min后备用。

1、药液配制：将氟吡菌酰胺用丙酮配成2.5×10⁴μg/mL的母液，然后依次用丙酮稀释成500μg/mL、1000μg/mL、5000μg/mL、10000μg/mL梯度浓度药液。

2、含药平板的制备：按由低到高的顺序，用移液枪吸取各浓度药液加入融化后冷却至55℃的PDA或者YBA培养基中，混匀，倒入直径为5.5cm的一次性培养皿中，以只加丙酮的处理为空白对照，各处理溶剂含量均为1‰，每个浓度准备3个平板，作为3次重复。平板含药浓度为：0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL。

3、接菌：自保存于4℃的菌种试管斜面上活化供试菌株，PDA平板上26℃下黑暗培养5天，自菌落边缘挑取菌丝块进行扩繁，PDA平板上26℃下黑暗培养7天后，采用打孔器自菌落边缘处打取直径为5mm的菌饼，采用灭菌牙签将菌饼菌丝面朝下接种于步骤2)中制备的含药及对照平板中，26℃下黑暗培养5d。

4、测量：十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径计算各个浓度对供试多主棒孢菌的菌丝生长抑制率。然后运用SAS 9.4probit分析计算各菌株的EC₅₀值及其置信区间。

结果如表1和图1所示，两种培养基上氟吡菌酰胺对敏感菌株HG14102524-4均具有非常好的抑制作用，EC₅₀较低，而HG15050729-5和HG15050825-6则对氟吡菌酰表现出了中等偏上水平的抗性，其EC₅₀均大于20μg/mL。表明在PDA和YBA两种培养基上，与敏感菌株相比，HG15050729-5和HG15050825-6对氟吡菌酰胺产生了抗药性，HG14102524为敏感菌株。

表1为两种培养基上多主棒孢菌对氟吡菌酰胺的敏感性测定结果

二、多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB突变及其对应蛋白氨基酸突变位点的发现

1、模板：采用CTAB法提取供试菌株HG14102524-4、HG15050729-5和HG15050825-6的基因组DNA，作为模板。

2、PCR扩增琥珀酸脱氢酶sdhB/C/D全长序列，所用引物见表2。

表2 SdhB/C/D全长序列PCR扩增用引物对

反应体系：50μL反应体系中包括2μL模板DNA(30-50ng)，每条引物(10μM)2μL，25μL2×Taq Mix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，19μL ddH₂O。

反应程序为：预变性94℃5min；94℃45s，58℃45s，72℃1min 30s，35个循环；最后72℃延伸5min。

将PCR产物送北京博迈德生物科技有限公司进行测序，测序引物见表2。

结果以基因组DNA为模板，多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB全序列共1106bp，存在3段内含子序列，共编码307个氨基酸。

本研究中的所有抗性菌株HG15050729-5和HG15050825-6，与敏感菌株HG14102524-4相比，多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB核苷酸序列在第1020位发生腺嘌呤到胞嘧啶(sdhB 1020：A→G)的突变，对应，多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基氨基酸序列第280位异亮氨酸到缬氨酸(SdhB 280：I→V)的突变；而其sdhC/D核苷酸序列与敏感菌株相同，不存在任何突变。多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶的sdhC序列，其核苷酸序列为序列5，全长629bp，具一段内含子，编码177个氨基酸。多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶的sdhD序列，其核苷酸序列为序列6，全长868bp，具2段内含子，编码165个氨基酸。

上述抗性菌株HG15050729-5和HG15050825-6中的琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB核苷酸序列为序列1，其编码的蛋白琥珀酸脱氢酶B亚基的氨基酸序列为序列2，抗性菌株中的琥珀酸脱氢酶B亚基记作多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基突变体，命名为SdhB-V280。

上述敏感菌株HG14102524-4中的琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB核苷酸序列为序列3，其编码的蛋白琥珀酸脱氢酶B亚基的氨基酸序列为序列4，敏感菌株中的琥珀酸脱氢酶B亚基记作多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基，命名为SdhB-I280。

序列1为将序列3第1020位A突变为G，其他核苷酸不变得到的序列；

序列2为将序列4第280位I突变为V，其他氨基酸不变得到的序列。

实施例2、SdhB-V280在使多主棒孢菌抗氟吡菌酰胺中的验证

(一)、材料和试剂

供试菌株：多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)，编号为：HG15050729-5(SdhB-V280)，HG14102524-4(SdhB-I280)。

下面实施例中，DNA提取采用CTAB法。

试剂：2×CTAB提取液(Coolaber Science&Technology)，氯仿：异戊醇(24:1)(Coolaber Science&Technology)，无水乙醇(北京化工厂)，ddH₂O

仪器：Christ ALPHA 1-4 LSC冷冻干燥机(Martin Christ,德国)，移液器(Eppendorf，德国)，HQ-60型旋涡混合器(北方同正，北京)，XMTD-700水浴锅(汉康电子，江苏)，3K15型高速离心机(Sigma，德国)，Spectrophotometers分光光度计(NanoDrop公司，美国)

下面实施例中，PCR扩增

试剂：Xerox DNA聚合酶(北京博迈德生物技术有限公司)，TaKaRa LA Taq聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)，ddH2O

仪器：制冰机(北京天林恒泰科技有限公司)，AerisTM梯度型PCR扩增仪(ESCO,新加坡)，移液器(Eppendorf，德国)，枪头

下面实施例中，凝胶电泳检测

试剂：琼脂糖(Coolaber Science&Technology)，Goldview核酸染料(北京博迈德生物技术有限公司)，Loading Buffer(北京博迈德生物技术有限公司)，DM5000DNA Marker(北京博迈德生物技术有限公司)，D15000(北京天根生物科技有限公司)，TAE缓冲液(干粉)(Coolaber Science&Technology)。

仪器：DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器)，Jel Doc 2001型凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)，微波炉(格兰仕)

下面实施例中，PEG介导的原生质体转化及替换突变株的验证

供试试剂：植物基因组DNA提取试剂盒(天根)，Xerox DNA聚合酶(北京博迈德)，LATaq DNA聚合酶(Takara)，凝胶回收试剂盒(Sigma)，pKHT质粒，由南京农业大学陈长军教授友情提供；限制性内切酶EcoR V(NEB)，λ-EcoT14I digest marker(TaKaRa)，地高辛DNA标记和检测试剂盒I(Roche)NaCl(西陇化工股份有限公司)，崩溃酶(Sigma)，蜗牛酶(Coolaber)，山梨醇(Coolaber)，Tris(Coolaber),CaCl₂(国药集团化学试剂有限公司)，PEG6000(Coolaber)，肝素钠(Coolaber)，蔗糖(sigma-aldrich)，酵母粉(Oxoid)，酶水解酪蛋白(Coolaber)，琼脂粉((Coolaber)，琼脂糖(Coolaber)，葡萄糖(Coolaber)，蛋白胨(Coolaber)，潮霉素(Coolaber)等。

供试培养基：YEPD(20g葡萄糖，10g蛋白胨，3g酵母粉，1L)，RM培养基(239.6g蔗糖(0.7M)，0.5g酵母粉，0.5g酶水解酪蛋白，16g琼脂粉，1L)，SRM培养基(342.3g蔗糖(1M)，0.5g酵母粉，0.5g酶水解酪蛋白，12g琼脂糖，1L)，121℃高温高压灭菌30min。

溶液的配置：缓冲液(NaCl 40.95g(0.7M)，1L)；STC溶液(山梨醇145.74g，Tris6.06g，CaCl₂>

供试仪器：DTY-900型超净工作台(北京德天佑科技发展有限公司)，SA-300V型高压湿热灭菌器(Sturdy Industry)，XMTD-700水浴锅(汉康电子，江苏)，3K15型高速离心机(Sigma，德国)，DYY-6C型电泳仪(六一仪器，北京)，Jel Doc 2001型凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)，HQ-60型旋涡混合器(北方同正，北京)，移液枪(Eppendorf，德国)，S1000Thermal Cycle PCR仪(BIO-RAD，美国)，平板摇床，杂交炉，制冰机等。

(二)、SdhB-V280在使多主棒孢菌抗氟吡菌酰胺中的验证

采用引物对B-UP+T-F/R从供试多主棒孢菌株HG15050729-5的基因组中扩增上臂+SdhB基因全长；采用B-DOWN-F/R从HG14102524-4基因组扩增SdhB基因下臂(所有的引物见表3)；采用Hyg-F1/Hyg-R1自pKHT质粒模板扩增hyg标记基因；

对上述三种片段进行割胶回收。然后采用融合PCR法对三种片段(上臂+SdhB，hyg标记基因和下臂)按摩尔比1:3:1进行融合，得到融合产物。

取融合PCR产物4倍稀释液作为DNA模板，采用引物对B-UHD-F/B-UHD-R扩增线性载体DNA片段。对PCR产物割胶回收纯化，经测序验证后，作为目标载体进行后续转化试验。

表3.载体构建用引物信息

一、用于同源重组的片段的获得

1、单片段的PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板，采用表3中的引物对B-UP+T-F/R，B-DOWN-F/R,PCR扩增sdhB上臂+靶标和sdhB下臂；以pKHT质粒为模板，采用表3中的引物对Hyg-F1/Hyg-R1扩增hyg标记基因。反应体系为50μL，具体为：上游引物2μl，下游引物2μl，模板DNA 2μl，dNTP 4μl，PCR buffer 10μl，Xerox DNA聚合酶0.5μl，ddH₂O补足至50μl。PCR反应程序为：98℃1min，(98℃10s，64.3℃10s，72℃10-30s/kb；35个循环)，72℃5min。对于上述3个片段，均扩增5个50μL体系并进行割胶回收。

2、用于同源重组的片段的扩增

融合PCR：将上述扩增及割胶回收的三种片段(上臂+靶标基因和，hyg基因和下臂片段)按摩尔比1:3:1混合作为模板，进行融合PCR。反应体系总体积为25μl，DNA模板量不超过1000ng，dNTP 2μl,PCR buffer 2.5μl,LA Taq聚合酶0.25μl,ddH₂O补足至25μl。融合PCR反应程序为：94℃5min,(94℃45s,68℃45s(每循环降低1℃),72℃5min>

巢式PCR：将上述融合PCR产物进行4倍稀释，取稀释产物作为DNA模板，采用引物对B-UHD-F/R扩增5002bp的DNA载体片段。PCR反应体系为：B-UHD-F 2μl，B-UHD-R 2μl，融合PCR产物4μl，dNTP 4μl,PCR buffer10μl,Xerox DNA聚合酶0.5μl,ddH2O补足至50μl，PCR反应程序为：98℃1min,(98℃10s,50-70℃10s,72℃5min，35个循环),72℃5min。

电泳检测PCR产物，电泳结果如图2所示，M：DL15000；A:sdhB上臂+靶标(2352bp)；B:标记hyg(1755bp)；C:sdhB下臂(1462bp)；D:目的载体片段(5002bp)，以HG15050729-5基因组DNA为模板，采用表3中的引物对B-UP+T-F/R扩增了2352bp大小的上臂片段；以HG14102524-4基因组DNA为模板，引物对B-DOWN-F/R PCR扩增得到了1462bp的目的片段；以pKHT质粒为模板，采用引物对Hyg-F1/R1扩增得到大小为1755bp的hyg标记基因。以上述三种片段融合产物的5倍稀释液为模板，采用引物对B-UHD-F/R进行巢式PCR扩增，得到了5002bp的目标载体片段。

经过测序，该巢式PCR产物即为用于同源重组的片段，其包括SdhB基因上游同源臂、hyg标记基因和SdhB基因下游同源臂，该巢式PCR产物的核苷酸序列为序列7，其中序列7第1-2152位为SdhB基因上游同源臂、序列7第2153-3907位为hyg标记基因、序列7第3908-5002位为SdhB基因下游同源臂。

对每5个50μl体系，割胶回收纯化至一个收集管中，测序验证正确后，用于后续同源转化试验，命名为纯化的DNA载体片段。

二、多主棒孢SdhB-V280替换突变株的获得

1、PEG介导的同源转化获得多主棒孢SdhB-V280替换突变株

菌丝体的收集：往活化的多主棒孢菌HG14102524-4(敏感：SdhB-I280，CGMCCNo.14543)平板上加2mL无菌水，轻轻洗下孢子，吸取200μL转入装有40mLYEPD液体培养基的三角瓶(100mL)中，28℃下摇培72h。三层灭菌擦镜纸过滤，并采用缓冲液冲洗三次得菌丝球(直径1-3mm)。

裂解：配制10mg/mL DriselaseTMBasidiomycetes sp.(SIGMA-ALDRICH,≥100units/G solid，货号：85186-71-6)+20mg/mL蜗牛酶液(Coolaber,货号：CS9801-5G)，将上述菌丝球分装在含40mL酶液的三角瓶(100mL)中，置于80rpm，30℃摇床中裂解4h。

原生质体的收集：三层灭菌擦镜纸过滤裂解液，得原生质体悬浮液，分装于50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，采用0.7M NaCl缓冲液15mL重悬浮原生质体，1000rpm离心5min，弃上清，采用15mL STC溶液再次重悬浮原生质体，1000rpm离心5min，弃上清，得制备好的原生质体沉淀，采用STC溶液进行重悬浮，调节其浓度在2-3×10⁸个/mL，并按照STC：SPTC＝4:1的比例加入SPTC溶液，置于冰上备用。

转化：取上述制备好的原生质体重悬浮液1mL于转化管中，加入40μL回收已得到的100ng/μL纯化的DNA载体片段和10μL肝素钠，轻轻混匀，冰浴60min；往转化体系中加入1mLSPTC溶液，轻轻摇匀，25℃下放置30min；往转化管中加入50mL冷却至55℃的RM再生培养基中，摇匀倒平板，25℃培养12h后覆盖含100mg/mL的潮霉素的SRM培养基，25℃下培养5-10d，得到长有单菌落的平板。

2、SdhB-V280替换突变株的验证

1)PCR验证

挑取覆盖板上的单菌落于含80μg/mL潮霉素的PDA平板上，26℃下培养2d后在含潮霉素PDA平板上再转接6代，能够正常生长的替换突变株可能是目的替换突变株，用于进行下一步PCR验证。替换突变株DNA的提取：CTAB法。PCR验证：引物见表4。

表4 PCR检测验证替换突变株所用的引物

PCR扩增体系(10μL)如下：引物1 0.4μL，引物2 0.4μL，模板DNA 0.4μL，2.5mMdNTP 0.8μL，5×PCR buffer 2μL，Xerox DNA聚合酶0.1μL，ddH2O 5.9μL。

扩增程序为：94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃1min/kb，30个循环)，72℃5min。对反应后的产物进行凝胶电泳分析验证。

第6代替换突变株在含潮霉素80μg/mL的PDA培养基中生长较好，提取基因组DNA为模板，在sdhB基因与下臂结合处设引物Det-B-TD-2F/2R，在sdhB基因上臂及下臂处设引物Det-B-UT-2F/2R，验证sdhB-Hyg是否替换完全，如图3(A和B)所示，2对引物在亲本菌株中能够分别扩增出952bp，2019bp的片段；异源重组替换突变株则会出现2条带，分别为952bp和2707bp，2019bp和3774bp的片段；而在同源重组替换突变株中，则分别显示出2707bp，3774bp的单条带。将验证正确的替换突变株进一步在sdhB上臂上游及下臂下游设引物Det-B-UP-3F/3R，Det-B-DOWN-2F/2R检验载体是否插入正确的位置，如图3(C和D)所示，同源重组替换突变株分别能扩增出3815bp、3093bp的单条带。

上述图3中，替换突变株纯合度检测：A(DetB-UT-2F/2R)与B(DetB-TD-2F/2R)，对于纯合替换突变株，分别形成3783bp和2715bp的条带，对于杂合子，则分别可形成3783bp、2028bp和2715bp、950bp的条带。上下游连接情况检测：C(DetB-UP-3F/3R)和D(Det-DOWN-2F/2R)，对于连接正确的替换突变株，分别产生3815bp和3093bp大小的片段，对于连接错误的替换突变株，不产生条带；A,B,C和D的上样顺序相同，依次为：Marker(100-5000bp，博迈德)、1为亲本菌株HG14102524-4、2为杂合替换突变株V14、3-6分别依次为纯合替换突变株V2、V4、V16、V17-2。

2、Southern杂交验证

以HG14102524-4基因组DNA为模板，以Probe-F(5’-TTGAGATGGCTGTGGATATG-3’)/Probe-R(5’-AGATGTGGAAGGTCTTGGT-3’)为引物，用Vazyme lamp master Mix扩增SdhB上臂及部分SdhB片段(大小为858bp),扩增体系为：Vazyme lamp master Mix 25μL，B-Probe-F2μL，B-Probe-R 2μL，模板2μL，ddH2O 19μL，共50μL，扩增两管进行割胶回收。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，72℃延伸5min，采用Omega凝胶回收试剂盒，按照其说明书进行探针片段的纯化，获得探针模板。基因组DNA酶切所用限制性内切酶为EcoR V。。

传统的Southern杂交证明，该两种类型突变体为单拷贝置换。在SdhB基因上设计了858bp的片段作为杂交的探针。采用了Roche公司的地高辛DNA标记与检测试剂盒I，用限制性内切酶EcoR V酶切亲本菌株及转化子的基因组DNA。从Southern杂交图中可以看出，在亲本菌株中可杂出一条3308bp的印迹，转化子均可杂出一条5063bp的印迹，表明为单拷贝置换。如图4，M：λ-EcoT14I digest marker；WT：亲本敏感菌株；V2和V16为SdhB-V280替换突变株。

上述结果表明，替换突变株V2和V16均为将多主棒孢菌HG14102524-4基因组中的SdhB-I280编码基因替换为SdhB-V280编码基因，得到的菌株，命名为多主棒孢菌SdhB-V280替换突变株。

三、多主棒孢SdhB-V280替换突变株对氟吡菌酰胺的敏感性测定

供试菌株：亲本菌株HG14102524-4(SdhB-I280)；2株SdhB-V280替换突变株：V2，V16。均为单孢分离菌株。

检测方法同实施例1，敏感性测定结果如表5和图5所示，携带SdhB-V280的替换突变株获得了氟吡菌酰胺抗性，与田间菌株HG15050825-6和HG15050729-5抗性水平相近。

表5多主棒孢菌SdhB-V280替换突变株对氟吡菌酰胺的敏感性测定结果

四、氟吡菌酰胺对多主棒孢菌SdhB-V280替换突变株的离体防效测定

供试菌株：亲本菌株HG14102524-4(SdhB-I280)；2株SdhB-V280替换突变株：V2，V16；2株田间抗性菌株：HG15050729-5和HG15050825-6，上述所有菌株均为单孢分离株。

供试药剂：氟吡菌酰胺原药(96％)

试验方法

1、供试菌株的准备：

自保存于4℃的试管斜面上活化供试菌株，PDA平板上培养3天后，挑取菌落边沿菌丝进行扩繁培养，26℃下黑暗培养7天。备用。

2、药剂的配制与喷施：

取2.672mL浓度为25,000μg/mL的氟吡菌酰胺母液，加入一定量的吐温20，混匀后，加无菌蒸馏水至200mL，以加等量吐温20的200mL无菌蒸馏水作为清水对照。分别喷施至两叶一心的黄瓜植株上，至叶片表面形成径流。

3、贴菌片测试：

待黄瓜叶片表面药液干后，采集各处理叶片进行试验。采用打孔器(5mm)自备用平板上打取菌碟，菌丝面朝下贴于叶片正面。26℃下黑暗保湿培养5天，采用十字交叉法测量病斑直径(mm)。

氟吡菌酰胺对多主棒孢SdhB-V280替换突变株的离体防效测定结果如表6和图6所示，表明，所有供试菌株对黄瓜叶片均具有致病性，可以看出氟吡菌酰胺对田间抗性株(HG15050729-5和HG15050825-6)及SdhB-V280替换突变株(V2和V16)与敏感菌株(HG14102524-4)相比，其防效有所下降。334μg/mL的氟吡菌酰胺对亲本敏感菌株的防效为100％，但是对供试田间抗性菌株及室内通过同源置换获得的SdhB-V280替换突变株的防效均低于50％。表明SdhB-V280突变可引起氟吡菌酰胺的抗性发生。

表6氟吡菌酰胺对多主棒孢菌田间及室内SdhB-V280替换突变株的离体防效测定结果

上述结果表明，SdhB-V280蛋白可用于提高多主棒孢菌对氟吡菌酰胺抗性。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一种多主棒孢菌琥珀酸脱氢酶B亚基基因sdhB的等位基因及应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1106

<212> DNA

<213> 多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)

<400> 1

atggcttgca cacgcgcttt cgctcgtctg gctacgacgc ggaccggtac gtgaacccct 60

ctacgtgcac tacacaccca ttggagctct actgacagct ctccccgcag ccgtacggcc 120

cgctgccgtc ttcacgcgcg gttttgcctc cgtgaccgac acggccgccc gcgagcccgt 180

ctccaaggtg gccgagaaga tcgtgcccga cccggcccgc aaggtggttc ccgagagtca 240

gaccagcact gtcaaggacc cccagccgga caaggacgcg aagaccaaga ccttccacat 300

ctaccgctgg aacccggacg agcccacgtc gaagccaaag atgcagacgt acacgctgga 360

cctgaacaag accggcccca tgatgttgga tgcgctgatc cgcatcaaga acgagctcga 420

cccgaccttg acctttaggc gaagttgccg tgagggaatt tgtggaagct gcgcaatgaa 480

cattgacggc gtgaacacgc tggcctgtct ttgtacgtgg aaccgcagtc tccacgaatg 540

cggaattggg tggctaacga gtgcgcaaca ggccgcatcc ccaccgatac caccaaggaa 600

tcgcgcattt accctctccc tcacatgtac attgtcaagg acttggtccc cgacatgacg 660

ctcttctaca agcagtaccg ctccgtgaag ccctacctcc agcgcgacac tcctgctcct 720

gacgtaagaa caccgcacac ctcaccatag cctcgaactc gccactaacg attgctctct 780

agggccgtga ataccgccag tccaaggagg agcgcaagaa gctcgacggc ctgtacgagt 840

gcattctgtg cgcctgctgc tcaacgtcct gcccgtcgta ctggtggaac caggaggagt 900

acctcggccc tgccgtgctg ctccagtcgt accgctggat cgccgattcg cgtgacgaga 960

agacggcaca acgccaggat gccctcaaca actcgatgag catgtaccgc tgccacacgg 1020

ttctcaactg ctcgaggacg tgccccaagg gcttgaaccc ggctctggcc attgccgaaa 1080

tcaagaagag catggctttc acgtag 1106

<210> 2

<211> 307

<212> PRT

<213>多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)

<400> 2

Met Ala Cys Thr Arg Ala Phe Ala Arg Leu Ala Thr Thr Arg Thr Ala

1 5 1015

Val Arg Pro Ala Ala Val Phe Thr Arg Gly Phe Ala Ser Val Thr Asp

202530

Thr Ala Ala Arg Glu Pro Val Ser Lys Val Ala Glu Lys Ile Val Pro

354045

Asp Pro Ala Arg Lys Val Val Pro Glu Ser Gln Thr Ser Thr Val Lys

505560

Asp Pro Gln Pro Asp Lys Asp Ala Lys Thr Lys Thr Phe His Ile Tyr

65707580

Arg Trp Asn Pro Asp Glu Pro Thr Ser Lys Pro Lys Met Gln Thr Tyr

859095

Thr Leu Asp Leu Asn Lys Thr Gly Pro Met Met Leu Asp Ala Leu Ile

100 105 110

Arg Ile Lys Asn Glu Leu Asp Pro Thr Leu Thr Phe Arg Arg Ser Cys

115 120 125

Arg Glu Gly Ile Cys Gly Ser Cys Ala Met Asn Ile Asp Gly Val Asn

130 135 140

Thr Leu Ala Cys Leu Cys Arg Ile Pro Thr Asp Thr Thr Lys Glu Ser

145 150 155 160

Arg Ile Tyr Pro Leu Pro His Met Tyr Ile Val Lys Asp Leu Val Pro

165 170 175

Asp Met Thr Leu Phe Tyr Lys Gln Tyr Arg Ser Val Lys Pro Tyr Leu

180 185 190

Gln Arg Asp Thr Pro Ala Pro Asp Gly Arg Glu Tyr Arg Gln Ser Lys

195 200 205

Glu Glu Arg Lys Lys Leu Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ile Leu Cys Ala

210 215 220

Cys Cys Ser Thr Ser Cys Pro Ser Tyr Trp Trp Asn Gln Glu Glu Tyr

225 230 235 240

Leu Gly Pro Ala Val Leu Leu Gln Ser Tyr Arg Trp Ile Ala Asp Ser

245 250 255

Arg Asp Glu Lys Thr Ala Gln Arg Gln Asp Ala Leu Asn Asn Ser Met

260 265 270

Ser Met Tyr Arg Cys His Thr Val Leu Asn Cys Ser Arg Thr Cys Pro

275 280 285

Lys Gly Leu Asn Pro Ala Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Lys Ser Met

290 295 300

Ala Phe Thr

305

<210> 3

<211> 1106

<212> DNA

<213> 多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)

<400> 3