一种加拿大糖槭组织培养快繁的方法

技术领域

本发明涉及一种加拿大糖槭组织培养快繁的方法，属于木本植物组织培养繁育技术领域。

背景技术

加拿大糖槭树形极其优美，叶形别致，入秋后，叶色开始慢慢由绿变为黄色、橙黄色、彩色、深红等色彩，是世界著名的彩叶观赏树木。此外，它也是三大糖料木本植物之一，树液中含有3-10％左右的枫糖，一般胸径15cm以上的糖槭树可以开始钻孔采割糖液，连续采集时间至少50年，被誉为“铁杆甘蔗”。其木材作为硬枫木的一种，木质坚硬强韧、密度大、纹理细密，具有极高的抗磨擦强度及抗蒸汽弯曲性能，为“先割糖，后用材”的理想经济树种。加拿大糖槭作为新型经济林树木、景观观赏树种和用材树种开始在我国各省市初步推广，这对于丰富我国林业资源，带动林业经济发展具有重大意义。

加拿大糖槭引种于我国年限较短，目前国内对加拿大糖槭的快速繁殖与产业化经营研究尚属空白。对于其引种栽培和应用推广的研究尚处于起步阶段。加拿大糖槭生长速度较为缓慢，10年生树一般5m，10-15年开始开花，20年生以上树开始大量结实。目前我国加拿大糖槭种质资源全部依赖于进口，价格昂贵且检疫程序复杂。繁殖方式以传统的播种育苗为主，催芽方法复杂、周期长，出芽率约为70％左右，新引种植物易受自然环境条件影响，得苗率仅为50％。研究表明，加拿大糖槭依靠种子繁殖的实生苗变异较大，色彩性状稳定性不高，因此很难在种苗市场上广泛推广应用。

无性繁殖包括扦插繁殖、嫁接繁殖和组织培养。对加拿大糖槭而言，扦插及嫁接繁殖还在试验中，扦插成活率仅为30％，嫁接成活率5％，受地域、温度等自然环境影响较大，尤其难以适应我国南方夏季高温湿热的自然环境，目前尚未探索出稳定的方法；繁殖系数不高且国内没有大量成树提供充足的繁殖材料，对大面积规模繁殖提供一定局限性。加拿大糖槭的组织培养方面在国内外尚鲜见报道，但木本组织培养技术已经较为成熟，其取材方便，生长环境可控，繁殖系数高，遗传稳定性好的优点越来越应用于现代育苗中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种加拿大糖槭组织培养快繁的方法，旨在利用植物的组织器官，在无菌体系条件下，通过人工控制外界环境条件进行培养，达到快速繁殖苗木的目的。此技术取材方便，生长环境可控，繁殖系数高，遗传稳定性好，解决了引种初期加拿大糖槭资源的不足，对加拿大糖槭的稳定繁殖和推广利用都具有着非常重要的意义。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种加拿大糖槭组织培养快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体选择

选取多年生健壮、无病虫害的加拿大糖槭，以其当年生、未木质化的嫩枝作为外植体；

(2)外植体预处理

将步骤(1)中的外植体除去叶片、叶柄，75％酒精擦拭后，修剪成至少带一个腋芽或顶芽的茎段，然后洗洁精震荡清洗；接着将茎段浸泡在纯水中并置于温度为18-22℃下的超声波清洗器中处理，之后用纯水冲洗；

(3)无菌体系的建立

将经步骤(2)处理后外植体在无菌操作台中用75％酒精浸泡消毒，用无菌水冲洗，用0.1％氯化汞震荡消毒，用无菌水冲洗，吸干，再切除茎段两端消毒死亡部分后获得无菌材料；

(4)诱导培养

在MS培养基的基础上添加6-BA 0.5mg/L，蔗糖30g，琼脂6.5g，配置诱导培养基，调节诱导培养基pH至5.8；将步骤(3)无菌材料形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长；

(5)增殖培养

在MS培养基的基础上添加6-BA 0.5mg/L，GA₃>

(6)根的诱导

在MS培养基的基础上添加IBA 0.5mg/L，蔗糖20g，琼脂6.5g，配置生根培养基，调节生根培养基pH至5.8，将步骤(5)的幼苗接入生根培养基进行生根诱导；

(7)无菌苗的炼苗驯化

将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成。

进一步的技术方案在于：步骤(1)进行外植体时间为4月中旬至6月中旬。

进一步的技术方案在于：步骤(2)具体步骤为：将步骤(1)中的外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，用纱布蘸取75％酒精擦拭1-2遍后，再修剪成3-5cm至少带一个腋芽或顶芽的茎段，用洗洁精震荡清洗2遍后，流水清洗8-10分钟，接着将茎段浸泡在装有纯水的容器中并置于温度为18-22℃下的超声波清洗器中处理8-12分钟，之后用纯水冲洗1-2遍。

进一步的技术方案在于：步骤(3)的具体步骤为：将步骤(2)处理后外植体在无菌操作台中用75％酒精浸泡20-40秒进行表面消毒，用无菌水冲洗1-2次，用0.1％氯化汞震荡浸泡消毒2-3分钟，用无菌水冲洗4-6次，吸干，再切除茎段两端消毒死亡部分后获得无菌材料。

进一步的技术方案在于：所述步骤(4)中芽的分化诱导控制培养温度在24-26℃，光照时间12-14h/d，光照强度为2000-2500lx，光照培养20-30d。

进一步的技术方案在于：所述步骤(5)中壮苗培养温度在24-26℃，光照时间12-14h/d，光照强度为2000-2500lx，培养20-30d。

进一步的技术方案在于：所述步骤(6)中根的培养温度20-25℃，光照时间10-16h/d，光照强度为2000-2500lx，培养15-20d。

进一步的技术方案在于：所述步骤(7)的具体步骤为将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养3-5d，再打开瓶盖培养5-7d，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成；其间，每周喷施多菌灵一次；于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。

将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成。

进一步的技术方案在于：在步骤(4)-(6)中均用1mol/LNaOH调节培养基pH。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明在试验过程中发现，野外外植体受环境影响较大，新枝抽条后暴露的时间越长，组织培养污染率越高，所以外植体的消毒，构建无菌体系成为利用野外材料进行组织培养的关键。经反复试验，多次试验结果的比较，才得到本发明的具体实施方案，即4月中旬至6月中旬取材，该阶段加拿大糖槭处于生长旺盛期，新生枝条数量较为丰富，暴露时间段且枝条尚未木质化，分化率较高。每周1-2次取材的频率既可以保证植物生长不受影响，又可以对植物进行修剪定型。试验采用酒精擦拭-表面清洁剂冲洗-超声波清洗-酒精消毒-升汞消毒，增加前期消毒手段，减少了升汞消毒残留及消毒时间过长对外植体的损害，达到理想的灭菌效果，保证了诱导培养所需的外植体数。

本发明前期利用茎段和叶片采用间接途径组织培养方法，即在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，培养愈伤组织再经过再分化形成再生植物，愈伤组织生长良好但不分化成芽，经过无数配方尝试后，仍不能达到很好的分化效果。采用带腋芽和顶芽的茎段采用直接途径组织培养方法，即从植物体分离出符合需要的器官，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株，对加拿大糖槭进行快繁，配合最佳的诱导、增殖、生根培养基配方，能够高效得到大量的加拿大糖槭成苗，大大缩短了育苗周期，解决遗传稳定性问题，有利于推广应用。通过对外植体、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，芽的分化率高达95％，生根率90％左右，成苗率80％以上，能够高效的获得加拿大糖槭优质资源。

本发明在解决生长季取材及野外外植体消毒难题后，带腋芽、顶芽的茎段在多种培养基中表现出较强的分化率，经过数据统计后得出方便应用的最佳诱导、继代、生根培养基配方，有利于苗木生产中操作应用。加拿大糖槭根系的生长较为缓慢，本发明将在生根诱导后得加拿大糖槭移入轻基质容器中继续培养，促进细根的生长，有利于保证成活率。新引种树木易受环境气候影响，尤其是原产于高纬度地区的加拿大糖槭，不耐高温，不耐积水，不耐移栽，宜选择适合的气候移苗至大田苗床。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1-2分别是外植体诱导培养5d、15d后的实验结果；

图3-4生根培养7d后的实验结果；

图5是不同采样时间对外植体的影响图；

图6是不同消毒方法对外植体污染率的影响图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明提供了一种加拿大糖槭组织培养快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体选择

2016年3月中旬至8月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的加拿大糖槭，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体；

(2)外植体预处理

将步骤(1)中的外植体除去叶片、叶柄，用纱布蘸取75％酒精擦拭后，修剪成3-5cm至少带一个腋芽或顶芽的茎段，然后洗洁精震荡清洗10分钟；接着将茎段浸泡在纯水中并置于温度为20℃下的超声波清洗器中处理10分钟，之后用纯水冲洗2次；

(3)无菌体系的建立

将经步骤(2)处理后外植体在无菌操作台中用75％酒精浸泡消毒30秒，用无菌水冲洗3次，用0.1％氯化汞()、30％双氧水、20％次氯酸钠分别震荡消毒1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟，用无菌水冲洗5次，滤纸吸干后，再切除茎段两端消毒死亡部分后获得无菌材料；

(4)诱导培养

在MS培养基的基础上添加不同浓度的6-BA，蔗糖30g，琼脂6.5g，配置诱导培养基，调节诱导培养基pH至5.4、5.6、5.8、6.0；将步骤(3)无菌材料形态学下端插入诱导培养基中进行芽的分化诱导培养，促进芽的萌发和生长；

(5)增殖培养

在MS培养基的基础上添加不同浓度的6-BA、NAA、GA₃，蔗糖30g，琼脂6.5g，配置继代培养基，调节继代培养基pH至5.8，将步骤(4)中的加拿大糖槭腋芽整个接入继代培养基进行增殖培养

(6)根的诱导

在MS培养基的基础上添加不同浓度的IBA，蔗糖20g，琼脂6.5g，配置生根培养基，调节生根培养基pH至5.8，将步骤(5)的增殖幼苗接入生根培养基进行生根诱导；

(7)无菌苗的炼苗驯化

将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成。

优选的，步骤(1)进行外植体时间为加拿大糖槭生长季。

优选的，步骤(1)进行外植体时间为4月中旬至6月中旬。

优选的，步骤(2)具体步骤为：步骤(2)具体步骤为：将步骤(1)中的外植体在不损伤腋芽和顶芽的基础上除去叶片、叶柄，用纱布蘸取75％酒精擦拭1-2遍后，再修剪成3-5cm至少带一个腋芽或顶芽的茎段，用洗洁精震荡清洗2遍后，流水清洗8-10分钟，接着将茎段浸泡在装有纯水的容器中并置于温度为18-22℃下的超声波清洗器中处理8-12分钟，之后用纯水冲洗1-2遍。

优选的，步骤(3)的具体步骤为：将步骤(2)处理后外植体在无菌操作台中用75％酒精浸泡20-40秒进行表面消毒，用无菌水冲洗1-2次，用0.1％氯化汞震荡浸泡消毒2-3分钟，用无菌水冲洗4-6次，吸干，再切除茎段两端消毒死亡部分后获得无菌材料。

优选的，所述步骤(4)中芽的分化诱导控制培养温度在24-26℃，光照时间12-14h/d，光照强度为2000-2500lx，光照培养20-30d。

优选的，所述步骤(5)中壮苗培养温度在24-26℃，光照时间12-14h/d，光照强度为2000-2500lx，培养20-30d。

优选的，所述步骤(6)中根的培养温度20-25℃，光照时间10-16h/d，光照强度为2000-2500lx，培养15-20d。

优选的，所述步骤(7)的具体步骤为将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚，松开瓶盖培养3-5d，再打开瓶盖培养5-7d，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成；其间，每周喷施多菌灵一次；于外界气温持续1周低于30℃以下时移至大田苗床中，适度密植，温度大于30℃时搭遮阳网，保证水分供应。

将步骤(6)的加拿大糖槭生根无菌苗从培养室移至温室大棚培养，然后移入轻基质中继续培育成完整的再生植株；其中轻基质由营养土、河沙和珍珠岩以2∶1∶1的体积比混合并用高锰酸钾消毒制成。

进一步的技术方案在于：在步骤(4)-(6)中均用1mol/LNaOH调节培养基pH。

实施例

2017年3月中旬至8月中旬，选取多年生健壮、无病虫害的加拿大糖槭，以其当年生、未木质化的枝条作为外植体，通过对比不同月份之间的死亡率、污染率、存活率，得出4月中旬至6月中旬为取材的最佳时期。3月污染率虽然比较低但是材料较少，4月中旬至6月中旬取材的外植体，死亡率和污染率相对较低，生长较好，这可能与植物处于生长旺盛期相关。6月中旬以后，外植体的污染率和死亡率明显上升，主要与梅雨季节到来，高温高湿导致微生物活动频繁，外植体灭菌相对困难，且枝条开始木质化，分化能力减弱。

从消毒方式和消毒时间来看，0.1％氯化汞(HgCl₂)较30％双氧水(H₂O₂)、20％次氯酸钠(NaClO)分别震荡消毒更适用于加拿大糖槭的消毒。当0.1％HgCl_2，消毒3分钟时，污染率较低为6.67％，存活率可达93.3％；当消毒时间超过3分钟时，存活率开始大幅度下降，造成此结果的原因可能是少量的汞离子侵害了外植体，从而导致死亡。所以经过前期预处理后，再用酒精处理30s加0.1％HgCl₂的消毒效果较好。具体见图5-6.

表1不同pH值对外植体存活率和培养基的影响

通过调节1mol/LNaoh调节培养基pH，对比不同pH值对外植体的生长影响，pH为5.8时，外植体存活率最高为83.3％，培养基呈现透明果冻状态，软硬度适中。pH为5.4时茎段存活率很低，可能是因为培养基是半液体，外植体浸泡在其中不易成活。pH为6.0时，培养基为淡黄色固体，外植体无法吸收营养。

表2不同激素配比对芽诱导的影响

表3不同激素配比对增殖的影响

表4不同激素配比对生根的影响

在培养基中加入的激素比例不同，其形成芽的形成时间和诱导率也不同，在6-BA0.5mg/L的配方下，芽初次萌发时间为5d，萌发率为93.3％。对于芽的增殖培养6-BA和GA₃的组合处理比6-BA和NAA组合的增殖率要高，最佳配方为6-BA>3加速了细胞增值分化，促进了茎的伸长，芽和叶的生长。生根诱导中，添加IBA0.5mg/L的根诱导率最高为86.7％。