大肠埃希氏菌菌株NF在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中大肠埃希氏菌菌株NF在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已经成为许多国家最为常见的慢性肝脏疾病之一，NAFLD包含非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fattyliver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，并最终可以进展为肝硬化及肝癌。NASH是病情较为严重的阶段，以肝细胞脂质沉积伴有炎症为病理特点，如果不加以干预，其中约有10％-25％的病人会最终发展为肝硬化。关于NAFLD的发病机制尚不完全清楚。它与宿主遗传和环境因素有关，目前广为接受的是“多重打击”学说，胰岛素抵抗是NAFLD发生的“首次打击”，除此以外，来自饮食成分(果糖、脂肪)以及脂肪组织中脂肪酸、炎性因子等信号，肠源性因素以及免疫因素等也促进了NAFLD的发生。近年来，肝脏和肠道的相互关系引起关注，这是由于肝脏和肠道在解剖学上通过门静脉相互连接，来自于肠道中的血液通过门静脉流入肝脏，从而使肝脏极易暴露于从肠道来源的食物抗原和代谢产物，因此肝脏和肠道在功能上有着密不可分的联系，许多研究提示肠道菌群可能在NAFLD的发病机制中起到了重要作用。

人体肠道中的细菌数以亿计，拥有较宿主基因150倍之多的基因数，被称为微生物组(microbiome)，正常情况下，它是一个复杂、动态、多样的微生物群体，形成微生态平衡，在机体健康和疾病中发挥重要作用，它参与了能量获取和储存、代谢以及与肠道免疫系统的相互作用，促进免疫细胞成熟和正常免疫反应的发生。菌群结构一旦失调，则会导致诸如肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝，炎症性肠病、抑郁及多发性硬化等多种疾病的发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一应用：

1)埃希氏菌属(Escherichia)在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用；

2)埃希氏菌属(Escherichia)与非酒精性脂肪肝动物在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用；

3)菌剂在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用；所述菌剂的活性成分为埃希氏菌属(Escherichia)；

4)所述菌剂与非酒精性脂肪肝动物在制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型中的应用。

上述应用中，所述埃希氏菌属(Escherichia)可为保藏编号为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述M1)或M2)：

M1)保藏编号为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF；

M2)活性成分为保藏编号为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF的菌剂。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型的成套产品，所述成套产品由下述P1)-P4)中的任一种与非酒精性脂肪肝动物组成：

P1)埃希氏菌属(Escherichia)；

P2)保藏编号为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF；

P3)活性成分为埃希氏菌属(Escherichia)的菌剂；

P4)活性成分是保藏编号为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF的菌剂。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型的方法。

本发明所提供的制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型的方法，包括对动物或非酒精性脂肪肝动物施用埃希氏菌属(Escherichia)或活性成分为埃希氏菌属(Escherichia)的菌剂，得到非酒精性脂肪性肝炎动物模型。

上述方法中，所述埃希氏菌属(Escherichia)可为保藏编号可为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1)或X2)：

X1)抑制埃希氏菌属(Escherichia)的物质在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎产品中的应用；

X2)抑制埃希氏菌属(Escherichia)的物质在治疗非酒精性脂肪性肝炎中的应用。

上述应用中，所述埃希氏菌属(Escherichia)可为保藏编号可为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF。

本发明中，所述非酒精性脂肪肝(NAFL)动物可为饲喂动物45％fat实验动物饲料得到的具有如下表型的动物：肝细胞脂肪变性和脂质异位贮积，但无炎症、坏死和纤维化等其他明显组织学改变。所述45％fat实验动物饲料具体可为江苏美迪森生物医药有限公司的货号MD12032的产品。

本发明中，所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物具体可为小鼠，如SPF级C57/BL6小鼠。

实验证明，在给非酒精性脂肪肝动物灌胃保藏编号可为CGMCC No.12646的大肠埃希氏菌菌株NF(以下简称菌株NF)后，动物体重有了较快增高趋势，空腹血糖水平升高，糖耐量受损，血清ALT和AST均较未灌胃菌株NF非酒精性脂肪肝动物与正常动物升高，并且病理学上出现了脂肪性肝炎的表现，肝脏脂肪酸合成相关基因水平升高。表明，菌株NF影响了非酒精性脂肪肝动物的代谢功能，使其更快速的发展为非酒精性脂肪性肝炎。此外，非酒精性脂肪肝动物灌胃菌株NF后血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ，IL-17A均较未灌胃菌株NF非酒精性脂肪肝动物与正常动物升高，表明，菌株NF可以引起非酒精性脂肪肝动物低度全身系统性炎症。说明，本发明的菌株NF可以促进NAFL转为非酒精性脂肪性肝炎，可以用来制备非酒精性脂肪性肝炎动物模型，也可作为治疗非酒精性脂肪性肝炎靶标菌。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli

生物材料的菌株编号：NF

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2016年6月20日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12646

附图说明

图1为高脂饮食喂养12周后HFD组小鼠肝细胞。

图2为正常喂养12周后ND组小鼠肝细胞。

图3为菌株NF悬浮液灌胃后小鼠体重的变化。

图4为0min小鼠的血糖含量(空腹血糖含量)。

图5为0min-120min小鼠的血糖含量变化及OGTT曲线下面积。

图6为各组小鼠门静脉血清中炎性因子(TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-17A)的表达水平。

图7为小鼠血中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平检测结果。

图8为各组小鼠的肝脏组织的HE染色结果(×200)。

图9为各组小鼠的肝脏内脂肪酸合成基因FASN在mRNA水平上的相对表达量。

其中，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns，无明显统计学差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的SPF级C57/BL6小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

实施例1、大肠埃希氏菌菌株NF可以促进NAFL转为非酒精性脂肪性肝炎

菌株NF是发明人从人肠道中分离得到的菌株，利用在16S rRNA的两端设计的引物对(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(序列1)与1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(序列2))对菌株NF的16S rRNA进行PCR扩增，扩增产物的16S rRNA的序列如序列表中序列3所示，经序列比对发现该16S rRNA的序列表明该菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株。

菌株NF的形态特征为：在普通营养琼脂上菌落形态：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、半透明，生理盐水中容易分散。

菌株NF已于2016年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12646。

一、脂肪肝小鼠的制备

4-6周雄性SPF级C57/BL6小鼠19只，随机分为两组，分别为高脂饮食组(HFD组)和正常饮食组(ND组)。对ND组中的每只小鼠进行正常喂养，喂养食物为10％fat实验动物饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，货号MD12031)，喂养至12周，将该组小鼠再分为两组，即ND+Ecoli组(5只小鼠)和ND+LB组(4只小鼠)。对HFD组中的每只小鼠进行高脂饮食喂养，喂养食物为45％fat实验动物饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，货号MD12032)，12周后，将该组小鼠再分为两组，即HFD+Ecoli组(5只小鼠)和HFD+LB组(5只小鼠)。

喂养至12周，处死HFD组和ND组小鼠，对肝脏组织进行石蜡包埋，HE染色，(该方法为判断非酒精性脂肪肝表现的金标准)。在光学显微镜下可以看到HFD组小鼠肝细胞脂肪变性和脂质异位贮积，但无炎症、坏死和纤维化等其他明显组织学改变(图1)，ND组小鼠肝细胞大致形态正常(图2)，表明HFD组的小鼠出现非酒精性脂肪肝表型，ND组的小鼠未出现非酒精性脂肪肝表型。

二、菌株NF可以使小鼠的NAFL转为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)

小鼠在相应的食物喂养12周后，对ND+Ecoli组和HFD+Ecoli组的每只小鼠灌胃菌株NF悬浮液1ml(菌株NF悬浮液中菌株NF的浓度为10⁸cfu/ml)，连续灌胃10天；对ND+LB组和HFD+LB组的每只小鼠灌胃LB液体培养基1ml，连续灌胃10天。将第一次灌胃的当周记为12周(12w)。

其中，菌株NF悬浮液为将处于对数生长期的菌株NF悬浮于LB液体培养基中得到的液体，菌株NF悬浮液中菌株NF的浓度为10⁸cfu/ml。

1、小鼠体重变化

在第一次灌胃前称量小鼠体重，以后每7天称取体重，共称取体重7次，即分别在12w、13w、14w、15w、16w、17w和18w称取体重。

各组小鼠体重变化如图3所示。图3中A图为各组小鼠体重随时间的变化，B图为18w各组小鼠的体重。在18w，ND+Ecoli组和ND+LB组小鼠的体重无显著差异；HFD+Ecoli组小鼠的体重分别显著高于ND+Ecoli组和ND+LB组(p<0.05)，而HFD+LB组小鼠的体重分别显著高于ND+Ecoli组和ND+LB组(p<0.01)，HFD+Ecoli组小鼠从14w开始体重较HFD+LB组小鼠出现增加趋势，这种趋势一直持续至18w。

2、小鼠空腹血糖变化

在19w对小鼠进行了口服糖耐量实验(OGTT)，具体方法为：

小鼠禁食12小时(即晚上禁食)，次日清晨应用医用口服葡萄糖粉(为1分子水葡萄糖(一水葡萄糖)，分子量198),按照2.2mg一水葡萄糖/g体重计算每只小鼠所需葡萄糖粉量，用0.2ml生理盐水溶解一水葡萄糖后，对每只小鼠进行灌胃。

将灌胃时记为0min，分别应用罗氏血糖监测仪通过小鼠尾静脉检测0min，30min，60min，90min及120min各组小鼠的血糖含量。

0min小鼠的血糖含量(空腹血糖含量)如图4所示。结果显示，ND+Ecoli组((7.1±0.30)mmol/l)和ND+LB组((6.78±0.24)mmol/l)的空腹血糖含量无显著差异，HFD+LB组小鼠的空腹血糖含量分别显著高于ND+Ecoli组和ND+LB组(p<0.001)，HFD+Ecoli组小鼠的空腹血糖含量分别显著高于ND+Ecoli组和ND+LB组(p<0.001)，并且HFD+Ecoli组小鼠的空腹血糖含量((11.98±0.67)mmol/l)显著高于HFD+LB组小鼠((10.55±0.22)mmol/l)(p<0.05)。

0min-120min小鼠的血糖含量变化及OGTT曲线下面积(AUC)如图5所示。结果显示，HFD+Ecoli组小鼠的糖耐量水平显著低于其他三组小鼠，其OGTT曲线下面积(AUC)明显大于其他三组，并且差异均达到显著水平(p<0.01，p<0.01，p<0.001)。

3、小鼠门静脉血炎性因子水平

在口服糖耐量实验后，用小鼠门静脉血清炎性因子流式微球分析实验(Cytometric Beads Array，CBA)方法对各组小鼠门静脉血清中(TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-17A)的表达水平进行分析，具体采用BD Biosciences的货号为560485的试剂盒进行，具体步骤如下：

1.准备Standards，将Standards冻干粉转入15ml离心管，标注“Top Standard”，用2ml Asaay Diluent溶解Standards冻干粉，轻轻吹吸混匀，不能剧烈混匀，室温平衡15min(浓度为5000pg/ml)；

2.标注12×75mm流式管，按以下浓度顺序排列：1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256；

3.向各管中加入300μl Asaay Diluent；

4.标准品梯度稀释：从Top Standard(1:1)中吸取300ul加入到1:2管中，吹吸混匀，后依次从1:2管吸取300μl到1:4管直至1:256管(20pg/ml)梯度稀释，每一步轻轻吹吸混匀，不能剧烈震荡；

5.准备空白对照：准备1支12×75mm流式管中只加入Asaay Diluent做阴性对照(0pg/ml)；

6.计算待测流式管数目，为待测样本管数+标准品稀释品管数+1个阴性对照；

7.计算需要Capature Beads量，每个Beads每管需10μl，混合之前剧烈震荡每一管Capature Beads；

8.混合Capature Beads，Capature Beads独立分装，用前快速混匀；

9.离心Mixed Capature beads，200g，5min，弃除上清液，用同倒掉的上清液相同体积的serum Enhancement buffer重悬Mixed Capature Beads，剧烈震荡，室温孵育30min，避光；

10.准备cytokine assay，剧烈震荡Mixed Capature Beads，向各管中加入50μl；

11.向control assay tubes中加50μl mouse cytokine Standard dilutions，向待测样品管中加50μl待测样品；

12.向各管中加入50μl Detection Reagent，室温孵育3h，避光；(该时间段内准备流式仪，setup)

13.加1ml wash buffer至每管，离心200g，5min；

14.倒掉上清液；加300μl wash buffer重悬bead；

15.上流式仪检测。

结果如图6所示，结果显示，HFD+Ecoli组门静脉血清内IFN-γ有高于HFD+LB组小鼠的趋势，IL-17A有高于ND+Ecoli组的趋势，HFD+Ecoli组门静脉血清内TNF-α，IL-6，IFN-γ和IL-17A水平均高于其他组小鼠(均p<0.05)。

4、小鼠肝脏肝功能及脂肪变改变

在口服糖耐量实验后，检测各组小鼠血中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平，具体方法如下：

取小鼠外周血，4℃，3000rpm，离心10分钟，分离小鼠血清，于北京大学人民医院检验科应用全自动生化分析仪(日本Labospect 008-1)检测ALT和AST的水平。

结果如图7所示，结果显示，HFD+Ecoli组小鼠的ALT和AST水平均高于其他组小鼠(均p<0.01)。

将各组小鼠的肝脏经过石蜡包埋后，进行HE染色。在光学显微镜下可以看到HFD+Ecoli组小鼠肝脏细胞明显肿胀，胞浆内出现大量脂肪空泡，汇管区附近可见较多炎性细胞；HFD+LB组小鼠肝脏也可看到散在脂肪空泡，肝细胞胞浆内可见较小的脂肪空泡，脂肪变程度较HFD+Ecoli组轻；ND+Ecoli和ND+LB两组小鼠肝脏未见较明显改变(图8)。

检测各组小鼠的肝脏内脂肪酸合成基因FASN在mRNA水平上的相对表达量，所用引物为见表1，内参为GAPDH，引物见表1。结果显示，HFD+Ecol i组小鼠肝脏内FASN在mRNA水平上的相对表达量均高于其他三组小鼠(p值均小于0.05)(图9)。

表1、FASN基因序列及内参基因序列

给小鼠灌胃菌株NF后，HFD+Ecoli组小鼠体重有了较快增高趋势。HFD+Ecoli组小鼠空腹血糖水平升高，糖耐量受损，血清ALT和AST均较其他组小鼠升高，并且病理学上出现了脂肪性肝炎的表现，脂肪酸合成相关基因水平升高。表明，菌株NF影响了HFD+Ecoli组小鼠的代谢功能，使其更快速的发展为非酒精性脂肪性肝炎。

此外，HFD+Ecoli组小鼠血清中TNF-α，IL-6，IFN-γ，IL-17A均较其他组小鼠升高，表明，菌株NF引起HFD+Ecoli组小鼠全身系统性炎症。