一种同步测定乳粉中L‑抗坏血酸、D‑抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种同步测定乳粉中L-抗坏血酸、D-抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的方法。

背景技术

维生素C(又称L-抗坏血酸，L-AA)，是人体每日膳食推荐供应量最大的一种维生素，人体自身不能合成，主要从食物中摄取。L-抗坏血酸有还原型和脱氢型两种，还原型极不稳定，易被氧化成为脱氢型抗坏血酸(DHA)。D-抗坏血酸(D-AA)是L-AA的光学异构体，常被用作食品添加剂，然而其活性只有L-AA的5％。因此，要准确测定乳粉中抗坏血酸的含量，评价其抗氧化价值，需要将L-AA、D-AA、DHA区分测定。

目前，抗坏血酸的测定方法主要有碘量法、2,6-二氯靛酚滴定法，电化学分析法，苯肼比色法，荧光法等，以上方法只能检测总抗坏血酸的含量,而没有区分L-AA、D-AA、DHA的含量。现行高效液相色谱法可以区分测定L-AA、D-AA、DHA，但由于抗坏血酸的稳定性差，整个检测过程需要避光，操作繁琐。样品提取方法繁琐、提取物稳定性差、同分异构体L-AA和D-AA化学性质相似，色谱分离不佳等问题是目前液相色谱法测定抗坏血酸的关键问题所在。

而乳粉中抗坏血酸含量一般较高，因此要求色谱条件在抗坏血酸浓度较高时，可以有效分离L-AA与D-AA。使用现行的色谱条件测定乳粉中L-AA、D-AA、DHA通常存在随着抗坏血酸浓度升高，L-AA与D-AA分离度降低，甚至出现平顶峰，保留时间漂移的问题，不利于精确定性和定量(图1)。

发明内容

本发明针对上述问题，提供一种同步测定乳粉中L-抗坏血酸、D-抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的方法，本方法具有无需避光操作、线性范围广、化学试剂用量少、提取物稳定性好、回收率高、检测限低、检测结果重现性强、多联检测的优点，对于测定乳粉中活性抗坏血酸的真实含量具有重要意义。

本发明同时测定乳粉中L-AA、D-AA、DHA的方法，包括如下操作步骤：

1)样品预处理：

A液制备：称取待检测的乳粉样品置于具塞离心管中，加入经过氮吹除氧的提取液，涡旋溶解并定容；摇匀，超声波处理后离心，吸取部分上清液，另一部分用于制备B液，经水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸和D-抗坏血酸含量；

所述的提取液由偏磷酸和硫代硫酸钠构成，偏磷酸浓度为0.25mol/L，硫代硫酸钠浓度为0.019mol/L；

所述超声波处理条件为冰浴超声3秒、间歇5秒，90～100个循环；

所述离心条件为0℃、9000r/min离心5min；

所述的水相膜为0.22μm水相膜；

B液制备：取A液制备中的离心后的上清液于具塞离心管中，加入还原剂，调节pH至7.0～7.2，振荡；再调节pH至2.5～2.8，最后用纯水定容后，溶液经过水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸的总量；

所述的还原剂为浓度为0.177mol/L L-半胱氨酸溶液；

所述的调节pH至7.0～7.2，是使用磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2；

所述的调节pH至2.5～2.8，是使用磷酸调节pH至2.5～2.8。

2)标准溶液配制及标准曲线的绘制：

优选为分别称取L-抗坏血酸、D-抗坏血酸标准品，用偏磷酸和硫代硫酸钠混合液，溶解、定容配制成单标准品储备液，再分别吸取单标准品储备液配制成混合标准品储备液；再用偏磷酸和硫代硫酸钠混合液将混合标准品储备液适当稀释，配制系列混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线(图2、图3)，计算标准回归方程，结果如下：

L-AA：y＝46.8x+1.86；D-AA：y＝53.7x-8.35；线性范围0.5mg/L～200mg/L；

所述的偏磷酸和硫代硫酸钠混合液，偏磷酸浓度为0.25mol/L，硫代硫酸钠浓度为0.019mol/L，氮吹除氧、低温保存；

3)将步骤1)所得样品用高效液相色谱仪器检测，将L-抗坏血酸、D-抗坏血酸的峰面积分别代入所述标准回归方程，求得待测物浓度，记为C₁和C₂；

所述高效液相色谱条件为：Agilent G1260型高效液相色谱仪；

Agilent(SB-C18，4.6×250mm，5μm)反相色谱柱；流动相由磷酸二氢钾和癸胺配制而成，调节pH为2.5～2.8；超声脱气；色谱条件：检测波长为245nm；流速为0.7ml/min；柱温为27℃；进样量为10μl；

所述流动相磷酸二氢钾浓度为0.025mol/L，癸胺浓度为4.3mmol/L；

所述调节流动相的pH为2.5～2.8，优选调节为pH＝2.7，可以使L-抗坏血酸和D-抗坏血酸有效分离(图4)；

4)结果计算和表述

①将C₁和C₂代入下式计算试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量

式中:

X_1，2——试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量,(mg/100g)；

C_1，2——由标准回归方程求得的试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

②试样中L-抗坏血酸的总量计算公式如下：

式中:

X——试样中总L-抗坏血酸的含量,(mg/100g)；

C——由标准回归方程求得的试样中总L-抗坏血酸的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

F——2.5(还原步骤稀释倍数)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

③脱氢抗坏血酸含量＝X-X₁

其中，X₁为L-抗坏血酸含量，由①中X₁计算得到；X为L-抗坏血酸的总量，

由②中X计算得到。

本发明的有益效果是：

1、提取液使用除氧的硫代硫酸钠和偏磷酸混合溶液，可以有效保护活性抗坏血酸，提高其稳定性，无需避光操作，实验操作简便，提取物在低温条件下24h内性质稳定。

2、本发明所涉及的色谱条件对色谱柱损伤较小，可延长色谱柱寿命；流动相由磷酸二氢钾和癸胺构成，其浓度可以提高分离度，抗坏血酸浓度较高时，仍可以使2种同分异构体有效分离，避免彼此干扰，可准确测定活性抗坏血酸的含量。

3、本发明操作简单、化学试剂用量少、提取物稳定性好、三水平加标回收率为99.5％～113.1％、抗坏血酸检测限均为0.04mg/100g、线性范围0.5mg/L～200mg/L、检测方法相对标准偏差为7.82％、可以多联检测，对于准确测定乳粉中活性抗坏血酸的真实含量具有重要意义。

附图说明

图1：现行方法色谱条件下0.5mg/L-50mg/L混合标准溶液HPLC图；

图2：L-抗坏血酸的标准曲线图；

图3：D-抗坏血酸的标准曲线图；

图4：本发明色谱条件下50mg/L混合标准溶液HPLC图；

图5：不同流动相条件下50mg/L混合标准溶液HPLC图；

图6：偏磷酸作为提取液的稳定性实验；

图7：偏磷酸和硫代硫酸钠作为提取液的稳定性实验；

图8：本发明实施例样品空白干扰性实验的HPLC图；

图9：本发明实施例2配方乳粉样品的HPLC图

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因此不能将之理解为对本发明的一种限制。

本发明的方法，其总体步骤如下：

1)样品预处理：

A液制备：称取待检测的乳粉样品置于具塞离心管中，加入经过氮吹除氧的提取液，涡旋溶解并定容；摇匀，超声波处理后离心，吸取部分上清液，另一部分用于制备B液，经水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸和D-抗坏血酸含量；

所述的提取液由偏磷酸和硫代硫酸钠构成，偏磷酸浓度为0.25mol/L，硫代硫酸钠浓度为0.019mol/L；

所述超声波处理条件为冰浴超声3秒、间歇5秒，90～100个循环；

所述离心条件为0℃、9000r/min离心5min；

所述的水相膜为0.22μm水相膜；

B液制备：取A液制备中的离心后的上清液于具塞离心管中，加入还原剂，调节pH至7.0～7.2，振荡；再调节pH至2.5～2.8，最后用纯水定容后，溶液经过水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸的总量；

所述的还原剂为浓度为0.177mol/L L-半胱氨酸溶液，现用现配；

所述的调节pH至7.0～7.2，是使用磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2；

所述的调节pH至2.5～2.8，是使用磷酸调节pH至2.5～2.8。

2)标准溶液配制及标准曲线的绘制：

优选为分别称取L-抗坏血酸、D-抗坏血酸标准品，用偏磷酸和硫代硫酸钠混合液，溶解、定容配制成单标准品储备液，再分别吸取单标准品储备液配制成混合标准品储备液；再用偏磷酸和硫代硫酸钠混合液将混合标准品储备液适当稀释，配制系列混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线(图2、图3)，计算标准回归方程，结果如下：

L-AA：y＝46.8x+1.86；D-AA：y＝53.7x-8.35；线性范围0.5mg/L～200mg/L；

其中x为标液中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量,(mg/L)；y为对应的色谱峰面积；

所述的偏磷酸和硫代硫酸钠混合液，偏磷酸浓度为0.25mol/L，硫代硫酸钠浓度为0.019mol/L，氮吹除氧、低温保存；

3)将步骤1)所得样品用高效液相色谱仪器检测，将L-抗坏血酸、D-抗坏血酸的峰面积分别代入所述标准回归方程，求得待测物浓度，记为C₁和C₂；

所述高效液相色谱条件为：Agilent G1260型高效液相色谱仪；

Agilent(SB-C18，4.6×250mm，5μm)反相色谱柱；流动相由磷酸二氢钾和癸胺配制而成，调节pH为2.5～2.8；超声脱气；色谱条件：检测波长为245nm；流速为0.7ml/min；柱温为27℃；进样量为10μl；

所述流动相磷酸二氢钾浓度为0.025mol/L，癸胺浓度为4.3mmol/L；

所述调节流动相的pH为2.5～2.8，优选调节为pH＝2.7，可以使L-抗坏血酸和D-抗坏血酸有效分离(图4)；

所述的调节流动相pH＝2.7；

4)结果计算和表述

①将C₁和C₂代入下式计算试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量

式中:

X_1，2——试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量,(mg/100g)；

C_1，2——由标准回归方程求得的试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

②试样中L-抗坏血酸的总量计算公式如下：

式中:

X——试样中总L-抗坏血酸的含量,(mg/100g)；

C——由标准回归方程求得的试样中总L-抗坏血酸的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

F——2.5(还原步骤稀释倍数)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

③脱氢抗坏血酸含量＝X-X₁

其中，X₁为L-抗坏血酸含量，由①中X₁计算得到；X为L-抗坏血酸的总量，

由②中X计算得到。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实施例1：

本实施例为羊奶粉中抗坏血酸的测定：

1.流动相的选择

鉴于已有色谱条件不能将两种抗坏血酸有效分离，申请人使用磷酸二氢钾和癸胺等体积混合作为流动相，对两种抗坏血酸峰形和分离效果的影响，缓冲盐组分构成见表1，色谱图见图5。

表1缓冲盐浓度

由图5中a、b、c可知，随着癸胺浓度的提高，分离度有所提高。当磷酸二氢钾、癸胺浓度分别为0.05mol/L、8.6mmol/L时分离度较好，但太高的缓冲盐浓度会缩短色谱柱使用寿命，因此，磷酸二氢钾、癸胺缓冲盐溶液浓度同时减半，即浓度分别为0.025mol/L、4.3mmol/L，得到色谱图(见图5中d)，峰形尖锐、对称，达到基线分离。出峰顺序依次为L-抗坏血酸、D-抗坏血酸，故选择该浓度的缓冲盐作流动相。

2.样品预处理：

A液制备：称取2～3g羊奶粉样品(精确至0.001g)置于具塞离心管中，加入提取液，涡旋溶解并定容至25ml。摇匀，冰浴超声3秒、间歇5秒，90～100个循环；0℃、9000r/min离心5min，吸取部分上清液，另一部分上清液用于B液制备，经0.22μm水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸和D-抗坏血酸含量，此羊奶粉中没有检测到D-抗坏血酸；

B液制备：取10ml A中部分离心后的上清液于具塞离心管中，加入5ml现配0.177mol/L的L-半胱氨酸溶液，用磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2，常温振荡5min。再用磷酸调节pH至2.5～2.8，用高纯水定容至25ml。摇匀，经0.22μm水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸的总量。

所述的提取液由偏磷酸和硫代硫酸钠构成，偏磷酸浓度为0.25mol/L，硫代硫酸钠浓度为0.019mol/L，氮吹除氧、低温保存。

提取液的选择：由于抗坏血酸具有较强的还原性，易受空气、光、热等因素影响。申请人选取了0.1mol/L草酸、0.1mol/L磷酸、0.25mol/L偏磷酸作为提取液做三水平添加回收试验，结果发现用0.25mol/L偏磷酸作为提取液回收率高，且不同添加水平的相对标准偏差小于8％(表2)。因此实验选取0.25mol/L偏磷酸作为提取液。

表2偏磷酸作为提取液的加标回收率

稳定性实验：将用0.25mol/L偏磷酸作为提取液提取的样品在4℃下保存0h、6h、16h、24h，每个时间点分别连续进样3次，依次测定抗坏血酸含量，随着放置时间的延长，抗坏血酸含量明显下降(图6),24h后减少40％，0.25mol/L偏磷酸并不能有效保护抗坏血酸。因此，进一步对比了在提取液中加入适量EDTA二钠盐、磷酸三氯乙酯、硫代硫酸钠等保护剂，对提取物稳定性的影响。实验发现，当使用0.019mol/L硫代硫酸钠与0.25mol/L偏磷酸做提取液时，实验过程无需避光，且样品提取物可以在24h内保持稳定。0h、6h、16h、24h的测定结果见图7，实验结果见表3，得到抗坏血酸含量的相对标准偏差RSD﹤2％，无显著性差异，样品溶液在24h内稳定。

表3稳定性实验结果

3.标准溶液配制及标准曲线的绘制：

分别准确称L-抗坏血酸、D-抗坏血酸标准品各100mg，用0.25mol/L偏磷酸和0.019mol/L硫代硫酸钠混合液溶解，并定容到2个10mL棕色容量瓶中配制成单标准品储备液，再分别吸取适量单标准品储备液转移至1个10mL棕色容量瓶中定容，配制成浓度为200mg/L的混合标准品储备液。再用偏磷酸和硫代硫酸钠混合溶液将混合标准品储备液适当稀释，配制成浓度分别为0.5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程，结果如下：

L-AA：y＝46.8x+1.86；D-AA：y＝53.7x-8.35；线性范围0.5mg/L～200mg/L。

4.检测条件设定

采用Agilent G1260型高效液相色谱仪；Agilent(SB-C18，4.6×250mm，5μm)反相色谱柱；流动相由磷酸二氢钾和癸胺配制而成，磷酸二氢钾浓度为0.025mol/L，癸胺浓度为4.3mmol/L，pH为2.7；检测波长为245nm；流速为0.7ml/min；柱温为27℃；进样量为10μl。

5.样品测定，每批样品做2个平行

将步骤2所得样品进行高效液相色谱仪器检测，将L-抗坏血酸、D-抗坏血酸的峰面积分别代入所述标准回归方程，求得待测物浓度，记为C1和C2。

6.空白实验

为排除色谱图中有溶剂干扰抗坏血酸峰的出现，除不加试样外，其他均按上述测定条件和步骤进行，色谱图见图8。

7.结果计算

①将C₁和C₂代入下式计算试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量

式中:

X_1，2——试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量,(mg/100g)；

C_1，2——由标准回归方程求得的试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

②试样中L-抗坏血酸的总量计算公式如下：

式中:

X——试样中总L-抗坏血酸的含量,(mg/100g)；

C——由标准回归方程求得的试样中总L-抗坏血酸的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

F——2.5(还原步骤稀释倍数)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

③脱氢抗坏血酸含量＝X-X₁

其中，X₁为L-抗坏血酸含量，由①中X₁计算；X为L-抗坏血酸的总量，由②中X计算。

8.结果分析

①羊奶粉中L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量测定结果见表4，根据试验测定结果，确定乳粉中只含有L-抗坏血酸，含量为81.5mg/100g，不含D-抗坏血酸，该奶粉标签显示维生素C平均含量为87.3mg/100g，测定值为示值的93.4％。

表4：样品测定结果

②仪器的精密度

取50mg/L的混合标准溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，计算该方法的精密度。测试结果见表5，相对标准偏差RSD﹤1％，表明本方法的精密度良好。

表5：精密度实验结果

实施例2：

本实施例为配方乳粉中抗坏血酸的测定：

1.样品预处理：

A液制备：称取2～3g配方乳粉样品(精确至0.001g)置于具塞离心管中，加入0.25mol/L偏磷酸和0.019mol/L硫代硫酸钠混合提取液，涡旋溶解并定容至25ml。摇匀，冰浴超声3秒、间歇5秒，90～100个循环；0℃、9000r/min离心5min，吸取部分上清液，另一部分上清液用于B液制备，经0.22μm水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸和D-抗坏血酸含量；

B液制备：取10ml A中部分离心后的上清液于具塞离心管中，加入5ml现配0.177mol/L的L-半胱氨酸溶液，用磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2，常温振荡5min。再用磷酸调节pH至2.5～2.8，用高纯水定容至25ml。摇匀，经0.22μm水相膜过滤后转移至棕色瓶中，用于测定L-抗坏血酸的总量。

2.标准溶液配制及标准曲线的绘制：

分别准确称L-抗坏血酸、D-抗坏血酸标准品各100mg，用0.25mol/L偏磷酸和0.019mol/L硫代硫酸钠1:1混合液溶解，并定容到2个10mL棕色容量瓶中配制成单标准品储备液，再分别吸取适量单标准品储备液转移至1个10mL棕色容量瓶中定容，配制成浓度为200mg/L的混合标准品储备液。再用偏磷酸和硫代硫酸钠混合溶液将混合标准品储备液适当稀释，配制成浓度分别为0.5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的混合标准品工作液，采用高效液相色谱仪进行分析，绘制标准曲线，计算标准回归方程，结果如下：

L-AA：y＝46.8x+1.86；D-AA：y＝53.7x-8.35；线性范围0.5mg/L～200mg/L。

3.检测条件设定

采用Agilent G1260型高效液相色谱仪；Agilent(SB-C18，4.6x250，5μm)反相色谱柱；流动相由磷酸二氢钾和癸胺配制而成，磷酸二氢钾浓度为0.025mol/L，癸胺浓度为4.3mmol/L，pH为2.7；检测波长为245nm；流速为0.7ml/min；柱温为27℃；进样量为10μl。

4.样品测定，每批样品做2个平行

将步骤2所得样品进行高效液相色谱仪器检测，将L-抗坏血酸、D-抗坏血酸的峰面积分别代入所述标准回归方程，求得待测物浓度，记为C1和C2。

5.空白实验

为排除色谱图中有溶剂干扰抗坏血酸峰的出现，除不加试样外，其他均按上述测定条件和步骤进行，色谱图见图8。

6.结果分析

①将C₁和C₂代入下式计算试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量

式中:

X_1，2——试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的含量,(mg/100g)；

C_1，2——由标准回归方程求得的试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

②试样中总L-抗坏血酸含量计算公式如下：

式中:

X——试样中总L-抗坏血酸的含量,(mg/100g)；

C——由标准回归方程求得的试样中总L-抗坏血酸的质量浓度,(mg/L)；

C₀——由标准回归方程求得的空白试样中L-抗坏血酸(或D-抗坏血酸)的质量浓度(mg/L)；

V——试样的最后定容体积(mL)；

m——实际称取样品质量(g)；

1000——换算系数(由mg/L换算成mg/mL的换算因子)；

F——2.5(还原步骤稀释倍数)；

100——换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

③脱氢抗坏血酸含量＝X-X₁

其中，X₁为L-抗坏血酸含量，由①中X₁计算得到；X为L-抗坏血酸的总量，

由②中X计算得到。

8.结果分析

①配方乳粉中L-抗坏血酸、D-抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量测定色谱图见图9，结果见表6，

表6：样品测定结果

结果表明此配方乳粉中含有L-抗坏血酸、D-抗坏血酸两种抗坏血酸，含量分别为162.6mg/100g、3.02mg/100g。此配方乳粉中少量添加了D-抗坏血酸。