葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种新的过敏性哮喘特异性免疫治疗小鼠模型的建立方法，特别是葎草花粉诱导的小鼠过敏性哮喘特异性免疫治疗模型的建立方法。

背景技术

过敏性哮喘是由吸入变应原引起由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症。葎草花粉是我国花粉过敏性哮喘的重要诱因，变应原特异性免疫治疗是目前唯一针对过敏性哮喘病因的治疗方法，可以改变哮喘的自然病程，防止哮喘病情恶化并预防机体对新的过敏原产生过敏。

目前特异性免疫治疗疗程长，有发生严重过敏反应等副反应可能，对特异性免疫治疗作用机制的研究有助于我们进一步探索短疗程，高疗效的新型特异性免疫治疗方法。由于伦理学限制，很多关于过敏性哮喘特异性免疫治疗机制的研究不能直接以人为研究对象，这时过敏性哮喘特异性免疫治疗动物模型的建立显得尤为重要。

通过对小鼠皮下注射变应原致敏，雾化吸入变应原激发哮喘发作，皮下注射变应原诱导免疫耐受3条主要技术手段建立小鼠过敏性哮喘特异性免疫治疗模型。建立小鼠过敏性哮喘免疫治疗模型所需的变应原特异性IgE检测、小鼠肺功能的评估、肺脏病理学变化、血清细胞因子水平检测均为评估过敏性哮喘模型中变应原特异性、哮喘严重程度、免疫治疗疗效等指标评估的指示因素。目前国内小鼠过敏性哮喘免疫治疗的模型主要为尘螨过敏相关模型。不同变应原诱导哮喘所需的浓度及给药方式存在差异，目前尚未见诱导条件成熟的葎草花粉过敏性哮喘特异性免疫治疗动物模型的研究。

发明内容

本发明的技术目的是建立一种有效的过敏性哮喘特异性免疫治疗小鼠模型，为研究葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗作用机制提供良好的载体。

为了达到上述技术目的，本发明首先提供一种精确的葎草花粉变应原的提取方法，将葎草花粉按W:V＝1：20的量加入丙酮搅拌脱脂；风干后弃丙酮并待丙酮完全挥发完；然后加入与丙酮等量的去离子水搅拌，离心，过滤，透析，透析时加入V:V＝1:20的去离子水并多次换水；透析后的提取液分装于西林瓶中冷冻待用；上述步骤均在4℃进行。

上述方法优选的具体步骤为：

1)称重：称取40g葎草花粉；

2)脱脂：加入W:V＝1：20的800ml丙酮于4℃搅拌24h；

3)风干：弃丙酮，花粉置于通风橱内等待残余丙酮挥发；

4)提取：加入800ml去离子水，4℃搅拌24h；

5)离心：10000转/分，4℃离心15min；

6)过滤：0.2μm滤膜负压过滤；

7)透析：滤液装入3.5kd透析袋，加入去离子水16L(V:V＝1:20)透析，4℃搅拌24h，期间换水6次；

8)分装：透析后的提取液分装于10ml西林瓶中，每瓶2ml，置于-80℃冰箱过夜；

9)冻干：将西林瓶从-80℃冰箱取出置于冻干机中冻干。

上述提取方法提取得到的葎草花粉变应原，用于建立葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型。

进一步的，本发明提供一种葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型的建立方法，包括步骤：

第一步:分别于第1天、第8天和第15天对BALB/c小鼠颈后皮下各注射25μl、1μg/μl的葎草花粉变应原粗浸液对小鼠致敏；

第二步：第22-24天，雾化吸入1％的葎草花粉变应原粗浸液激发，连续3天，每天30min；

第三步：第25天开始，颈后皮下注射300μg葎草花粉变应原粗浸液脱敏，隔天一次，共8次；

第四步：第43-49天，雾化吸入1％的葎草花粉变应原粗浸液再次激发，连续7天，每天30min；造模成功；

其中所述的葎草花粉变应原粗浸液是采用上述的冻干的葎草花粉变应原用PBS溶解，调整浓度为1μg/μl，分别用于第一步致敏、第二步激发、第三步脱敏以及第四步再次激发；第三步脱敏过程中300μg葎草花粉变应原粗浸液为1μg/μl的300μl，使用时加入V:W＝5:2的氢氧化铝佐剂120μg。

本模型在建立过程中，通过对小鼠皮下注射葎草花粉变应原致敏，雾化诱导哮喘发作，皮下注射葎草花粉变应原免疫治疗，再次雾化吸入变应原评估免疫治疗后效果四步成功建立葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型，为研究葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗作用机制从而改进免疫治疗方法提供良好的载体。

附图说明

图1是实施例2的实验进程。

图2是Western-blot步骤。

图3是实施例2中过敏性哮喘小鼠模型组和对照组小鼠症状。

图4是实施例2中免疫治疗组小鼠分别与模型组以及对照组相比哮喘症状发生频率的x2检验。

图5是实施例2中三组小鼠Penh对Mch的反应呈剂量依赖性，#同对照组相比p＜0.05；*同模型组相比p＜0.05。

图6是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组小鼠血清tIgE表达水平，每组各取10个样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为浓度(pg/ml)；#同对照组相比p＜0.05；*同模型组相比p＜0.05。

图7是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组小鼠血清sIgE表达水平，每组各取10例样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为OD值；#同对照组相比p＜0.05；*同模型组相比p＜0.05。

图8是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组小鼠血清sIgG1表达水平，每组各取10例样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为OD值；#同对照组相比p＜0.05；*同模型组相比p＜0.05。

图9是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组小鼠血清sIg2a表达水平，每组各取10例样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为OD值；#同对照组相比p＜0.05；*同模型组相比p＜0.05。

图10是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组3组小鼠血清中Th1细胞因子IL-12p70和IFN-γ水平，每组各取10个样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为浓度(pg/ml)；#同对照组相比p＜0.05。

图11是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组3组小鼠血清中Th2细胞因子IL-5和IL-13水平，每组各取10个样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为浓度(pg/ml)；#同对照组相比p＜0.05。

图12是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组3组小鼠肺细胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中Th1细胞因子IL-12p70和IFN-γ水平，每组各取10个样本，数值以均数±标准误的形式表达，衡量指标为浓度(pg/ml)；#同对照组相比p＜0.05。

图13是实施例2中模型组、免疫治疗组和对照组3组小鼠BALF中Th2细胞因子IL-5和IL-13水平，每组各取10个样本，数值以均数±标准误的形式表达。IL-5水平低于试剂盒检测下限，衡量指标以OD值表示；IL-13衡量指标为浓度(pg/ml)；#同对照组相比p＜0.05。

图14是实施例2中三组小鼠肺组织炎症细胞浸润(a)和粘液分泌的组织病理学情况(b)(x 10)。

图15是实施例2中12.5％葎草花粉变应原SDS-PAGE，1-3条带的葎草蛋白上样量依次为30μl(复孔)，20μl(复孔)和10μl(复孔)，浓度为1.5μg/μl。

图16是实施例2中葎草花粉特异性IgE结合的变应原免疫印迹分析，1-10：模型组10只小鼠；P阳性对照；N阴性对照。

图17a是实施例3中对照组建模流程。

图17b是实施例3中模型组建模流程。

图17c是实施例3中治疗组建模流程。

图18是实施例3中小鼠气道高反应性检测，**代表模型组VS.对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS.模型组，P＜0.01；#代表治疗组VS.模型组，P＜0.05。

图19是实施例3中小鼠血清中葎草花粉特异性IgE表达，**代表模型组VS.对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS.模型组，P＜0.01。

图20a是实施例3中血清sIgG1水平，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS模型组，P＜0.01。

图20b是实施例3中血清sIgG2a水平，*代表模型组VS对照组，P＜0.05。

图21是实施例3中BALF中细胞分类计数，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS模型组，P＜0.01。

图22是实施例3中BALF中嗜酸细胞比例，**代表模型组VS.对照组，P＜0.01；#代表治疗组VS.模型组，P＜0.05。

图23是实施例3中BALF中IL-4和IL-13的表达，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS模型组，P＜0.01；#代表治疗组VS模型组，P＜0.05。

图24是实施例3中脾匀浆液中中IL-4和IL-13的表达，*代表模型组VS对照组，P＜0.05。

图25是实施例3中BALF中INF-γ的表达，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS模型组，P＜0.01。

图26是实施例3中脾匀浆液中INF-γ的表达，*代表模型组VS.对照组，P＜0.05；#代表治疗组VS.模型组，P＜0.05。

图27是实施例3中BALF和脾匀浆液中IL-10的表达，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS模型组，P＜0.01。

图28a是实施例3中对照组100倍镜下(HE)。

图28b是实施例3中对照组200倍镜下(HE)。

图29a是实施例3中模型组100倍镜下(HE)。

图29b是实施例3中模型组200倍镜下(HE)。

图30a是实施例3中治疗组100倍镜下(HE)。

图30b是实施例3中治疗组200倍镜下(HE)。

图31a是实施例3中对照组100倍镜下(AB-PAS)。

图31b是实施例3中对照组200倍镜下(AB-PAS)。

图32a是实施例3中模型组100倍镜下(AB-PAS)。

图32b是实施例3中模型组200倍镜下(AB-PAS)。

图33a是实施例3中治疗组100倍镜下(AB-PAS)。

图33b是实施例3中治疗组200倍镜下(AB-PAS)。

图34是实施例3中小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和杯状细胞计数，**代表模型组VS对照组，P＜0.01；##代表治疗组VS.模型组，P＜0.01；#代表治疗组VS.模型组，P＜0.05。

图35a是实施例4中皮下致敏模型组(PX-M)实验进程。

图35b是实施例4中腹腔致敏模型组(FQ-M)实验进程。

图35c是实施例4中皮下致敏对照组(PX-D)实验进程示意图。

图35d是实施例4中腹腔致敏对照组(FQ-D)实验进程示意图。

图36是实施例4中小鼠气道高反应性检测，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01；##代表FQ-M组VS.FQ-D组，P＜0.01；#代表FQ-M组VS.FQ-D组，P＜0.05。

图37是实施例4中各组小鼠葎草花粉特异性IgE比较，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01；##代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.01。

图38是实施例4中BALF中细胞分类计数，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01；##代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.01。

图39是实施例4中BALF中的嗜酸细胞比例，**代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.01。

图40是实施例4中BALF中的IL-4和IL-13表达，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01；#代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.05。

图41是实施例4中脾匀浆液中IL-4和IL-13表达量，*代表PX-M组VS.PX-D组，P＜0.05；#代表PX-M组VS.FQ-M组，P＜0.05。

图42是实施例4中BALF中INF-γ的表达。

图43是实施例4中脾匀浆液中中INF-γ的表达。

图44是实施例4中BALF和脾匀浆液中IL-10的表达，*代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.05。

图45a是实施例4中FQ-D 100倍镜下(HE)。

图45b是实施例4中FQ-D 200倍镜下(HE)。

图46a是实施例4中FQ-M 100倍镜下(HE)。

图46b是实施例4中FQ-M 200倍镜下(HE)。

图47a是实施例4中PX-D 100倍镜下(HE)。

图47b是实施例4中PX-D 200倍镜下(HE)。

图48a是实施例4中PX-M 100倍镜下(HE)。

图48b是实施例4中PX-M 200倍镜下(HE)。

图49a是实施例4中FQ-D 100倍镜下(AB-PAS)。

图49b是实施例4中FQ-D 200倍镜下(AB-PAS)。

图50a是实施例4中FQ-M 100倍镜下(AB-PAS)。

图50b是实施例4中FQ-M 200倍镜下(AB-PAS)。

图51a是实施例4中PX-D 100倍镜下(AB-PAS)。

图51b是实施例4中PX-D 200倍镜下(AB-PAS)。

图52a是实施例4中PX-M 100倍镜下(AB-PAS)。

图52b是实施例4中PX-M 200倍镜下(AB-PAS)。

图53是实施例4中小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和杯状细胞(goblet)数评分，**代表FQ-M组和PX-M组VS.各自的对照组，P＜0.01。

图54是实施例4中小鼠血清的Western Blotting，1-10泳道为PX-M组小鼠，11-20泳道为FQ-M小鼠。N为对照组小鼠的混合血清池。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1葎草花粉变应原的制备方法，具体步骤为：

1)称重：称取40g葎草花粉；

2)脱脂：加入W:V＝1：20的800ml丙酮于4℃搅拌24h；

3)风干：弃丙酮，花粉置于通风橱内等待残余丙酮挥发；

4)提取：加入800ml去离子水，4℃搅拌24h；

5)离心：10000转/分，4℃离心15min；

6)过滤：0.2μm滤膜负压过滤；

7)透析：滤液装入3.5kd透析袋，加入去离子水16L(V:V＝1:20)透析，4℃搅拌24h，期间换水6次；

8)分装：透析后的提取液分装于10ml西林瓶中，每瓶2ml，置于-80℃冰箱过夜；

9)冻干：将西林瓶从-80℃冰箱取出置于冻干机中冻干。

上述提取方法提取得到的葎草花粉变应原，用于后续建立葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型。使用时，将冻干的葎草花粉变应原用PBS溶解，调整浓度为1μg/μl，分别用于第一步致敏、第二步激发、第三步脱敏以及第四步再次激发。

实施例2葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型制备

一、实验材料和研究方法

1、研究对象

60只Balb/c小鼠随机分为模型组、免疫治疗组和对照组，每组20只。模型组小鼠为葎草花粉过敏性哮喘小鼠，免疫治疗组为接受皮下注射葎草花粉变应原特异性免疫治疗的哮喘小鼠，对照组为仅接受PBS处理的小鼠。

(1)动物准备

6-8周龄雌性Balb/c小鼠60只(SPF级),由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

(2)动物分组建模

小鼠60只随机分为模型组、免疫治疗组和对照组，每组20只。

模型组(见图1A)

1)致敏：分别于第1天、第7天和第14天对每只小鼠腹腔注射葎草花粉变应原粗浸液300μl(1μg/μl)(含氢氧化铝佐剂120μg)，共3次；

2)激发：第21天和第22天，对每只小鼠鼻腔滴入葎草花粉变应原粗浸液30μl(10μg/μl)，共2次。

免疫治疗组(见图1B)

1)致敏：同模型组；

2)脱敏：从第15天开始对小鼠腹部皮下注射葎草花粉变应原，每次100μl(1μg/μl)，每天1次，共8天。

3)激发：同模型组。

对照组(见图1A)

1)致敏：采用相同体积的PBS(300ul)加入4％氢氧化铝腹腔注射；

2)激发：采用相同体积的PBS(30ul)滴鼻激发。

2、实验材料及仪器试剂

3、标本采集

为了避免乙酰甲胆碱对检测指标的影响，取材一律用未经乙酰甲胆碱激发的小鼠，每组10只。

(1)血清

小鼠末次激发24h后，用10％水合氯醛(无菌PBS稀释)75μl腹腔注射麻醉。剪除口周胡须，摘除一侧眼球，用1.5mlEP管收集血液。4000rpm 4℃离心10min，取血清装入另外EP管，-80℃冻存备用。

(2)BALF

切开颈部皮肤，分离皮下组织，暴露气管，结扎左肺上叶。左侧支气管远心端剪“V”型切口，置气管插管。用0.9％冰浴PBS 0.4ml行支气管肺泡灌洗，每次气道内注入、回抽3次，回收液体量＞80％为合格。收集的BALF 4000rpm 4℃离心10min，取上清装入另外EP管，-80℃冻存备用。

(3)肺脏

结扎的左肺上叶分离后置于福尔马林中固定，用于HE(hematoxylin-eosin)，AB-PAS(Alcian blue-periodic acid sthiff)染色。

4、研究方法

(1)观察小鼠的一般状态以评估过敏性哮喘症状的严重程度

小鼠一般状态包括小鼠呼吸频率、毛发质量、精神状态、活跃程度以及是否伴发过敏性结膜炎等。

(2)对三组小鼠进行肺功能测定以评估各组小鼠气道高反应性(airwayhyperresponsiveness，AHR)。

小鼠的肺功能检测使用EMKA公司的无创的全身体积描记系统(WBP)进行，主要评价指标是Penh值。每组取10只小鼠进行肺功能评估。为了避免Mch对其他实验指标的影响，接受肺功能评估后的小鼠不再取材。按照仪器使用说明进行操作：小鼠放入观察笼内，适应环境3分钟后，分别给予0，3.125mg/ml，6.25mg/ml，12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml乙酰甲胆碱雾化，雾化时间为2分30秒，记录每一个浓度的雾化结束3分钟内的Penh值。

(3)免疫学指标检测用于评估建模成功与否以及免疫治疗是否有效

1)总IgE(total IgE，tIgE)检测

采用Abcam公司总IgE检测试剂盒，实验步骤严格按照说明书进行。

2)抗原特异性IgE(specific IgE)检测

实验步骤：

包被抗原，4℃过夜—洗板—1％BSA封闭，37℃，2h—洗板—加稀释受检血清，37℃，5h—洗板—加酶标抗抗体，37℃，5h—洗板—显色—终止反应—读板。

3)抗原特异性IgG1(specific IgG1，sIgG1)检测

实验步骤：

包被抗原，4℃过夜—洗板—1％BSA封闭，37℃，2h—洗板—加稀释受检血清，室温，1小时—洗板—加酶标抗抗体，室温，50分钟—洗板—显色—终止反应—读板。

4)抗原特异性IgG2a(specific IgG2a，sIgG2a)检测

同sIgG1检测。

5)Th1(T helper 1，Th1)和Th2(T helper 2，Th2)细胞因子检测

血清和BALF中Th1细胞因子IL-12p70和IFN-γ和Th2细胞因子IL-5和IL-13分别采用Abcam和eBioscience商业化试剂盒进行检测。实验过程严格按照说明书进行。

(4)组织病理学染色观察小鼠肺部炎症浸润和粘液分泌情况

HE染色

实验步骤：

1)取材：小鼠左肺上叶置于固定液(10％福尔马林)；

2)脱水：由低浓度到高浓度酒精脱水，再将组织块置于二甲苯；

3)包埋：将组织块置于溶化的石蜡包埋，冷却凝固成块；

4)切片：将蜡块固定于切片机切成5微米厚薄片，将薄片置于热水中烫平，置于载玻片，45℃烘干。

5)脱蜡：二甲苯脱蜡(二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min)→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min，即可染色；

6)HE染色：切片置于苏木精水溶液中染色数分钟；酸水及氨水中分色，各数秒；流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻；入70％和90％酒精中脱水各10分钟；入酒精伊红染色液染色2—3分钟；

7)脱水：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min；

8)透明：二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min)；

9)封片：中性树脂封固，盖上盖玻片封固；贴上标笺，切片标本就可使用。

AB-PAS染色

1)—5)同HE染色；

6)AB染液染色20分钟，水洗2min；

7)PAS染色液A试剂(高碘酸)染色5分钟，蒸馏水洗2min；

8)1％水乙酸泡6秒钟，水洗2min；

9)0.5％过碘酸浸泡15min，水洗2min；

10)PAS染液染色20min，水洗5min；

11)明矾苏木精染细胞核，5min，水洗2min；

12)脱水：同HE染色；

13)透明：同HE染色；

14)封片：同HE染色；

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和免疫印迹实验(immunoblot)

实验步骤：

1)制胶：5％浓缩胶6ml，12.5％分离胶30ml；

2)上样：样本浓度1μg/μl，上样量20μl；

3)电泳：浓缩胶电压80V，30min；分离胶电压150V，150min。

4)转膜(半干转)：电流恒定为1.5*膜面积(cm2)，时间60分钟；

5)染色：丽春红染色3min，甲醇脱色；

6)切条并编号1-20，以备用不同的血清孵育；

7)封闭：切条后放入甲醇5秒，取出后加入封闭液(5％牛奶)，室温封闭60分钟。

8)一抗孵育：10只模型组小鼠血清用5％牛奶(稀释1:4)，每孵育槽加入600μl血清，室温孵育2h；

9)洗涤：PBST洗3次，每次10分钟。

10)二抗孵育：二抗用5％牛奶稀释(1:1000)，每孵育槽加入600μl稀释二抗，室温孵育2h；

11)洗涤同前；

12)显色。

5、统计学方法

三组小鼠症状出现频率的差异的比较采用X²检验；三组小鼠肺功能指标的差异采用协方差分析的方式进行评估；三组样本之间均数差异显著性检验采用ANOVA分析，如果差异有显著性，采用LSD(方差齐)和Benferroni(方差不齐)方法进行两两比较。

二、研究结果

1、小鼠一般状态评估

过敏性哮喘小鼠表现出典型的过敏症状：头部低垂，聚集成簇，活动减少，毛发直立，点头呼吸，弓背直立，前肢蜷缩以及过敏性结膜炎。另外，几乎所有模型组小鼠精神状态都明显不如免疫治疗组和对照组。模型组20只小鼠都出现上述症状，而免疫治疗组仅个别小鼠出现症状，对照组无一只出现症状(见表1、图3)。

表1小鼠出现的症状以及每组出现症状的小鼠数量

对三组小鼠症状出现的频率进行X2检验，结果显示：免疫治疗组小鼠各项症状出现的频率明显低于模型组组(八项P＜0.05)(见图4)；但同对照组相比，免疫治疗组小鼠部分症状仍没有完全缓解(三项P＜0.05)(见图4)。

2、三组小鼠肺功能指标Penh

Mch在8.33426mg/ml下Penh的边际均值见表2。三组小鼠Penh值分别以Mch剂量依赖的方式逐渐升高(图5)。本实验中Mch是影响小鼠肺功能指标的协变量，采用协方差分析的方法将协变量(Mch)对因变量(肺功能Penh值)的影响从自变量(分组)中分离出去，再进一步分析分组对肺功能Penh值的影响。控制Mch因素的影响之后，三组之间肺功能Penh的差异有统计学显著性(P＝0.000)(表2)；模型组与对照组小鼠肺功能Penh值比较显示其明显高于对照组(P＝0.000)(表3)；免疫治疗组小鼠肺功能与模型组相比有明显缓解(P＝0.000)(表4)。

表2 Mch浓度在8.33426mg/ml下Penh的边际均值^#

#边际均值：指剔除其他变量影响时算出的均值，本实验Penh的边际均值指剔除Mch影响后的Penh值。

a该模型中出现的协变量用以下值进行评估:Mch浓度8.33426mg/ml。

表3模型组和对照组小鼠Penh组内差异的评估

协方差分析显示模型组和对照组小鼠Penh有显著差异(p＝0.000)。

a拟合度＝.703(调整后拟合度＝.698)

表4模型组和免疫治疗组小鼠Penh组内差异的评估

协方差分析显示模型组和免疫治疗组小鼠Penh有显著差异(p＝0.000).

a拟合度＝.518(调整后拟合度＝.511)

3、免疫学指标

(1)免疫治疗对血清tIgE、sIgE、sIgG1和sIgG2a水平的影响

与过敏性疾病和免疫治疗相关的参数有很多，血清sIgE，tIgE，sIgG1和sIgG2a均属于变应原特异性的免疫学指标。tIgE的检测采用Abcam商业化试剂盒，有标准曲线做参考，能检测出tIgE的具体浓度值(pg/ml)。sIgE，sIgG1和sIgG2a检测用ELISA板需自行包被抗原，无标准曲线可供参考，因此用OD值表示反应的强弱。

1)tIgE

模型组小鼠血清中tIgE表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，但明显低于免疫治疗组(P＜0.05)(图6)。

2)sIgE

模型组小鼠血清中sIgE表达水平同对照组相比明显增高(P＜0.05)与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图7)。

3)sIgG1

模型组小鼠血清中sIgG1表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，但明显低于免疫治疗组(P＜0.05)(图8)

4)sIgG2a

模型组小鼠血清中sIgG2a表达水平明显高于对照组(P＜0.05)但明显低于免疫治疗组(P＜0.05)(图9)。

(2)血清中的细胞因子

1)Th1细胞因子

模型组小鼠IL-12p70表达水平同对照组相比明显减低(P＜0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图10a)。

模型组IFN-γ表达水平同对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＝0.10)(图10b)。

2)Th2细胞因子

模型组小鼠IL-5表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图11a)。

模型组IL-13表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图11b)。

(3)BALF中细胞因子

1)Th1细胞因子

模型组小鼠BALF中IL-12p70表达水平明显低于对照组(P＜0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图12a)。

模型组与对照组相比IFN-γ表达水平无明显差异(P＞0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图12b)。

2)Th2细胞因子

模型组小鼠BALF中IL-5表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，与免疫治疗组相比差异无统计学显著性(P＞0.05)(图13a)。

模型组与对照组相比IL-13表达水平无明显差异(P＞0.05)，与免疫治疗组相比差异亦无统计学显著性(P＞0.05)(图13b)。

4、组织病理学改变

HE染色后镜下可见模型组小鼠肺部气管和血管周有大量炎症细胞浸润(图14a1)，对照组小鼠肺部无明显炎症反应(图14a3)。

AB-PAS染色后镜下可见模型组小鼠肺泡和支气管管腔中有大量粘液分泌(图14b1)。对照组小鼠肺泡和支气管管腔内未见粘液分泌(图14b3)。

免疫治疗组HE染色(图14a2)和AB-PAS染色(图14b2)相对模型组明显缓解。

5、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)和免疫印迹实验(immunoblot)

(1)SDS-PAGE

葎草花粉粗浸液SDS-PAGE可见主要蛋白分子量分布在～80、～70、～38、～30、～26、～15、～10kd(图15)。

(2)Immunoblot

10例小鼠血清均能识别葎草花粉变应原，～25kd和～38kd蛋白与葎草花粉变应原特异性IgE阳性反应最多，其中与～25kd蛋白结合的血清样本有7例(70％)，与～38kd蛋白结合的血清样本6例(60％)(图15)。其他分子量的变应原，如10-20kDa小分子量蛋白，25-35kDa中分子量蛋白以及50-80kDa高分子量蛋白与小鼠血清结合的阳性率较低(图16)。

实施例3：葎草花粉过敏性哮喘特异性免疫治疗小鼠模型制备：

一、实验材料和研究方法

1、研究对象

(1)动物准备

6-8周龄雌性BALB/c小鼠30只(SPF级),体重18～20g，由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

(2)分组建模

30只小鼠随机分成对照组，模型组，治疗组，每组10只。

对照组(如图17a)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠颈后皮下注射PBS200μl(1:1加入佐剂)

2)激发：第22-24天，雾化吸入PBS，连续3天，每天30min

3)治疗：从第25天开始，颈后皮下注射150ul PBS，隔天一次，总计8次。

4)再次激发：第43-49天，雾化吸入PBS，连续7天，每天30min。

模型组(如图17b)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠颈后皮下注射25μg葎草花粉变应原粗浸液(冻干葎草蛋白用PBS溶解，1:1加入佐剂，总计200μl)

2)激发：第22-24天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续3天，每天30min。

3)治疗：从第25天开始，颈后皮下注射PBS 150μl，一周一次，进行8次。

4)再次激发：第43-49天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续7天，每天30min.

治疗组(如图17c)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠颈后皮下注射25μg葎草花粉变应原粗浸液(冻干葎草蛋白用PBS溶解，1:1加入佐剂，总计200μl)

2)激发：第22-24天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续3天，每天30min。

3)治疗：从第25天开始，颈后皮下注射300ug葎草花粉变应原粗浸液2μg/μl,150μl)，隔天一次，进行8次。

4)激发：第43-49天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续7天，每天30min。

2、实验材料及仪器试剂

同前

3、标本采集

小鼠剪除口周胡须，倒控小鼠，摘除一侧眼球，用1.5ml EP管收集血液。400g,4℃离心10Min，取血清装入另外EP管，-80℃冻存备用。

(1)血清

同前

(2)BALF

同前

(3)BALF中的白细胞

BALF离心后的细胞沉淀用1ml PBS重悬,送检。

(4)肺脏

同前

(5)脾脏匀浆

切开小鼠左腹，摘取脾脏，放入研钵，加入5ml RIPA，研磨，待组织基本磨碎后，吸取研磨液，12000g离心10min,吸取上清，-80°冻存。

4、研究方法

1)观察雾化吸入时小鼠的一般状态

同前

2)WBP系统检测小鼠的肺功能

同前

3)小鼠血清中葎草特异性抗体(sIgE,sIgG1,sIgG2a)检测

同前

4)对BALF中的细胞做分类计数

同前

5)BALF和脾细胞匀浆液中细胞因子IL-4、IL-13、IFN-γ的检测细胞因子的检测使用eBiosciense的ELISA试剂盒，实验参照说明书进行。

6)HE和AB-PAS染色观察小鼠肺部炎症浸润和粘液分泌情况实验步骤同前。

病理切片的判读方法：

评估气道和血管周围炎症细胞的浸润采用5分制评分法进行计数：0无炎症细胞；1少量细胞；2单层的细胞环；3 2-4层的细胞环；4多于4层的细胞环。

为了评估气道黏液产生的程度，AB-PAS染色后，在200倍镜下，采用半定量的方法计数气道上皮中增生的杯状细胞占气道上皮细胞总数的比例。5分制评分法进行评分：0没有杯状细胞；1＜25％；2 5-50％；3 50-75％；4＞75％。

对每一个肺部切片观察至少3个不同视野，对杯状细胞和炎症细胞的数量进行评分。

5、统计学方法

数据用X±s表示，三组样本之间均数差异显著性检验采用ANOVA分析，如果差异有显著性，采用LSD(方差齐)和Benferroni(方差不齐)方法进行两两比较。当方差不齐时采用秩和检验，采用SPSS 19统计软件进行数据分析。认为P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

二、研究结果

1、小鼠雾化吸入时的一般状态评估

对照组：雾化后正常活动，无任何异常反应。

模型组:雾化开始后，小鼠开始频繁揉搓鼻子，躁动不安，身体瘙痒，搔抓。雾化结束后症状持续约20min恢复正常。

治疗组：雾化开始后，部分小鼠揉搓鼻子，搔抓，频率不高。雾化结束后很快恢复正常。

2、肺功能的检测结果：

模型组小鼠在雾化吸入Mch 6.25mg/ml时开始呼吸频率增加，躁动不安，抓挠笼壁等，随着Mch浓度的进一步升高，小鼠逐渐萎靡，活动减少，流涎、口唇发绀，点头呼吸，腹式呼吸明显。

治疗组小鼠在Mch浓度25mg/ml时开始出现呼吸频率的加快和躁动不安。雾化Mch浓度在12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml时，模型组的Penh值显著高于对照组(P＜0.01)，结合小鼠雾化时，小鼠的症状，可以判断模型组小鼠的气道反应性显著增高。治疗组的Penh值在Mch浓度12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml时明显低于模型组，差异有显著意义，症状也有明显的缓解，说明治疗降低了哮喘模型小鼠的气道高反应性。如图18。

对照组小鼠，在检测笼里活动自如，当雾化Mch 25mg/ml和50mg/ml时，出现轻微的躁动不安。

3、小鼠血清中葎草特异性抗体(sIgE,sIgG1,sIgG2a)浓度

模型组小鼠的sIgE的水平(211±49)ng/ml，显著高于对照组小鼠(P＜0.01)(图19)，说明本实验的致敏和激发方法可以成功诱导小鼠产生大量sIgE。治疗组小鼠的sIgE表达量为(59±19)ng/ml，相对于模型组，显著降低(P＜0.01)，说明脱敏治疗抑制了葎草花粉特异性IgE的产生。

模型组的sIgG1的表达量显著高于对照组(图20a)，说明葎草花粉致敏激发了小鼠的Th2型免疫应答。而治疗组的sIgG1表达量较模型组显著增高(图20a),说明反复的皮下注射脱敏治疗进一步增强了小鼠的Th2型免疫应答。模型组和治疗组的sIgG2a表达量都比对照组高(图20b)。同时，治疗组的sIgG2a水平也高于模型组，但差异没有统计学意义(图20b)。

4、BALF中细胞分类：

模型组BALF中的细胞数量白细胞(White blood cell,WBC)(3918±553)×10³/ml、嗜酸性粒细胞(Eosinophil，EOS)(2037±841)×10³/ml、中性粒细胞(Neutrophils，Neu)(1374±684)×10³/ml相比对照组的WBC(147±11)×10³/ml、EOS(1.46±1.44)×10³/ml、Neu(33.5±3.79)×10³/ml均显著增加(P＜0.01)(图21)，模型组小鼠BALF中EOS的比例(图22)是(51.3％±17.7％)，相比对照组也有显著差异(P＜0.01)。再次说明模型组小鼠的气道发生了严重的炎症反应，且炎症细胞的浸润以EOS为主，这符合典型哮喘病人的特点。治疗组小鼠的WBC和EOS数量相比模型组显著降低(P＜0.01)(图21)，EOS的比例也显著降低(P＜0.05)(图22)，说明脱敏治疗有效的抑制了气道炎症的发展，减少了细胞的浸润。

5.BALF和脾细胞匀浆液中细胞因子的检测

与对照组相比，模型组小鼠的BALF及脾匀浆液中的IL-4表达显著增加(图23、图24)，BALF中的IL-13也显著增加(如图23)，脾匀浆中的IL-13表达虽有增加(图24)，但差异没有统计学意义。模型组小鼠BALF和脾匀浆液中的INF-γ显著降低(图25、26)。Th2类的细胞因子(IL-4、IL-13)的表达增加，Th1类的细胞因子INF-γ表达降低，说明葎草花粉蛋白的致敏使小鼠的Th2型免疫反应增强，Th1型免疫反应降低。

治疗组小鼠BALF中的Th2类的细胞因子IL-4、IL-13均显著低于模型组，而Th1类的细胞因子INF-γ显著增加。治疗组的脾匀浆中IL-4、IL-13表达低于模型组，但差异不显著，而INF-γ显著高于模型组。这些整体说明脱敏治疗纠正了哮喘模型小鼠的Th1/Th2免疫失衡，使免疫应答向Th1类型转换。

脱敏治疗后，BALF和脾匀浆液中的IL-10含量相对于模型组，都有降低，其中脾匀浆液中的降低有显著差异(图27)。

6、组织病理学染色观察小鼠肺部炎症浸润和粘液分泌情况

HE染色观察小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润HE染色后镜下可见对照组小鼠无明显炎症反应(如图28a,28b)。模型组小鼠气管和血管周有大量炎症细胞浸润，气道增厚、严重水肿(如图29a,29b)，治疗组也有炎症细胞浸润，但数量相对较少，气道有增厚，但无严重水肿(如图30a,30b)。

AB-PAS染色后，对照组小鼠肺泡和支气管管腔内未见明显粘液分泌(如图31a，31b)。模型组气道壁广泛被染成蓝紫色，气道内也可以看到弥散的蓝紫色物质，说明气道出现大量杯状细胞化生，粘液分泌过度(如图32a，32b)。治疗组气道壁少量细胞染成蓝紫色，说明部分细胞粘液分泌增加(如图33a，33b)。

7、小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和黏液分泌评分

分别采用5分制评分方法对气道和血管周围的炎症细胞浸润和气道上皮中杯状细胞(goblet)所占比例进行评分，结果如图34所示，模型组的炎症细胞浸润及杯状细胞增生数均显著高于对照组(P＜0.01)，治疗组的炎症细胞浸润显著少于模型组组(P＜0.01)，而goblet数也显著低于模型组(P＜0.05)。

实施例4比较小鼠皮下注射致敏和腹腔注射致敏区别

一、实验材料和研究方法

1、研究对象

(1)动物准备

6-8周龄雌性BALB/c小鼠40只(SPF级),体重18～20g，由中国军事医学科学院提供，北京协和医院动物房饲养，无菌自由饮食。饲养环境：温度22-25℃；湿度：40-60％。

(2)分组建模

40只小鼠随机分为皮下致敏组(PX-M)，腹腔致敏组(FQ-M)，皮下致敏对照组(PX-D)，腹腔致敏对照组(FQ-D)，每组10只。

皮下致敏组(PX-M)(如图35a)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，颈后两前臂间皮下注射葎草花粉变应原粗浸液25μg(0.25μg/μl，100μl)，1:1加入佐剂。

2)激发：第21-27天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续7天，每天30min.腹腔致敏组(FQ-M)(如图35b)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对对每只小鼠异氟烷麻醉后，腹腔注射葎草花粉变应原粗浸液300μg(2μg/μl,150μl),1:1加入佐剂。

2)激发：第21-27天，雾化吸入1％的葎草蛋白，连续7天，每天30min.皮下致敏对照组(PX-D)(如图35c)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠异氟烷麻醉后，颈后两前臂间皮下注射PBS 100μl，1:1加入佐剂。

2)激发：第21-27天，雾化吸入PBS，连续7天，每天30min。

腹腔致敏对照组(FQ-D)(如图35d)

1)致敏：分别于第1天、第8天和第15天对每只小鼠腹腔注射150μl PBS，1:1加入氢氧化铝佐剂。

2)激发：第21-27天，雾化吸入PBS，连续7天，每天30min。

第28天，对所有小鼠做肺功能检测，第29天取材。

2、标本采集

血清、BALF、BALF中的白细胞、肺脏、脾脏匀浆标本的采集均同前。

3、研究方法

1)观察小鼠的一般状态

同前

2)测定小鼠的肺功能

实验步骤同前。

3)用ELISA的方法检测小鼠血清中的葎草特异性IgE(sIgE)

实验步骤同前。

4)BALF中的细胞分类计数

5)BALF和脾细胞匀浆液中细胞因子IL-4、IL-13、IL-10、INF-γ的检测

细胞因子的检测使用eBiosciense的ELISA试剂盒，实验参照说明书进行。

6)HE及AB-PAS染色

实验步骤同前

7)聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹实验检测葎草致敏小鼠血清中的致敏蛋白

实验步骤同前

二、研究结果

1.小鼠一般状态评估

FQ-M和PX-M组小鼠在每次雾化10min后，小鼠开始频繁揉搓鼻子，身体瘙痒，搔抓，呼吸急促。雾化结束后大约20min恢复正常。FQ-D、PX-D组雾化后无任何异常反应。

2.气道反应性检测：

FQ-D和PX-D小鼠，在检测笼里活动自如，当雾化Mch 25和50mg/ml的浓度时，出现轻微躁动。FQ-M和PX-M组小鼠在雾化吸入Mch 6.25mg/ml时开始出现呼吸频率增加，躁动不安，抓挠笼壁，随着Mch浓度的进一步升高，小鼠逐渐萎靡，活动减少，流涎、口唇发绀，点头呼吸，腹式呼吸明显。

从Penh结果来看，雾化Mch浓度在6.25mg/ml，12.5mg/ml，25mg/ml，50mg/ml时，FQ-M和PX-M组的Penh值都显著高于各自的对照组，PX-M组的Penh值稍高于FQ-M组，但没有显著差异(图36)。

3.抗原特异性IgE(specific IgE)检测

FQ-M组小鼠的sIgE的表达量相比FQ-D组有轻微升高，但差异无统计学意义；PX-M组小鼠血清中葎草花粉sIgE的滴度是(216±39)ng/ml，显著高于PX-D组小鼠(P＜0.01)，同时也显著高于FQ-M组(P＜0.01)。说明皮下致敏的方式相较于腹腔致敏可以诱导小鼠产生更多的的葎草花粉sIgE(图37)。

4、BALF中细胞分类计数

BALF中细胞分类计数的结果(图38)显示：腹腔致敏和皮下致敏使BALF中出现了大量的炎症细胞浸润，WBC、EOS、NEU数量均显著高于对照组(P＜0.01)，说明葎草花粉致敏诱导出了气道的炎症反应。FQ-M组炎症细胞的总数高于PX-M组，但没有显著差异(P＞0.05),细胞浸润以中性粒细胞为主。PX-M组虽然炎症细胞总数相对FQ-M组稍少，但嗜酸细胞数量和比例(图38、图39)都显著高于FQ-M组(P＜0.01)，而EOS的浸润正是人类过敏性哮喘的标志之一。

5.BALF和脾细胞匀浆液中细胞因子IL-4、IL-13、INF-γ、IL-10的检测

与FQ-D组相比，FQ-M组小鼠的BALF及脾匀浆液中的IL-4表达都有增加，但差异没有显著意义(图40、图41)。BALF中IL-13显著增加(P＜0.01)(图40)，但脾匀浆液中IL-13表达仅有少量增加(图41)。而PX-M组小鼠BALF中IL-4和IL-13表达量相对于PX-D组都显著增加(P＜0.01)(图40)。特别是PX-M组的IL-4的表达相对于FQ-M组也显著增加(P＜0.05)(图40)。上述细胞因子表达差异可能是导致PX-M组sIgE表达量显著高于FQ-M组的重要因素。而BALF和脾匀浆液中的INF-γ表达量(图42、图43)，和各自的对照组相比，无论是FQ-M组还是PX-M组均没有显著的变化。

普遍认为IL-10在过敏性哮喘发病过程中是一种保护性的细胞因子。在本实验中，FQ-M组和PX-M组小鼠BALF中IL-10的含量相对于各自的对照组都有显著性提高(P＜0.05)(图44)。FQ-M组和PX-M组之间表达没有差异。FQ-M组和PX-M组小鼠脾匀浆中IL-10的含量相对于各自的对照组也有升高，但差异不显著(P＞0.05)(图44)。

6、组织病理学改变

(1)HE和AB-PAS染色

HE染色观察小鼠肺部嗜酸性粒细胞浸润

FQ-D和PX-D组小鼠肺部均无明显炎症反应(如图45a、45b,47a、47b).FQ-M和PX-M组小鼠肺部气管和血管周都有很多炎症细胞浸润(图46a、46b、48a、48b)，FQ-M组相比于PX-M组，浸润的炎症细胞数量更多(图46a、46b)。但PX-M组有更严重的气道壁水肿、增厚，气道破坏(图48a、48b)。

AB-PAS染色观察小鼠肺部粘液分泌情况

FQ-D和PX-D组小鼠肺泡和支气管管腔内未见明显粘液分泌(图49a、49b，51a、51b)。FQ-M组气道壁有部分细胞染成蓝紫色(图50a、50b)，说明气道内粘液分泌增加。PX-M组气道壁大量细胞呈蓝紫色，(图52a、52b)，说明气道出现大量杯状细胞化生，粘液分泌过度。

(2)小鼠肺组织中炎症细胞的浸润和黏液分泌评分

分别采用5分制评分方法对气道和血管周围的炎症细胞浸润和气道上皮中杯状细胞所占比例进行评分，PX-M和FQ-M组的炎症细胞浸润及杯状细胞增生数均显著高于各自的对照组(P＜0.01)，PX-M组的炎症细胞浸润数少于FQ-M组，而goblet数多于FQ-M组，但都没有显著差异(图53)。

7、免疫印迹实验(immunoblot)

免疫印迹实验的结果显示(图54)：20例小鼠：10例PX-M组(1-10)，10例FQ-M组(11-20)血清均能识别葎草花粉变应原，大部分反应条带位于75kd-63kd之间。PX-M组和FQ-M组的反应条带没有明显区别。值得注意的是，人类葎草过敏的主要致敏蛋白nHumj3,大小约10kd，但绝大部分葎草致敏的小鼠与葎草的10kd片段都没有反应。说明引起人类葎草花粉过敏的蛋白组分和小鼠是不一样的。

通过上述实施例2-4中的对比试验，可以得出本发明最佳的小鼠模型的建立方法是：包括步骤：

第一步:分别于第1天、第8天和第15天对BALB/c小鼠颈后皮下各注射25μl、1μg/μl的葎草花粉变应原粗浸液对小鼠致敏；

第二步：第22-24天，雾化吸入1％的葎草花粉变应原粗浸液激发，连续3天，每天30min；

第三步：第25天开始，颈后皮下注射300μg的葎草花粉变应原粗浸液脱敏，隔天一次，共8次；

第四步：第43-49天，雾化吸入1％的葎草花粉变应原粗浸液再次激发，连续7天，每天30min；造模成功。

采用上述方法和精制的葎草花粉变应原，可以最大程度保证葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型的成功建立，为研究葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗作用机制从而改进免疫治疗方法提供良好的载体。