软骨寡聚基质蛋白作为标志物在诊断腹主动脉瘤或动脉夹层中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及软骨寡聚基质蛋白作为标志物在诊断腹主动脉瘤或动脉夹层中的应用。

背景技术

腹主动脉瘤指直径达到正常毗邻动脉段1.5倍以上的永久性局限性腹主动脉扩张病变。动脉内膜局部撕裂，血流冲击进入内、中膜分层间，则称为动脉夹层。当主动脉内膜局部撕裂，血流冲击进入内、中膜分层间，则称为主动脉夹层。腹主动脉瘤或主动脉夹层常见于老年人，尤其是男性，随着年龄的增长发病率逐渐上升，可高达8-10％。腹主动脉瘤或主动脉夹层早期发病具有高度的隐匿性，尚未破裂往往缺乏临床表现，一经破裂又常常回天乏力，死亡率大于90％。相关的发病机制和危险因素至今尚不完全清楚，因此缺乏有效的早期筛查和诊断方法。

腹主动脉瘤或主动脉夹层的治疗目前以手术为主，动脉瘤直径大于5.5厘米是现有决定是否采用外科手术和手术时机的唯一指针，但事实上，60％的急性主动脉夹层发生在动脉瘤直径为5.5厘米以下的患者，可见，如何选择精准的手术时机，有效减少患者死亡率是临床面临的巨大挑战。早期筛查诊断对于防治腹主动脉瘤或主动脉夹层有重要意义。目前超声检查、CT和MRI是筛查腹主动脉瘤或主动脉夹层的主要手段，然而由于受到医疗条件和成本的限制，通过上述方法进行大规模的早期筛查防治不够方便快捷。

检测疾病特异相关的生物标志物是快速筛查疾病实现早期诊断早期治疗的有效手段，比如：检测甲胎蛋白广泛应用于肝癌的筛查。目前多项针对腹主动脉瘤或主动脉夹层患者的血清分子水平筛查研究发现，基质金属蛋白酶(MMP-9)、α1-蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystain C)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、I型纤维溶酶原抑制剂(PAI)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL1β、IL6等在腹主动脉瘤或主动脉夹层患者的血清中呈现显著变化，与腹主动脉瘤或主动脉夹层的发生发展相关：MMP-9、α1-蛋白酶、cystain C均可调控腹主动脉瘤或主动脉夹层的主要病理变化，但研究中所涉及的患者数在40-70名左右，因此如将MMP-9或α1-蛋白酶或cystain C作为生物标志物应用，需要更大量样本数的研究进行验证；对于t-PA、PAI、MIF、TNF等已有研究发现的血栓和炎症相关的分子，尽管血栓形成和炎症预示腹主动脉瘤或主动脉夹层病程的进展，但是其它系统的炎症疾病或血栓性疾病也存在类似的病理变化，因此这些分子作为生物标志物在诊断疾病方面存在特异性不高的缺陷。因此，迫切需要更为特异的生物标志物辅助诊断腹主动脉瘤或主动脉夹层。

软骨寡聚基质蛋白(Cartilage Oligomeric Matrix Protein，COMP)是一种由五个亚单位形成五聚体结构的细胞外基质蛋白，分子量为524kDa。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测软骨寡聚基质蛋白的物质在制备辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层的产品中的应用。所述产品可为试剂盒或试纸。

用于检测软骨寡聚基质蛋白的物质在辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述“用于检测软骨寡聚基质蛋白的物质”可为检测所述软骨寡聚基质蛋白的浓度的物质。

上述应用中，所述“检测所述软骨寡聚基质蛋白的浓度的物质”具体可为美国RD公司生产的Human COMP Quantikine ELISA Kit，产品目录号为DCMP0(详见网址：https://www.rndsystems.com/cn/products/human-comp-quantikine-elisa-kit_dcmp0)。

上述应用中，所述动脉夹层可为主动脉夹层。

上述任一所述的应用中，所述软骨寡聚基质蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)在a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

a4)氨基酸序列为部分a1)序列的结构域或片段的蛋白肽段。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层的产品。

本发明所提供的辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层的产品，可包括用于检测软骨寡聚基质蛋白的物质。所述产品可为试剂盒或试纸。

上述产品中，所述“用于检测软骨寡聚基质蛋白的物质”可为检测所述软骨寡聚基质蛋白的浓度的物质。

上述产品中，所述“检测所述软骨寡聚基质蛋白的浓度的物质”具体可为美国RD公司生产的Human COMP Quantikine ELISA Kit，产品目录号为DCMP0(详见网址：https://www.rndsystems.com/cn/products/human-comp-quantikine-elisa-kit_dcmp0)。

上述产品中，所述产品还可包括记载有判断标准甲的载体和/或记载有判断标准乙的载体；所述判断标准甲为：如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度低于163ng/mL，则所述待测者为或疑似为腹主动脉瘤患者；如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度高于163ng/mL，则所述待测者不为或疑似不为腹主动脉瘤患者或动脉夹层患者；所述判断标准乙为：如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度低于120ng/mL，则所述待测者为或疑似为动脉夹层患者；如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度高于120ng/mL，则所述待测者不为或疑似不为动脉夹层患者。

上述产品中，所述产品还可包括记载有如下判断标准丙的载体；所述判断标准丙为：如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度低于对照血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度，则所述待测者为或疑似为腹主动脉瘤患者或动脉夹层患者；如果待测者血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度高于对照血浆中所述软骨寡聚基质蛋白的浓度，则所述待测者不为或疑似不为腹主动脉瘤患者或动脉夹层患者；所述对照血浆为非腹主动脉瘤患者和/或非动脉夹层患者的血浆。

所述对照血浆具体可为下肢动脉硬化的患者的血浆。

上述产品中，所述动脉夹层可为主动脉夹层。

上述产品中，所述软骨寡聚基质蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)在a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

a4)氨基酸序列为部分a1)序列的结构域或片段的蛋白肽段。

所述软骨寡聚基质蛋白作为标志物在开发诊断腹主动脉瘤或动脉夹层的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，利用本发明所提供的试剂盒可辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层，具有较高的准确率，对辅助诊断腹主动脉瘤或动脉夹层具有重要的应用价值。

附图说明

图1为腹主动脉瘤患者和下肢动脉硬化患者的COMP的含量。其中Control为下肢动脉硬化患者；AAA为腹主动脉瘤患者。

图2为主动脉夹层患者和下肢动脉硬化患者的COMP的含量。其中Control为下肢动脉硬化患者；AD为主动脉夹层患者。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的各个实验均是在患者的知情同意的前提下进行的，且均签署知情同意书，并经北京大学医学部伦理委员会批准后，进行实验。

软骨寡聚基质蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

Human COMP Quantikine ELISA Kit为美国RD公司的产品，产品目录号为DCMP0，(详见网址：https://www.rndsystems.com/cn/products/human-comp-quantikine-elisa-kit_dcmp0)。

实施例1、COMP在辅助诊断腹主动脉瘤中的应用

一、病例的选择

由经专门培训的中日友好医院血管外科医务人员、北京301医院血管外科医务人员和北京大学基础医学院生理学专业的博士研究生负责资料收集和质量控制。以中日友好医院和北京301医院为基础的1:1匹配病例对照研究，匹配条件为性别相同，年龄相差2岁以内，临床上通过超声或CT检查诊断为腹主动脉瘤患者77人(其中男性为59人，占76.63％)，平均年龄为66.19±9.79岁。以北京301医院与动脉瘤无关的下肢动脉硬化患者77人作为对照(其中男性为59人，占76.63％)。要求病例和对照均无精神疾病，思维清晰，能理解提问并清楚回答问题，愿意配合。

将上述77个腹主动脉瘤患者作为病例组，77个腹主动脉瘤患者均满足病例组的排除标准和病例组的纳入标准。将上述77个下肢动脉硬化患者作为对照组，77个下肢动脉硬化患者均满足对照组的排除标准和对照组的纳入标准。各标准具体如下：

(1)病例组纳入标准

在中日友好医院或北京301医院血管外科诊断为腹主动脉瘤的患者，年龄大于40岁。

(2)病例组排除标准

骨性关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)疾病患者；滑膜炎患者；软骨发育不全患者；曾发生过脑卒中或冠心病的患者等。

(3)对照组纳入标准

在北京301医院血管外科诊断为下肢动脉硬化的患者，年龄大于40岁。下肢动脉硬化与腹主动脉瘤无交叉影响关系，故可纳入。

(4)对照组排除标准

骨性关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)疾病患者；滑膜炎患者；软骨发育不全患者；曾发生过脑卒中或冠心病的患者等。

二、研究内容

1、调查病例组和对照组的人口学特征资料

包括人口学资料(如姓名、性别、年龄或出生日期)，生活饮食习惯(如吸烟、饮酒)、病史资料(如既往高血压、糖尿病、冠心病)。

2、病例组和对照组的生化检查指标分析

(1)测量病例组和对照组的血压、心率和体质指数(BMI)。

(2)分别取77个腹主动脉瘤患者和77个下肢动脉硬化患者的外周血5mL，置于EDTA抗凝管中，然后2000×g离心15min，收集血浆。然后分别检测所述血浆中血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和COMP的浓度；其中血糖为空腹血糖(即标本提供者需空腹条件下采集外周血)，检测血浆中COMP的浓度采用Human COMP Quantikine ELISA Kit进行。

3、统计学方法

将上述步骤1和2获得的全部资料用SPSS 19.0统计软件分析，先进行单因素分析，计量资料采用配对wilcoxon秩和检验分析，计数资料采用卡方检验(Chi-square test)；再将单因素分析筛选的有意义的变量列入二分类Logistic回归分析模型。采用相对危险度的近似估计值比数比(OR)估计各种危险因素与腹主动脉瘤的联系强度。检验水准α＝0.05。

研究结果见表1、表2、表3、表4和图1。表1为病例组和对照组的人口学特征资料的调查结果。表2为病例组和对照组的生化检查指标分析结果。表3为Logistic回归分析。表4为病例组和对照组的COMP的含量。结果如下：

(1)吸烟、饮酒、高血压、冠心病与否与是否患腹主动脉瘤差异无统计学意义；

(2)腹主动脉瘤患者的体质指数、心率、血糖、总胆固醇含量、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等，与对照组相比差异无统计学意义；

(3)腹主动脉瘤患者中患糖尿病的有7人，占9.1％，而对照组中患糖尿病的有34人，占44.2％，与对照组相比，糖尿病与否与腹主动脉瘤患病有关(P<0.05)；

(4)腹主动脉瘤患者的血浆中COMP浓度明显低于对照组。采用Wilcoxon秩检验可知，腹主动脉瘤患者与对照组的COMP浓度差异有统计学意义(P<0.001)；

(5)病例组中，54个腹主动脉瘤患者的血浆中COMP浓度低于163ng/mL；对照组中，49个下肢动脉硬化患者的血浆中COMP浓度高于163ng/mL。

为了排除其它影响因素的干扰，根据四分卫间距将COMP的浓度分为四段：COMP浓度≤100ng/mL、100ng/mL<COMP浓度≤150ng/mL、150ng/mL<COMP浓度≤250ng/mL和COMP浓度>250ng/mL，然后纳入二分类logistics回归分析。结果表明，150ng/mL<COMP浓度≤250ng/mL、100ng/mL<COMP浓度≤150ng/mL和COMP浓度≤100ng/mL的患者患腹主动脉瘤的风险分别为COMP浓度>250ng/mL的患者的9.847倍、14.392倍和6.719倍。因此，COMP的浓度与腹主动脉瘤与否有密切联系，可辅助诊断腹主动脉瘤。

表1

注：△为配对因素

表2

注：采用两配对样本的Wilcoxon秩和检验；△为配对因素；TC为总胆固醇；TG为甘油三酯；HDL为高密度脂蛋白；LDL为低密度脂蛋白。

表3

表4

实施例2、COMP在辅助诊断主动脉夹层中的应用

一、病例的选择

由经专门培训的北京301医院血管外科医务人员和北京大学基础医学院生理学专业的博士研究生负责资料收集和质量控制。以北京301医院为基础的1:1匹配病例对照研究，匹配条件为性别相同，年龄相差2岁以内，临床上诊断为主动脉夹层52人(其中男性为44人，占84.6％)，平均年龄为60.02±11.13岁。以北京301医院与动脉瘤无关的下肢动脉硬化患者52人作为对照(其中男性为44人，占84.6％)。要求病例和对照均无精神疾病，思维清晰，能理解提问并清楚回答问题,愿意配合。

将上述52个主动脉夹层患者作为病例组，52个主动脉夹层患者均满足病例组的排除标准和病例组的纳入标准。将上述52个下肢动脉硬化的患者作为对照组，52个下肢动脉硬化的患者均满足对照组的排除标准和对照组的纳入标准。各标准具体如下：

(1)病例组纳入标准

在北京301医院血管外科诊断为主动脉夹层的患者，年龄大于40岁。

(2)病例组排除标准

骨性关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)疾病患者；滑膜炎患者；软骨发育不全患者；曾发生过脑卒中或冠心病的患者等。

(3)对照组纳入标准

在北京301医院血管外科诊断为下肢动脉硬化的患者，年龄大于40岁。下肢动脉硬化与主动脉夹层无交叉影响关系，故可纳入。

(4)对照组排除标准

骨性关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)疾病患者；滑膜炎患者；软骨发育不全患者；曾发生过脑卒中或冠心病的患者等。

二、研究内容

1、调查病例组和对照组的人口学特征资料

包括人口学资料(如姓名、性别、年龄或出生日期)，生活饮食习惯(如吸烟、饮酒)、病史资料(如既往高血压、糖尿病、冠心病)。

2、病例组和对照组的生化检查指标分析

(1)测量病例组和对照组的血压、心率和体质指数(BMI)。

(2)分别取52个主动脉夹层患者和52个下肢动脉硬化患者的外周血5mL，置于EDTA抗凝管中，然后2000×g离心15min，收集血浆。然后分别检测所述血浆中血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和COMP的浓度；其中血糖为空腹血糖(即标本提供者需空腹条件下采集外周血)，检测血浆中COMP的浓度采用Human COMP Quantikine ELISA Kit进行。

3、统计学方法

将上述步骤1和2获得的全部资料用SPSS 19.0统计软件分析，先进行单因素分析，计量资料采用配对wilcoxon秩和检验分析，计数资料采用卡方检验(Chi-square test)，再将单因素分析筛选的有意义的变量列入二分类Logistic回归分析模型。采用相对危险度的近似估计值比数比(OR)估计各种危险因素与主动脉夹层的联系强度。检验水准α＝0.05。

研究结果见表5、表6、表7、表8和图2。表1为病例组和对照组的人口学特征资料的调查结果。表2为病例组和对照组的生化检查指标分析结果。表3为Logistic回归分析。表4为病例组和对照组的COMP的含量。结果如下：

(1)饮酒、高血压、冠心病与否与是否患主动脉夹层，差异无统计学意义；

(2)主动脉夹层患者的体质指数、心率、血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白等，与对照组相比差异无统计学意义；

(3)主动脉夹层中患糖尿病的有4人，占7.7％，而对照组中患糖尿病的有20人，占38.5％，与对照组相比，糖尿病与否与主动脉夹层患病有关(P<0.05)；

(4)吸烟与否与是否患动脉夹层，差异有统计学意义(P<0.05)；

(5)总胆固醇含量和低密度脂蛋白，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；

(5)主动脉夹层患者的血浆中COMP浓度明显低于对照组。采用Wilcoxon秩检验可知，主动脉夹层患者与对照组的COMP浓度差异有统计学意义(P<0.001)；

(6)病例组中，33个主动脉夹层患者的血浆中COMP浓度低于120ng/mL；对照组中，40个下肢动脉硬化患者的血浆中COMP浓度高于120ng/mL。

为了排除其它影响因素的干扰，根据四分卫间距将COMP的浓度分为三段：COMP浓度≤100ng/mL、100ng/mL<COMP浓度≤180ng/mL和COMP浓度>180ng/mL，然后纳入二分类logistics回归分析。结果表明，100ng/mL<COMP浓度≤180ng/mL和COMP浓度≤100ng/mL的患者患主动脉夹层的风险分别为COMP浓度>180ng/mL的患者的7.276倍和4.765倍。因此，COMP的浓度与主动脉夹层与否有密切联系，即辅助诊断主动脉夹层。

表5

注：△为配对因素

表6

注：采用两配对样本的Wilcoxon秩和检验；△为配对因素；TC为总胆固醇；TG为甘油三酯；HDL为高密度脂蛋白；LDL为低密度脂蛋白。

表7

表8