一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法

技术领域

本发明涉及一种试验方法，具体是一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法。

背景技术

镉是目前已知的最易在生物体中蓄积的毒物之一，少量的镉进入机体后就会直接或间接地破坏蛋白质、DNA等，导致细胞坏死或凋亡，对肾、肝、肺、骨骼以及大脑等造成极大的损伤，并且有一定的致畸、致癌和致突变的危害。镉的半衰期长达20-30年，因此对人体还存在着许多潜在的危害。目前的排镉方式主要包括化学排镉和中药排镉等方法，主要采用乙二胺四乙酸(EDTA)类金属螯合剂或而巯基丁二酸(DMSA)类竞争性解毒剂。

金属硫蛋白可由金属离子诱导并在机体的不同组织中表达，为细胞提供最基本的保护，其通过抑制细胞内外源性非必须金属元素与体内其他蛋白的非特异性结合，从而降低非必须金属元素对生物体的毒性作用，并与其他功能蛋白中的非必须金属离子结合以达到清除机体内重金属的作用。目前普遍认为金属硫蛋白对重金属离子的解毒机制主要有两个方面，一是结合机体中的重金属离子从而减少游离的重金属元素以达到直接解毒的作用，二是通过修复重金属对机体的损伤从而达到解毒的效果。

金属硫蛋白的市场需求量逐年增大，但由于其提取技术难度大且产率较低，所以市面上动物源的金属硫蛋白普遍价格昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法，具体步骤如下：

(1)提取小球藻类金属硫蛋白：对普通海洋小球藻用100μg·mL^-1葡萄糖酸锌进行胁迫培养3天，离心收集藻细胞，经反复冻融三次并结合超声波细胞破碎，使藻细胞破碎率达到70％以上；利用Φ4.5×70cm的葡聚糖凝胶柱G-75，以10mmol·L^-1Tris-HCl为流动相，按3.0mL·min^-1的流速进行洗脱，以兔肝金属硫蛋白为对照，收集目标组分、冻干；用Φ4.5×70cm的葡聚糖凝胶G-25层析柱进行脱盐，以3.0mL·min^-1的超纯水进行洗脱，收集目标蛋白组分并冻干，蛋白纯度95％以上；

(2)用液质联用SEC-ICP-MS的方法证明小球藻类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合作用：将小球藻锌结合类金属硫蛋白分别配制成0.6、0.3、0.1mgmL^-1三个浓度，在每个浓度水平中加入500ng·L^-1的Cd²⁺，室温下通过垂直旋转混匀仪混匀反应30min，反应液经7.8mmi.d.×300mm，6μm的体积排阻色谱TSKgel-G3000PWXL-色谱柱分离，分离组分在线导入电感耦合等离子体质谱ICP-MS，同时监测锌和镉的信号强度，通过比较锌和镉的信号位置和信号强度变化说明螯合作用；

(3)在模拟胃液环境中小球藻类金属硫蛋白对镉的螯合实验：

用模拟胃液配制含100ng·L^-1的Cd²⁺的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟胃液配制含0-20μg·mL^-1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd²⁺的塑料离心管内；于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd²⁺浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率；

另配制含10-200ng·L^-1不同Cd²⁺浓度的模拟胃液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟胃液配制10μg·mL^-1的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，并分别往各透析袋中加入2mL该蛋白溶液，然后将透析袋置于塑料离心管内；将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd²⁺浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率；

(4)在模拟肠液环境中小球藻类金属硫蛋白对镉的螯合实验：

用模拟肠液配制含100ng·L^-1的Cd²⁺的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟肠液配制含0-20μg·mL^-1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd²⁺的塑料离心管内，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd²⁺浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率；

另配制含10-200ng·L^-1不同Cd²⁺浓度的模拟肠液，分装于塑料离心管中，每管30mL；用模拟肠液配制10μg·mL^-1的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，并分别往各透析袋中加入2mL该蛋白溶液，然后将透析袋置于塑料离心管内，将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，于37℃水浴震荡10h，通过测定透析袋外缓冲液中Cd²⁺浓度的变化，计算小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率。

作为本发明进一步的方案：所述Tris-HCl的pH值为7.5，Tris-HCl中含1mmol·L^-1二硫苏糖醇。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤(1)提取的锌结合类金属硫蛋白经红外光谱、圆二色光谱和电泳表征具有典型的金属硫蛋白特征，每个蛋白分子结合7个锌原子，蛋白质分子由80个氨基酸组成，占氨基酸总数的15％；经蛋白质质谱分析，小球藻类金属硫蛋白具有哺乳动物金属硫蛋白的结构特征。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明中小球藻是一类在地球上分布极为广泛的单细胞微藻，为理想的蛋白资源，来源广泛、价格低廉，经锌胁迫诱导后合成具有与金属硫蛋白相似结构特征的类金属硫蛋白，通过锌胁迫小球藻产生类金属硫蛋白，进行重金属镉的螯合试验，对进一步开发小球藻类金属硫蛋白作为镉的解毒剂具有重要意义。

附图说明

图1为本发明中小球藻Zn-MT-like与MT标准品的红外吸收光谱。

图2为本发明中小球藻Zn-MT-like与MT标准品的圆二色光谱图。

图3为本发明中小球藻Zn-MT-like和MT的SDS-PAGE分析。

图4为本发明中为小球藻Zn-MT-like对镉的螯合作用图。

图5为本发明中为小球藻Zn-MT-like对镉的螯合作用对照图。

图6为本发明中为小球藻Zn-MT-like经SEC-ICP-MS色谱图。

图7为本发明中表示不同浓度小球藻Zn-MT-like在模拟胃液环境中对Cd²⁺的螯合率。

图8为本发明中表示不同浓度小球藻Zn-MT-like在模拟肠液环境中对Cd²⁺的螯合作用。

图9为本发明中表示小球藻Zn-MT-like在不同Cd²⁺浓度的模拟肠液环境中对Cd²⁺的螯合率。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-8，一种小球藻锌结合类金属硫蛋白体外螯合镉的试验方法，具体步骤如下：

一、小球藻类金属硫蛋白提取的实验方法，包括以下步骤：

对普通海洋小球藻用100μg·mL^-1葡萄糖酸锌进行胁迫培养3天，离心收集藻细胞，经反复冻融三次并结合超声波细胞破碎，使藻细胞破碎率达到70％以上。利用葡聚糖凝胶柱G-75(Φ4.5×70cm)以10mmol·L^-1Tris-HCl(pH7.5，含1·mmolL^-1二硫苏糖醇)为流动相按3.0mL·min^-1的流速进行洗脱，以兔肝金属硫蛋白为对照，收集目标组分、冻干。用葡聚糖凝胶G-25(Φ4.5×70cm)层析柱进行脱盐，以3.0mL·min^-1的超纯水进行洗脱，收集目标蛋白组分并冻干，蛋白纯度达95％以上。经红外光谱(图1所示)、圆二色光谱(图2所示)、电泳(图3所示)等表征该蛋白具有典型的金属硫蛋白特征，每个蛋白分子可结合7个锌原子(如表1所示)，蛋白质分子由80个氨基酸组成，占氨基酸总数的15％(如表2所示)。经蛋白质质谱分析，小球藻类金属硫蛋白具有哺乳动物金属硫蛋白的结构特征(如表3所示)。

表1、蛋白质分子中锌含量的测定结果

表2、氨基酸组成

表3小球藻锌结合类金属硫蛋白蛋白质序列

蛋白质序列如下：

MPSSLRNKSFSPERFSKEAKQTHCCRHTQQVPRRVQQGFPWASSQFEKEEAVGFRMETNLATKCVKCGPGYSTPLEAMKGPREEIIYLPCIYRNTGIEAPDYLATVDVNPRSPQYCQVIHRLPMPYLKDELHHSGWNTCSSCFGDSTKSRNMLVLPCLISSRVYVVDVASEPRAPKLHKVIEAKEIQDKCGLSYLHTSHCLASGEVMISTLGDPKGNGKGGFVLLDGETFEVKGTWQRPGGEAPLGYDFWYQPRHNVMISTEWAAPNVLRDGFNPADVEAGLYGSNLHIWDWQRRELVQTLPMKDGLIPLEIRFLHDPAASQGFVGCTLSSTIQRFYKNEAGCWSVEKVIQVPPKKVKNWLLPEMPGLITDILLSLDDRFLYFSNWLHGDLRQYDISNPQKPRLVGQIFLGGSIVKGGPVQVLEDQELRCQPEPLVVKGKRVAGGPQMIQLSLDGKRLYVTTSLYSAWDKQFYPDLIREGSVMLQVDVDTEKGGLKLNPNFLVDFGKEPHGPALAHELRYPGGDCSSDIWI

其中，如下序列段是质谱未检测到的部分：

MPSSLRNKSFSPERFSKEAKQTHCCRHTQQVPRRVQQGFPWASSQFEKEEAVGFRMETNLATKCVK；

GPR；LPMPYLKDELHHSGWNTCSSCFGDSTKSR；

APKLHKVIEAKEIQDKCGLSYLHTSHCLASGEVMISTLGDPKGNGK；

FYK；KVK；FLYFSNW；GKR；GGLK。

如下序列段是质谱检测到的可信度＞95％的可信序列段：

CGPGYSTPLEAMK；EEIIYLPCIYRNTGIEAPDYLATVDVNPR；

NMLVLPCLISSRVYVVDVASEPR；

GGFVLLDGETFEVKGTWQRPGGEAPLGYDFWYQPRHNVMISTEWAAPNVLRDGFNPADVEAGLYGSNLHIWDWQR；

ELVQTLPMKDGLIPLEIRFLHDPAASQGFVGCTLSSTIQR；

NWLLPEMPGLITDILLSLDDR；

QYDISNPQKPRLVGQIFLGGSIVKGGPVQVLEDQELR；

VAGGPQMIQLSLDGKRLYVTTSLYSAWDK；

如下序列段是质谱检测到的50％＜可信度≤95％的可信序列段：

SPQYCQVIHR；NEAGCWSVEK；LHGDLR；QFYPDLIREGSVMLQVDVDTEK；

LNPNFLVDFGKEPHGPALAHELR；

如下序列段是质谱检测到的0＜可信度≤50％的可信序列段：

R；VIQVPPK；CQPEPLVVK；YPGGDCSSDIWI。

二、小球藻类金属硫蛋白镉螯合特性的SEC-ICP-MS实验方法，包括以下步骤：

(1)将小球藻锌结合类金属硫蛋白溶于10mmol·L^-1的Tris-HCl(pH7.5)中，配制成0.6、0.3、0.1mg/mL三个高、中、低浓度，每个浓度水平均加入500ng/LCd²⁺，使整个体系中蛋白浓度分别为30.0、15.0、5.0μg/mL，室温下通过垂直旋转混匀仪混匀反应30min，转速35r·min^-1。

(2)将反应液经SEC-ICP-MS同时检测锌和镉的信号强度。以10mmol·L^-1的Tris-HCl(pH7.5)为流动相，流速为1.0mL·min^-1，进样量20μL，通过SEC-ICP-MS检测锌信号及镉信号的位置及其强度；结果表明，当未加入小球藻锌结合类金属硫蛋白时，Cd²⁺溶液在色谱柱分离的保留时间为8.010min(如图4所示)。而当在Cd²⁺溶液中加入小球藻类金属硫蛋白样品之后，低浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白并未改变Cd²⁺的信号峰位置(仍然出现在8.010min)。但加入小球藻类金属硫蛋白浓度的提高后，在7.099min处出现Cd²⁺信号峰(如图5所示)，此保留时间与小球藻锌结合类金属硫蛋白的保留时间基本一致(如图6所示)。说明小球藻类金属硫蛋白对镉产生了螯合作用。随着小球藻锌结合类金属硫蛋白加入浓度的提高，保留时间为7.099min的Cd²⁺信号峰值也随之增大，证明小球藻锌结合类金属硫蛋白能够螯合重金属镉。

三、在模拟胃液环境中不同浓度小球藻类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合实验，包括以下步骤：

(1)模拟胃液具体配方如下：1L模拟胃液中含胃蛋白酶3.2g、氯化钠2.0g，用6mol·L^-1的盐酸调pH至1.2，用0.22μm滤膜过滤除菌。

(2)用模拟胃液配制含100ng·L^-1Cd²⁺的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL。用模拟胃液配制含0、5、10、15、20μg·mL^-1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd²⁺的塑料离心管内。将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，控制温度为37℃，转速为130r·min^-1。反应10h后，计算在模拟胃液环境中不同浓度小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率(如图7所示)。结果表明，在不加胃蛋白酶的情况下，小球藻类金属硫蛋白在酸性的模拟胃液环境中螯合率并不高，蛋白浓度为20μg·mL^-1时螯合率也仅为10％左右；而在胃蛋白酶的模拟胃液环境中，小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率略有降低，说明在胃蛋白酶的模拟胃液环境中，小球藻类金属硫蛋白对Cd²⁺没有螯合作用。

四、在模拟肠液环境中不同浓度小球藻类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合实验。

(1)模拟肠液具体配方如下：1L模拟肠液中含胰蛋白酶10.0g和磷酸二氢钾6.8g，用4％的NaOH调pH至7.5±0.1，用0.22μm滤膜过滤除菌。

(2)用模拟肠液配制含100ng·L^-1Cd²⁺的溶液，分装于塑料离心管中，每管30mL。用模拟肠液配制含0、5、10、15、20μg·mL^-1系列浓度的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，往各透析袋中加入2mL此蛋白溶液，将透析袋分别置于含Cd²⁺的塑料离心管内。将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，控制温度为37℃，转速为130r·min^-1。反应10h后，计算在模拟肠液环境中不同浓度小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率(如图8所示)。在不加胰蛋白酶的情况下，小球藻类金属硫蛋白在弱碱性的模拟肠液环境中螯合效果明显，蛋白浓度为5μg·mL^-1时螯合率就高达44.97％，10μg·mL^-1时达到53.51％，此后增大蛋白浓度，螯合率趋于稳定；而在添加胰蛋白酶的模拟肠液环境中，小球藻锌结合类金属硫蛋白对Cd²⁺的螯合率略有降低，蛋白浓度在5μg·mL^-1和10μg·mL^-1时螯合率分别为20.21％和38.62％。

五、在模拟肠液环境中小球藻类金属硫蛋白对不同浓度Cd²⁺的螯合实验。

(1)模拟肠液具体配方如下：1L模拟肠液中含胰蛋白酶10.0g和磷酸二氢钾6.8g，用4％的NaOH调pH至7.5±0.1，用0.22μm滤膜过滤除菌。

(2)配制含10、25、50、100、200ng·L^-1不同Cd²⁺浓度的模拟肠液，分装于塑料离心管中，每管30mL。用模拟肠液配制10μg·mL^-1的小球藻锌结合类金属硫蛋白溶液，并分别往各透析袋中加入2mL该蛋白溶液，然后将透析袋置于塑料离心管内，每个浓度设置不加蛋白样品的为对照组。将塑料离心管置于水浴恒温震荡器中，控制温度为37℃，转速为130r·min^-1。反应10h后计算在模拟肠液环境中小球藻锌结合类金属硫蛋白对不同浓度Cd²⁺的螯合率(如图9所示)。在不加酶的情况下，外液Cd²⁺浓度为10ng·L^-1时螯合率达到69.24％。随外液Cd²⁺浓度的增高，螯合率不断降低，当外液Cd²⁺浓度为200ng·L^-1时螯合率为27.91％。而在加入胰蛋白酶后，小球藻类金属硫蛋白的螯合率比不加酶时略低，证明胰蛋白酶在模拟肠液环境中对小球藻螯合Cd²⁺具有一定的抑制作用。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。