4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及内吗啡肽类似物及其合成方法和应用。

背景技术

内吗啡肽是哺乳动物体内广泛存在的内源性的μ-阿片受体配体，分为内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂,EM-1)和内吗啡肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂,EM-2)。在所有已知的阿片物质中，内吗啡肽对μ-阿片受体具有极高的亲和性和选择性。内吗啡肽通过与G蛋白偶联的μ-阿片受体结合，参与诸多功能的调节，但其主要作用是强效的镇痛活性，可产生活性强于吗啡而副作用较少的镇痛作用。特别是在神经性疼痛动物模型中也表现出明显的镇痛活性，比大多数阿片肽都更有效，使其具有潜在的开发前景。当然，基于内吗啡肽的主链骨架和芳香侧链的经典特性，它们也是研究结构活性关系的模型肽。

大多数天然阿片肽都具有信使序列和地址序列两个重要组成部分。信使序列即N-末端的三肽或者四肽片断，对配体与受体相互作用尤为重要。而地址序列为剩下的C-末端片断，对多肽的稳定性起决定性作用。研究表明，经典阿片肽的重要特征是在于1位具有阳离子化基团和酚基团，2位具有空间子，3位具有亲脂性的和芳香的残基，4位具有C-末端酰胺化的的地址域。对于内吗啡肽，其1位酪氨酸具有严格的氨基和酚基团，2位脯氨酸作为合适的空间子，3位的芳香氨基酸残基，以及4位酰胺化的苯丙氨酸。

然而内吗啡肽对μ-阿片受体亲和性、阿片激动活性、及镇痛特性还有待提高。此外，内吗啡肽能够引起血压降低和心搏徐缓，即对心血管系统具有一定的副作用。

发明内容

本发明提供4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物及其合成方法和应用，在制备高效、低副作用的多肽镇痛药物方面具有很高的临床意义和应用价值。

本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽-1类似物为酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：

上述4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；

三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-色氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。

本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽-2类似物为酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：

上述4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；

三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。

本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物，是通过将内吗啡肽-1和内吗啡肽-2的第4位苯丙酰胺羟基化修饰，构建一种高效的内吗啡肽类似物。

内吗啡肽的N-末端的三肽为信使序列，4位苯丙酰胺为地址序列。这两个序列的3D结构对于阿片受体亲和以及生物活性构象的形成起着重要作用。尤其4位苯丙酰胺决定着内吗啡肽生物学功能的发挥。将内吗啡肽的4位苯丙酰胺去氨基化，即C-末端羧基裸露，将导致内吗啡肽在DMSO溶液中的分子构象更加柔性，内吗啡肽的C-末端自由的氨基酸将导致其与μ-阿片受体的亲和活性和激动活性几乎完全丧失。同样，在morphiceptin中，C-末端去酰胺化也降低了多肽的生物活性。此外，羟基基团影响多肽分子内氢键的形成，进而改变多肽的生物活性。将内吗啡肽的1位酪氨酸的酚羟基去掉，将极大降低内吗啡肽的μ-阿片受体亲和性和阿片活性，证明内吗啡肽中的羟基基团的重要性。

本发明能够提高内吗啡肽类似物与μ-阿片受体的亲和性与阿片活性，以及降低药物的镇痛耐受。通过同位素标记的配体-受体亲和实验，离体GPI/MVD标本阿片活性及在体镇痛与耐受实验，对本发明合成的内吗啡肽类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，与内吗啡肽相比，本发明的内吗啡肽类似物具有较高的μ-阿片受体亲和性，阿片激动活性，及高效低耐受的镇痛特性。经过实验证实最大镇痛效力在注射药物5min后产生，能达到％MPE约80％左右，且镇痛持续时间较长。另外，吗啡肽类似物对心血管系统的作用效果明显降低，具备了较低的心血管副作用的优点。因此，本发明的内吗啡肽类似物在制备高效、低耐受副作用、低心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物EM-1-NHOH的镇痛效应-时间曲线；

图2为侧脑室注射内吗啡肽-2类似物EM-2-NHOH的镇痛效应-时间曲线；

图3为侧脑室注射内吗啡肽-1的镇痛耐受剂量曲线；

图4为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物EM-1-NHOH的镇痛耐受剂量曲线；

图5为侧脑室注射内吗啡肽-2的镇痛耐受剂量曲线；

图6为侧脑室注射内吗啡肽-2类似物EM-2-NHOH的镇痛耐受剂量曲线；

图7为静脉注射内吗啡肽-1及类似物EM-1-NHOH对大鼠系统动脉压的作用；

图8为静脉注射内吗啡肽-2及类似物EM-2-NHOH对大鼠系统动脉压的作用；

图9为静脉注射内吗啡肽-1及类似物EM-1-NHOH对大鼠心率的作用；

图10为静脉注射内吗啡肽-2及类似物EM-2-NHOH对大鼠心率的作用。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物为内吗啡肽-1类似物，酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：

具体实施方式二：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；

三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-色氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-色氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤一中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤四中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤四中洗涤的步骤为：用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤五中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物为内吗啡肽-2类似物，酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，其结构如下：

具体实施方式十一：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加入反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将盐酸羟胺溶于水中，将pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸与盐酸羟胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺；

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于混合液中，室温反应1～3h，减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺；所述混合液由浓盐酸和乙酸乙酯按体积比(0.5～2)：(2.5～10)组成；

三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入重蒸的四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-苯丙氨酸和苯丙(N-羟基)酰胺的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液C；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液C中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1︰1；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液D；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1︰1.2～1.4；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液D中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1︰1；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～16h；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺；

六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.5-0.8mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于7～16mL的绝对甲醇中，加入70～160mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十一不同的是：步骤一中洗涤方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十一或十二不同的是：步骤一中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一或十二相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十一至十三之一不同的是：步骤三中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一至十三之一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十一至十四之一不同的是：步骤三中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十四之一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十一至十五之一不同的是：步骤四中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11。其它与具体实施方式十一至十五之一相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十一至十六之一不同的是：步骤四中洗涤的步骤为：用稀盐酸洗涤和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十六之一相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十一至十七之一不同的是：步骤五中洗涤的步骤为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式十一至十七之一相同。

具体实施方式十九：本实施方式4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：内吗啡肽-1类似物(EM-1-NHOH)的合成

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，再将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将2.6mmol的盐酸羟胺溶于少量水中，用2mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为91％。

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于1mL的浓盐酸和5mL的乙酸乙酯组成的混合液中，室温反应2h。减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺，产率为96％。

三、苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的苄氧羰基-色氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将2mmol的苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为79％。

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为83％。

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入12mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为73％。

六、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.6mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为92％。

实施例2：内吗啡肽-2类似物(EM-2-NHOH)的合成

一、N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将2.6mmol的盐酸羟胺溶于少量水中，用2mol/L的氢氧化钠溶液将pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为90％。

二、苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的N-叔丁氧羰基-苯丙(N-羟基)酰胺溶解于1mL的浓盐酸和5mL的乙酸乙酯组成的混合液中，室温反应2h。减压蒸馏，得到白色固体产物苯丙(N-羟基)酰胺，产率为94％。

三、苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将2mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入体积为15mL的重蒸的四氢呋喃反应液中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将2mmol的苯丙(N-羟基)酰胺的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为80％。

四、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为86％。

五、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入12mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为75％。

六、酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺的合成

将0.6mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-苯丙(N-羟基)酰胺，产率为91％。

以上实施例制备的内吗啡肽类似物的质谱和色谱分析检测结果如表1所示。

表1.内吗啡肽-1和内吗啡肽-2类似物的质谱和色谱分析检测结果

表1的结果表明，本发明方法得到的内吗啡肽类似物的检测值与理论值相符。

实施例1-2制备的4位苯丙酰胺羟基化修饰的内吗啡肽类似物的生物活性实验如下：

1、同位素标记的配体-受体亲和实验

利用制备大鼠脑膜蛋白获得阿片受体，实验分为总结合管、竞争结合管和非特异性结合管，每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(pH＝7.4)和脑膜蛋白。其中，在总结合管中只加入[³H]DAMGO(0.5nM)或[³H]DPDPE(1nM)和脑膜蛋白，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM>50值，根据公式Ki＝IC₅₀/(1+[L]/KD)计算K_i值。每个实验数据分别平行做3组实验求平均值。

实验结果见表2。表2的数据显示，内吗啡肽-1类似物EM-1-NHOH的μ-阿片受体的亲和性明显高于母体，约2倍左右，对δ-阿片受体的亲和性略高于母体，其阿片受体选择性也明显提高。此外，内吗啡肽-2类似物EM-2-NHOH对μ-阿片受体的亲和性也略有提高。这表明对内吗啡肽的4位苯丙酰胺进行羟基化修饰得到的类似物对μ-阿片受体具有较高的亲和性特征。

表2.内吗啡肽-1和-2及对应类似物的阿片受体亲和性

2、离体生物标本阿片活性测定

豚鼠回肠纵行肌实验(GPI实验)：豚鼠250-300g，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Kreb’s液(g/L：NaCl>2>2PO₄>4·7H₂O>3>-5，氯化胆碱2.8×10^-3，葡萄糖1.98)中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O₂和5％CO₂)的Kreb’s液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽0.3-0.5ms单方波，频率6次/min，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后选定待测药物3-4个不同的浓度，加入浴管，测得其抑制标本电刺激引起收缩的百分率，抑制程度应在20％-80％之间。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。抑制百分率＝(反应前收缩高度-反应后收缩高度)/反应前收缩高度×100％。然后用剂量-效应半对数作图法，以抑制百分率为纵坐标，以待测药物的浓度的对数为横坐标作图，求得抑制50％收缩高度的药物浓度(IC₅₀)。

小鼠输精管实验(MVD实验)：体重30-35g雄性昆明系小白鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Kreb’s液(g/L：NaCl>20.28，KCl>2PO₄>3>2和5％CO₂)的Kreb’s液、恒温36.5±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷100mg。前30min每5min换一次营养液，以后每10min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽2ms，频率6次/min，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。IC₅₀测定方法同GPI实验。

实验结果见表3。表3的数据显示，GPI和MVD标本实验的结果与同位素标记的配体-受体亲和实验结果的趋势一致。GPI标本中主要含有μ-阿片受体，MVD标本中主要含有μ-和δ-阿片受体。在GPI实验中，内吗啡肽-1类似物EM-1-NHOH的阿片生物活性比母体内吗啡肽-1高约4倍左右，内吗啡肽-2类似物EM-2-NHOH的活性也明显高于母体。而且，在MVD实验中，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH的IC₅₀值明显低于母体内吗啡肽。该结果表明，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对离体生物标本具有较高的阿片激动活性。

表3.内吗啡肽-1和-2及对应类似物的GPI/MVD标本阿片活性

3、镇痛与耐受实验

采用昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。利用PE-10插管对小鼠侧脑室埋管，手术后3天给药。根据内吗啡肽及类似物的镇痛活性，确定药物剂量，测定急性镇痛耐受。小鼠提前1小时侧脑室注射药物或生理盐水1次，之后分别注射不同剂量的药物，测定疼痛阈值变化，对内吗啡肽及类似物进行镇痛耐受评估。

镇痛活性实验结果如图1和2所示(其中■表示注射剂量10nmol，●表示注射剂量3nmol，▲表示注射剂量1nmol，▼表示注射剂量0.3nmol，◆表示生理盐水)，通过中枢侧脑室注射0.3-10nmol剂量的内吗啡肽-1类似物EM-1-NHOH和内吗啡肽-2类似物EM-2-NHOH，两个类似物均表现浓度依赖型的高效镇痛效果。最大镇痛效力在注射药物5min后产生，能达到％MPE约80％左右，且镇痛持续时间较长，表明这两个类似物具有高效的中枢镇痛活性。此外，内吗啡肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH的镇痛耐受结果如图3、4、5和6所示，提前1小时侧脑室注射生理盐水，之后侧脑室注射0.3-10nmol剂量的内吗啡肽及类似物均产生显著的镇痛作用。图3中■表示生理盐水+内吗啡肽-1，●表示内吗啡肽-1(10nmol)+内吗啡肽-1；图4中■表示生理盐水+EM-1-NHOH，●表示EM-1-NHOH(10nmol)+EM-1-NHOH；图5中■表示生理盐水+内吗啡肽-2，●表示内吗啡肽-2(10nmol)+内吗啡肽-2；图6中■表示生理盐水+EM-2-NHOH，●表示EM-2-NHOH(10nmol)+EM-1-NHOH。然而，分别提前1小时侧脑室注射内吗啡肽-1或内吗啡肽-2，之后再注射不同剂量的内吗啡肽-1或内吗啡肽-2，其镇痛耐受剂量曲线明显右移，即镇痛效果降低，产生了镇痛耐受。但是，分别提前1小时侧脑室注射类似物EM-1-NHOH或EM-2-NHOH，再注射不同剂量的相应类似物，镇痛耐受剂量曲线则右移不明显，两个类似物的镇痛耐受明显降低。

4、整体血压实验

Wistar大鼠，200-300g，用20％的氨基甲酸乙酯麻醉(l.2g/kg,i.p.)，为了保持麻醉状态良好，可能需要临时补加麻醉药物。切开大鼠的气管，清除管内粘液，动物能自主呼吸。PE-50导管插入到颈外静脉以备静脉给药，PE-50导管插入颈大动脉，并与YP-100压力传感器相连，记录给药后血压的变化。系统动脉压和心率数据主要通过成都泰盟BL-420F生物记录系统平均化处理获得。药物静脉每次注射100μL，10～15秒内注射完成。

内吗啡肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对大鼠心血管作用的实验结果如图7、8、9和10所示，图7中■表示内吗啡肽-1，表示EM-1-NHOH；图8中■表示内吗啡肽-2，表示EM-2-NHOH；图9中■表示内吗啡肽-1，表示EM-1-NHOH；图10中■表示内吗啡肽-2，表示EM-2-NHOH。静脉注射1-10nmol的内吗啡肽-1和类似物EM-1-NHOH剂量依赖的降低大鼠系统动脉压，但是类似物EM-1-NHOH对系统动脉压降低的百分率明显低于母体内吗啡肽-1。类似物EM-2-NHOH具有同样的作用效果，即EM-2-NHOH对系统动脉压降低的百分率也明显低于内吗啡肽-2。此外，静脉注射1-10nmol的内吗啡肽及类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH剂量依赖的降低大鼠的心率。同样，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对大鼠心率的降低效果显著低于各自的母体。该结果表明，类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对心血管系统的作用效果明显降低，即具备了较低的心血管副作用的优点。

综上所述，本发明通过对内吗啡肽-1和内吗啡肽-2的第4位苯丙酰胺羟基化修饰，构建一种新型高效的内吗啡肽类似物，目的为了提高内吗啡肽类似物与μ-阿片受体的亲和性与阿片活性，增强类似物的中枢镇痛活性并降低镇痛耐受的不良副作用。通过同位素标记的配体-受体亲和实验，离体GPI/MVD标本阿片活性及在体镇痛与耐受实验，对本发明合成的内吗啡肽类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的内吗啡肽类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH具有比母体更高的μ-阿片受体亲和性，阿片激动活性和中枢镇痛效果，且镇痛耐受的不良副作用明显降低。类似物EM-1-NHOH和EM-2-NHOH对心血管系统的作用效果明显降低，具备了较低的心血管副作用的优点。因此，本发明的内吗啡肽类似物在制备高效、低耐受副作用、低心血管副作用的多肽镇痛药物方面具有潜在的临床应用价值。