小麦条锈菌PSTG_11438基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

技术领域

本发明属于基因工程和作物分子育种技术领域，具体涉及小麦条锈菌PSTG_11438基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法。

背景技术

小麦是我国第二大粮食作物，年均播种面积约为3.6亿亩。小麦产量的稳定与提高关系国计民生。然而多年来，真菌病害对小麦生产构成严重威胁，如锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病等病害的发生，严重影响小麦的产量和品质。其中，小麦条锈病俗称"黄疸"，是由专性寄生的条锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici)引起。在我国，小麦条锈发病猖獗，常年受害面积达6,000～8,000万亩(农业部文件：农农发2006-9)；发病严重年份造成大幅减产(20～30％)，威胁粮食安全。条锈菌存在有性生殖，毒性变异快，近年来新的优势小种持续出现，导致条锈病控制难度加大。小麦主要产区黄淮海麦区的条锈病发生面积有逐渐增加的趋势，2017年5月统计河南、山东、安徽等7省市累计发生面积超过4,000万亩(中国农业科技推广，2017)。因此，有效防治条锈病对于我国粮食安全具有重要意义。

培育和种植抗病品种，是防治小麦条锈病经济、有效的重要措施。当前，我国多省的小麦品种审定已把是否具有条锈病抗性列为关键指标。提高抗性水平、培育持久抗性也已成为小麦新品种培育的重要目标。抗病品种的培育主要是通过抗条锈病基因的挖掘与利用，然而由于条锈菌生理小种毒性的快速变异，抗病基因大面积利用后可能会在短期内丧失抗病性。例如小麦育种上曾广泛使用的碧蚂一号、“洛类”、“繁6”衍生系等抗源，均已对当前流行小种失去抗性。对我国当前501份主栽和后备品种的检测表明，不足30％的品种对当前流行小种表现抗病，而且其抗源主要集中在Yr26/Yr24等少数基因(韩德俊等，西北-华北-长江中下游条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病评价，中国农业科学，2010(43))。因此，拓宽小麦抗条锈病的抗源，开发新的条锈病防治策略，对于降低小麦条锈病大面积流行的风险具有重要意义。

小麦条锈菌由于其活体营养型及专性寄生特性，遗传转化困难；而且小麦本身同样难以开展遗传转化，因此小麦-条锈菌互作的遗传学研究困难很大，进展较慢。目前在小麦条锈菌中鉴定的侵染或致病关键基因数量较少，而且目前尚未有基因有效应用于小麦抗病育种。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦条锈菌基因作为分子靶标在麦类作物育种或条锈病防治中的应用以及一种利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：小麦条锈菌PSTG_11438基因在小麦条锈病防治中的应用，所述PSTG_11438基因的序列如Seq ID No.1所示。

优选的，所述PSTG_11438基因作为转录抑制的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_11438基因抑制小麦条锈菌的生长繁殖。

优选的，所述应用为将携带所述PSTG_11438基因的沉默表达载体导入小麦中获得抗条锈菌的小麦。

优选的，所述应用为通过喷施所述PSTG_11438基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

优选的，所述PSTG_11438基因的转录抑制剂为能够抑制所述PSTG_11438基因转录的dsRNA溶液。

优选的，所述应用为通过喷施所述PSTG_11438基因的编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_11438基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_11438基因片段构建小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体；所述PSTG_11438基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。

优选的，步骤1)中所述PCR扩增用引物为CQM11438-F2和CQM11438-R2引物；所述CQM11438-F2的序列如Seq ID No.3所示；所述CQM11438-R2引物的序列如Seq ID No.4所示。

优选的，步骤2)中所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体为包括潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar、PSTG_11438基因片段的正向序列和PSTG_11438基因片段的反向序列的表达盒的载体。

优选的，所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体从T-DNA Left Boarder到RightBoarder区段的序列如序列表SeqID No.6所示。

本发明的有益效果：本发明首次发现所述的PSTG_11438基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，丰富了小麦条锈菌中侵染或致病的关键基因；将所述PSTG_11438基因应用于小麦条锈病防治中，具体可将PSTG_11438基因作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_11438基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

附图说明

图1为实施例1中沉默表达PSTG_11438的阳性转基因小麦除草剂筛选结果图；

图2为实施例1中抗条锈菌小麦PCR筛选检测结果；

图3为实施例2中抗条锈菌小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况图；

图4为实施例2中抗条锈菌小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病图；

图5为实施例3中抗条锈菌小麦接种条锈菌后PSTG_11438基因的荧光定量表达分析结果图；

图6为实施例3中PSTG_11438接种条锈菌后叶片组织染色观察图。

具体实施方式

本发明提供了小麦条锈菌PSTG_11438基因在小麦条锈病防治中的应用。在本发明中所述PSTG_11438基因的GenBank登录号为KNE95266.1，所述PSTG_11438基因的序列如SeqID No.1所示，基因序列长度为1419bp；所述PSTG_11438基因编码氨基酸序列具有CE4_MrCDA_Like结构域(cd10952)，具体序列如Seq ID No.2所示。

在本发明中，所述PSTG_11438基因优选的作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述PSTG_11438基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。在本发明具体实施过程中，优选的通过以下三种方法来沉默PSTG_11438基因，以实现所述PSTG_11438基因在小麦条锈病防治中的应用：(一)将携带所述PSTG_11438基因的沉默表达载体导入麦类作物中，获得抗条锈菌的麦类作物；(二)通过喷施所述PSTG_11438基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖；所述转录抑制剂优选的为能够抑制所述PSTG_11438基因转录的dsRNA溶液；(三)通过喷施所述PSTG_11438基因编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。

本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_11438基因片段；2)利用步骤1)所述的PSTG_11438基因片段构建小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体；所述PSTG_11438基因沉默表达载体的构建采用GATEWAY克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。

本发明在扩增PSTG_11438基因片段前，优选的对PCR扩增引物进行设计。在本发明中，优选的以小麦条锈菌的全基因组序列为参考，以假定功能蛋白基因PSTG_11438(GenBank:KNE95266.1)的编码区序列为模板设计PCR引物；更优选的以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank登录号AJIL00000000.1或BROAD下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccinia_striiformis_pst-78/)。本发明中，所述PCR扩增引物设计的方法采用本领域常规方法即可，具体的可采用引物设计软件来实现。在本发明中所述PCR扩增引物优选的为CQM11438-F2和CQM11438-R2引物；所述CQM11438-F2的序列如Seq ID No.3所示；所述CQM11438-R2引物的序列如Seq ID No.4所示。

本发明在设计获得PCR扩增引物后，优选的对所述PCR扩增引物的扩增区段进行验证。所述验证具体的为用扩增区段的序列与小麦条锈菌PST-78全基因组数据和NCBI数据库中的小麦条锈菌序列进行比对，查看所述扩增区段的序列是否能够特异性靶标PSTG_11438基因。在本发明中上述PCR扩增引物的扩增区段序列，未发现所述扩增区段的序列与其它基因存在长度大于20bp的100％一致序列，表明利用CQM11438-F2/R2引物扩增区段的序列可以特异靶标PSTG_11438基因。

本发明中，以感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增获得PSTG_11438基因片段。在本发明中，优选的采用感染条锈菌生理小种CRY32后发病的小麦叶片制备cDNA；所述制备cDNA的方法优选的采用常规TRIZOL法制备纯化RNA，并反转录获得cDNA。在本发明中，所述制备纯化RNA并反转录获得cDNA分别采用RNA纯化试剂盒和反转录试剂盒。在本发明具体实施过程中，所述制备纯化RNA优选的采用天根生化科技(北京)有限公司，货号DP405的试剂盒实现；所述反转录获得cDNA优选的采用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号AT311-03。

本发明在获得感染条锈菌后发病的小麦叶片cDNA后，以所述cDNA为模板，进行PCR扩增获得PSTG_11438基因片段。在本发明中所述PCR扩增使用的酶优选的为高保真酶，更优选的为Phusion高保真酶(Thermo Scientific公司，货号F-530S)；所述述PCR扩增的体系和程序采用本领域常规的PCR扩增体系和程序即可，具体的在本发明实施过程中，所述PCR体系为：5X Phusion HF Buffer:10μl，Phusion DNAPolymerase:0.5μl，CQM11438-F2:1.5μl，CQM11438-R2:1.5μl，10mM dNTPs:1μl，Template DNA:1μl，ddH₂O:34.5μl；所述PCR程序为：98℃>

本发明在获得扩增产物后优选的对扩增产物进行分离和测序，本发明中所述分离采用本领域常规的分离方法即可；所述测序委托测序公司完成；本发明中所述扩增产物测序获得的序列如Seq ID No.5所示，与参考基因PSTG_11438的序列相似性99％，有1个SNP(Single Nucleotide Polymorphism)位点。

本发明在获得PSTG_11438基因片段后，利用GATEWAY克隆技术构建小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体。在本发明中，所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体的构建方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)，具体的包括以下步骤：(A)将所述PSTG_11438基因片段与入门载体连接后转入大肠杆菌感受态细胞获得阳性克隆质粒；(B)将所述阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336进行LR反应，同时将PSTG_11438基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。

在本发明中，优选的将所述PSTG_11438基因片段与入门载体连接；所述入门载体优选的为实验室改造的PC414C，与常规入门载体pENTR-D-TOPO相比，PC414C插入了多克隆位点，可通过酶切、连接的方法实现定向克隆。具体连接PC414C与目标片段的方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)。本发明为利用GATEWAY克隆技术，优选的在CQM11438-F2/R2引物序列上增加保护碱基和酶切位点获得改良后引物。优选的所述保护碱基连接在引物序列5’末端；所述保护碱基的数目优选的为2～4个；在本发明具体实施过程中，所述CQM11438-F2上的保护碱基优选的为CAA和CQM11438-F2上的保护碱基优选的为TCA。在本发明中，所述酶切位点优选的为NotI酶切位点和AscI酶切位点，所述CQM11438-F2引物序列连接NotI酶切位点，所述CQM11438-R2引物序列连接AscI酶切位点。

在本发明具体实施过程中，所述PSTG_11438基因片段与入门载体连接前，优选的将上述改良后引物扩增获得的包括PSTG_11438基因片段PCR扩增产物和入门载体PC414C进行NotI、AscI双酶切获得酶切产物，然后利用T4-DNA连接酶将纯化后的酶切产物(即PSTG_11438基因片段和入门载体)进行连接获得连接产物。

本发明在获得连接产物后，优选的将所述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选纯化后获得阳性克隆质粒DNA。在本发明中，筛选转化后的大肠杆菌感受态细胞获得所述阳性克隆质粒。本发明中所述筛选的方法优选的为菌落PCR；所述菌落PCR的引物优选的为CQM11438-F2/R2；所述纯化阳性克隆质粒DNA优选的采用质粒DNA试剂盒完成。

本发明在获得阳性克隆的质粒DNA后，利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)进行LR反应，将PSTG_11438基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336获得RNAi沉默表达载体。本发明中，所述载体构建采用本领域常规的载体构建方法和程序，无其他特殊要求，能够获得RNAi沉默表达载体即可。

本发明中获得的小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体编号为PC899，所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体上从T-DNALB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列优选的如Seq IDNo.6所示，所述T-DNALB(LeftBoarder)到RB(RightBoarder)区段的序列为包含顺次连接的潮霉素抗性基因Hyg、除草剂抗性基因Bar及PSTG_11438基因片段的正向序列和PSTG_11438基因片段的反向序列的表达盒。

本发明在获得小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体后，采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌PSTG_11438基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。本发明中受体材料优选的为高感小麦条锈病的品系CB037。本发明中所述转化的具体技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。在此不再赘述。

本发明在所述转化完成后，优选的将转化后的材料在诱愈培养基上进行愈伤组织诱导，愈伤组织的分化培养获得再生幼苗，将所述再生幼苗生根培养后获得可移栽到土壤中的小麦苗。在本发明中所述转化后培养获得小麦苗的具体步骤和参数参考王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。

下面结合实施例对本发明提供的小麦条锈菌PSTG_11438基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)PCR扩增获得PSTG_11438基因片段

以小麦条锈菌生理小种PST-78全基因组序列为参考(GenBank登录号AJIL00000000.1或BROAD下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccinia_striiformis_pst-78/)，以假定功能蛋白(hypothetical protein)基因PSTG_11438(GenBank:KNE95266.1)的编码区序列为模板设计PCR引物。正向引物序列CQM11438-F2如Seq ID No.3所示：5`-caagcggccgcATCAGCGTCCATACCTGGTC-3`；反向引物序列CQM11438-R2如Seq ID No.4所示：5`-tcaggcgcgccGTTTCAATGTAGCCCTCGGA-3`。扩增区段长度476bp。利用扩增区段的序列比对小麦条锈菌PST-78全基因组数据(https://genome.jgi.doe.gov/Pucst_PST78_1/Pucst_PST78_1.home.html)及NCBI数据库小麦条锈菌序列(Pucciniastriiformisf.sp.tritici，taxid:168172)，未发现与其它基因存在长度大于20bp的100％一致序列，表明利用CQM11438-F2/R2引物扩增片段构建RNAi沉默表达载体，可以特异靶标PSTG_11438基因。

取材感染条锈菌生理小种CRY32后发病的小麦叶片，利用常规TRIZOL法(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP405)纯化RNA，并制备cDNA(北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号AT311-03)。使用Phusion高保真酶(Thermo Scientific公司，货号F-530S)使用引物CQM11438-F2和CQM11438-R2进行PCR扩增(PCR体系：5X Phusion HFBuffer:10ul,Phusion DNA Polymerase:0.5ul,CQM11438-F2:1.5ul,CQM11438-R2:1.5ul,10mM dNTPs:1ul,Template DNA:1ul,ddH2O:34.5ul；PCR程序：98℃ 30s；98℃ 10s，60℃20s，72℃ 30s 35循环；72℃ 10min)，分离PSTG_11438基因片段并进行测序验证。

自CRY32分离得到的基因片段序列如Seq ID No.5所示，与参考基因PSTG_11438的序列相似性99％，有1个SNP(SingleNucleotide Polymorphism)位点。

(二)小麦条锈菌基因PSTG_11438沉默表达载体的构建

为利用GATEWAY克隆技术构建基因沉默表达载体，CQM11438-F2/R2引物两端分别增加3个保护碱基(CAA、TCA)及NotI酶切位点(GCGGCCGC)或AscI酶切位点(GGCGCGCC)，以连入改造后的入门载体PC414C(韩秀丽，硕士论文，2013)。PCR扩增产物及载体PC414C首先进行NotI、AscI双酶切，酶切产物纯化后利用T4-DNA连接酶进行连接。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号CD201)。利用引物CQM11438-F2/R2进行菌落PCR来筛选携带目的基因片段的阳性克隆，并纯化质粒DNA(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP103)。

利用阳性克隆的质粒DNA与RNAi沉默表达载体骨架PC336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ICS和PAL的克隆与分析[D].山东农业大学,2013.)进行LR反应，同时将PSTG_11438基因片段的正向、反向序列重组至载体PC336以构建RNAi沉默表达载体。

LR反应体系：目的载体(150ng/μl)1μl；入门载体PC414C(50-150ng)1μl，ddH₂O>TM>2O>

小麦条锈菌基因PSTG_11438沉默表达载体上从T-DNA LB(Left Boarder)到RB(RightBoarder)区段的序列如序列表Seq ID No.6。其中包含潮霉素抗性基因(Hyg)、除草剂抗性基因(Bar)及两段方向相对的PSTG_11438基因片段的表达盒。

(三)普通小麦的遗传转化及后代筛选

小麦遗传转化采用基因枪介导转化法，受体材料选用高感小麦条锈病的品系CB037。技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[D].山东农业大学,2012.)。小麦授粉后15天左右，挑选幼胚直径为1.5mm大小的幼胚剪取穗子剥取种子，表面消毒灭菌后剥取幼胚放置于高渗培养基上用基因枪轰击，再在诱愈培养基上23℃暗培养四周，每两周继代一次。四周后从诱愈培养基转到分化培养基，从分化培养基上愈伤开始放在光照培养(23℃，16hlight，8hdark)。两周后从分化培养基上再转到分化培养基上，直到再生出幼苗。把分化出的苗取出放在生根培养基上，大约3-4周待根长壮就可以移栽到土里。

通过叶片涂抹除草剂初步筛选阳性转基因后代。除草剂为AgrEvo公司产品Finale，货号F30617006，使用浓度为0.3％。3-5天后根据叶片涂抹部位的敏感程度筛选阳性转基因后代。

如图1所示，其中CB037为转基因受体，株系5455-7A为阴性转基因单株；5523-2A、5524-2A、5497-7A为阳性转基因单株。可以看出，阴性转基因材料的叶片涂抹部位明显黄化或干枯坏死，而阳性转基因材料的叶片涂抹部位稍微黄化、无明显干枯坏死。

同时，取材转基因小麦的叶片制备DNA及cDNA，利用引物CQM11438-F2/R2进行PCR扩增对转基因材料进行筛选确认。结果如图2所示，其中A、B分别为以gDNA和cDNA为模板的PCR结果；PCR引物为CQM11438-F2/R2；H₂O为阴性对照，P为质粒DNA阳性对照。如图2A所示，多数样品可产生与阳性对照(载体DNA)相同的扩增条带，表明来自阳性转基因材料；同时，在阳性转基因材料中可检测到目标基因片段的表达(图2B)。

实施例2抗条锈菌小麦条锈病抗性鉴定

小麦条锈菌新鲜孢子的繁殖：温室内种植感病品种辉县红，一叶一心期用注射器注射孢子水溶液接菌，然后用喷壶喷水并搭盖塑料薄膜进行保湿。为保证充分发病可重复接菌2-3次，每次间隔1周。孢子水溶液的准备：取干燥、冻存(-80℃)的孢子，用适量自来水悬浮至淡橙色，室温下置于摇床震荡混匀30min(180rpm)，然后注射接菌。接菌后约20天可见零星发病，大约30天后可见大量叶片发病，可收集大量新鲜孢子用于转基因材料的接种鉴定。

利用T_1:2世代(收获实施例1中第一代转基因材料的种子)种子在温室大棚内种植并接种小麦条锈菌，鉴定其条锈病抗性。种植前一周温室浇水浇透，晾晒一周左右。挑选15粒健康饱满的转基因种子均匀点播，行距25cm，行长1m。每隔十行种植2行转基因受体品种CB037。待生长至一叶一心期，取新鲜孢子进行接菌，接种后浇水并搭盖塑料布保持高湿环境。为了保证接种成功，初次接种后每隔一周进行重复接种，重复三次，每株至少接种三个分蘖。野生型CB037充分发病后，对转基因材料进行抗病性调查并记录，每隔一周重复鉴定一次，重复三次。

利用温室鉴定的抗病材料，收获T_2:3世代种子后，在人工气候箱内进行重复鉴定。取干净的9cm培养皿，内置3层圆形滤纸，加入4mL去离子水，使滤纸浸湿。放置健康饱满的种子15～20粒/皿，盖上培养皿盖并用封口膜封口；用铝箔纸包裹避光于4℃冰箱内低温处理2～3天，打破种子休眠。于23℃光照培养箱中培养3～5d后移栽至土壤中，选取边长15cm的方形小花盆，每盆种植4棵。待植株长至一叶一心期，利用温室繁殖的条锈菌混合孢子进行接种。将孢子与滑石粉按大约1:10比例充分混匀后，用小毛刷蘸取孢子进行叶片接菌。接种后首先黑暗处理24h，温度11℃，湿度100％；然后进行正常光照培养，光照16h/温度22℃、黑暗8h/温度15℃，定期加湿，保持叶尖有水滴，至对照材料叶片充分发病(10-12天)。

如图3所示，其中A、C为野生型CB037，B、D为PC899转基因材料。温室种植T_1:2材料重复接菌三次之后，野生型CB037发病充分，叶片表面有大量孢子堆；而转基因材料叶片表面未见孢子堆产生，条锈病抗性效果明显。

如图4所示：A为野生型CB037；B为PC899转基因材料。人工气候箱中叶片接菌11-12天后，转基因受体CB037叶片表面布满大量的孢子；PC899阳性转基因植株叶片表面仅有部分褪绿现象，未见孢子堆，表明PSTG_11438基因的沉默表达可显著提高小麦对条锈菌的抗性。

实施例3抗条锈菌小麦中PSTG_11438基因的表达鉴定

小麦苗期叶片接菌12天后，野生型CB037叶片表面布满大量孢子堆。取CB037及转基因材料叶片约100mg，使用Trizol法提取RNA，制备cDNA用于实时荧光定量PCR。引物序列为CQM_11438-F3和CQM_11438-R3，具体序列如序列表Seq ID No.7、Seq ID No.8所示。以小麦条锈菌α微管蛋白基因为内参(黄雪玲等，农业生物技术学报，2012，20(2)：181-187)，引物TUBA-F/R序列如序列表Seq ID No.9、SeqID No.10所示。

PCR体系为：5μl 2×SYBR GreenMaster，正向与反向引物(10μM)各1μL，1μl cDNA，2μl ddH2O，总体系为10μl。PCR反应采用两步法：95℃10min，40个循环的95℃15s，60℃1min。

利用2^－△△CT算法分析各个基因的表达，利用SigmaPlot12.5软件作图。转基因小麦接种条锈菌11天后取材检测基因表达水平，小麦条锈菌PSTG_11438基因的荧光定量表达分析结果灰度图如图5所示，所选PC899单株为阳性转基因小麦，CB037为小麦转基因受体。不同颜色分别代表三次实验重复。与野生型CB037相比，转基因植株叶片中小麦条锈菌PSTG_11438基因的表达受到明显抑制，说明在小麦中表达RNAi沉默载体PC899，可有效降低侵染小麦的条锈菌中的目标基因的表达水平。

转基因小麦接种条锈菌后叶片组织染色观察结果如图6所示，A为PC899转基因材料，B为野生型CB037。小麦叶片接种条锈菌9天后，用WGA-FITC荧光染料染色。野生型CB037叶片中菌丝密集，表面可见孢子堆(B)；而转基因材料只在叶片内部观察到次生菌落且菌丝量少而短(A)。

由上述实施例可知，本发明提供的PSTG_11438基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将所述PSTG_11438基因应用于小麦条锈病防治中，通过沉默所述PSTG_11438基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 小麦条锈菌PSTG_11438基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 1

atggttttat ccgactgcaa agccacggct gtagcttcta accgccggat cacctcgaag 60

ctggtactcg taaccttatg tagcatcctt gtctgtagcg cagcggccca cgatatccat 120

gatttccggg gccgtcaagc tcctgccccc gtcgccccgg ccgcacctgc tgcccctaca 180

tcgatgccgg tgccaactcc cgtcacagtc tcacccgggg atctccaaac gttgaactac 240

ccaccaattg tgaaatcgat ggcaccttca accatgactg ctctcccggc cacttacact 300

gcggggacgc cttcccccat ccgtggcgct cctccgctac cttcggccaa cttgaatgtt 360

gcgttgtacc ctgctctgga ccgccttcct cctttagatt caccacttgt gaaagaatgg 420

atgagcaaaa ttgactggag caaggcgcca accagccccc cgaccggtct aggcggatgt 480

gtgaatgcca ctaacgcaga tgctgtagcc gacgccggga aagacgacaa ctgctggtgg 540

acctgcggtg gttgcacacg gccaactgac attgtctcct gtcccgacaa ggccacatgg 600

ggtgccagtt ttgacgatgg gccttcacca gacacaccga cgctactaaa ctacttggac 660

cagcaaaaac tgaagaccac cttctttgtc gtcgggtcaa gagtccttag tcgacctgct 720

atgcttcaat acgaatatca agcaggccat cagatctccg tccatacctg gtcccaccct 780

tacttaacaa ccttgacgaa cgaacaaatt gtcgcggagt tgggttggtc aaagaaagta 840

atcaaagacg tcttgggtgt cacgcccaac accatgcgac ctccatacgg tgatatcgat 900

gaccgagtgc gttacatcgc catggccatg ggcttgacac caatcatctg gacaactgct 960

ccctccggac agacttttga cacccaggac tggaaaatct ccactggaat cgtcactccc 1020

gcacaggtcc tgaaaaactt ccaggctatc attgctggtg ctcctgacct tccaactggg 1080

tttatcgttt tggcacacga tctctaccct caaagtgttg cgctcgccgt tgagttcgtt 1140

ttaccggccg caattgcagc tggaaaccta accatagaac ccatcatcac atgtctgggc 1200

aagccccttt ccgagggcta cattgaaacc gccaacaatg ccaacgcgtc aacatcggcc 1260

tcatcaaccc gatccggaac ctcgtcaggc tcggttagcg ctggctccaa ggctatgggc 1320

gcagccaaat cgaagatttc cgccagccct cgctcaatgg catgggattc aatccttatc 1380

attggcgcga gtgcccttgc catactcggt gtatactaa 1419

<210> 2

<211> 472

<212> PRT

<213> Puccinia striiformis PST-78

<400> 2

Met Val Leu Ser Asp Cys Lys Ala Thr Ala Val Ala Ser Asn Arg Arg

1 5 1015

Ile Thr Ser Lys Leu Val Leu Val Thr Leu Cys Ser Ile Leu Val Cys

202530

Ser Ala Ala Ala His Asp Ile His Asp Phe Arg Gly Arg Gln Ala Pro

354045

Ala Pro Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ser Met Pro Val

505560

Pro Thr Pro Val Thr Val Ser Pro Gly Asp Leu Gln Thr Leu Asn Tyr

65707580

Pro Pro Ile Val Lys Ser Met Ala Pro Ser Thr Met Thr Ala Leu Pro

859095

Ala Thr Tyr Thr Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Arg Gly Ala Pro Pro

100 105 110

Leu Pro Ser Ala Asn Leu Asn Val Ala Leu Tyr Pro Ala Leu Asp Arg

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Asp Ser Pro Leu Val Lys Glu Trp Met Ser Lys Ile

130 135 140

Asp Trp Ser Lys Ala Pro Thr Ser Pro Pro Thr Gly Leu Gly Gly Cys

145 150 155 160

Val Asn Ala Thr Asn Ala Asp Ala Val Ala Asp Ala Gly Lys Asp Asp

165 170 175

Asn Cys Trp Trp Thr Cys Gly Gly Cys Thr Arg Pro Thr Asp Ile Val

180 185 190

Ser Cys Pro Asp Lys Ala Thr Trp Gly Ala Ser Phe Asp Asp Gly Pro

195 200 205

Ser Pro Asp Thr Pro Thr Leu Leu Asn Tyr Leu Asp Gln Gln Lys Leu

210 215 220

Lys Thr Thr Phe Phe Val Val Gly Ser Arg Val Leu Ser Arg Pro Ala

225 230 235 240

Met Leu Gln Tyr Glu Tyr Gln Ala Gly His Gln Ile Ser Val His Thr

245 250 255

Trp Ser His Pro Tyr Leu Thr Thr Leu Thr Asn Glu Gln Ile Val Ala

260 265 270

Glu Leu Gly Trp Ser Lys Lys Val Ile Lys Asp Val Leu Gly Val Thr

275 280 285

Pro Asn Thr Met Arg Pro Pro Tyr Gly Asp Ile Asp Asp Arg Val Arg

290 295 300

Tyr Ile Ala Met Ala Met Gly Leu Thr Pro Ile Ile Trp Thr Thr Ala

305 310 315 320

Pro Ser Gly Gln Thr Phe Asp Thr Gln Asp Trp Lys Ile Ser Thr Gly

325 330 335

Ile Val Thr Pro Ala Gln Val Leu Lys Asn Phe Gln Ala Ile Ile Ala

340 345 350

Gly Ala Pro Asp Leu Pro Thr Gly Phe Ile Val Leu Ala His Asp Leu

355 360 365

Tyr Pro Gln Ser Val Ala Leu Ala Val Glu Phe Val Leu Pro Ala Ala

370 375 380

Ile Ala Ala Gly Asn Leu Thr Ile Glu Pro Ile Ile Thr Cys Leu Gly

385 390 395 400

Lys Pro Leu Ser Glu Gly Tyr Ile Glu Thr Ala Asn Asn Ala Asn Ala

405 410 415

Ser Thr Ser Ala Ser Ser Thr Arg Ser Gly Thr Ser Ser Gly Ser Val

420 425 430

Ser Ala Gly Ser Lys Ala Met Gly Ala Ala Lys Ser Lys Ile Ser Ala

435 440 445

Ser Pro Arg Ser Met Ala Trp Asp Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Ser

450 455 460

Ala Leu Ala Ile Leu Gly Val Tyr

465 470

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcggccg catcagcgtc catacctggt c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaggcgcgc cgtttcaatg tagccctcgg a 31

<210> 10

<211> 476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcagcgtcc atacctggtc ccacccttac ttaacaacct tgacgaacga acaaattgtc 60

gcggagttgg gttggtcaaa gaaagtaatc aaagacgtct tgggtgtcac gcccaacacc 120

atgcgacctc catacggtga tatcgatgac cgagtgcgtt acatcgccat ggccatgggc 180

ttgacaccaa tcatctggac aactgctccc tccggacaga cttttgacac ccaggactgg 240

aaaatctcca ctggaatcgt cactcccgca caggtcctga aaaacttcca ggctatcatt 300

gctggtgctc ctgaccttcc aactgggttt attgttttgg cacacgatct ctaccctcaa 360

agtgttgcgc tcgccgttga gttcgtttta ccggccgcaa ttgcagctgg aaacctaacc 420

atagaaccca tcatcacatg tctgggcaag cccctttccg agggctacat tgaaac 476

<210> 6

<211> 8673

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg atcgacagat 300

cccggtcggc atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca 360

ctatcggcga gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt 420

tgtgtacgcc cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc 480

caagctgcat catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg 540

cggagcatat acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag 600

tagcgcgtct gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc 660

tcgtattggg aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca 720

ttgtccgtca ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg 780

cagtcctcgg cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg 840

tcgtccatca cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca 900

cgccatgtag tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg 960

ctaagatcgg ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc 1020

agttcggttt caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag 1080

gtcaggctct cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat 1140

gcaaagtgcc gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc 1200

aggacatatc cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag 1260

agctgcatca ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc 1320

gcggtgagtt caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag 1380

agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 1440

tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 1500

gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 1560

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga 1620

acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact 1680

gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt 1740

accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc 1800

ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa 1860

gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg 1920

ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat 1980

ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa 2040

tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg 2100

tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg 2160

ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 2220

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2280

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2340

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2400

acgaattccc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg 2460

cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa 2520

acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc 2580

aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt 2640

tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgggtcat cagatctcgg tgacgggcag 2700

gaccggacgg ggcggtaccg gcaggctgaa gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca 2760

gttcccgtgc ttgaagccgg ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc 2820

gtgcatgcgc acgctcgggt cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc 2880

ctgtgcctcc agggacttca gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg 2940

gtggcggggg gagacgtaca cggtcgactc ggccgtccag tcgtaggcgt tgcgtgcctt 3000

ccaggggccc gcgtaggcga tgccggcgac ctcgccgtcc acctcggcga cgagccaggg 3060

atagcgctcc cgcagacgga cgaggtcgtc cgtccactcc tgcggttcct gcggctcggt 3120

acggaagttg accgtgcttg tctcgatgta gtggttgacg atggtgcaga ccgccggcat 3180

gtccgcctcg gtggcacggc ggatgtcggc cgggcgtcgt tctgggctca tggtagatcc 3240

ccggggatcc tctagagtcc cccgtgttct ctccaaatga aatgaacttc cttttccact 3300

atcttcacaa taaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tccggatatt 3360

accctttgtt gaaaagtctc aattgccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattt 3420

ttggagtaga caagtgtgtc gtgctccacc atgttgacga agattttctt cttgtcattg 3480

agtcgtaaga gactctgtat gaactgttcg ccagtcttta cggcgagttc tgttaggtcc 3540

tctatttgaa tctttgactc catggccttt gattcagtgg gaactacctt tttagagact 3600

ccaatctcta ttacttgcct tggtttgtga agcaagcctt gaatcgtcca tactggaata 3660

gtacttctga tcttgagaaa tatatctttc tctgtgttct tgatgcagtt agtcctgaat 3720

cttttgactg catctttaac cttcttggga aggtatttga tttcctggag attattgctc 3780

gggtagatcg tcttgatgag acctgctgcg taagcctctc taaccatctg tgggttagca 3840

ttctttctga aattgaaaag gctaatctgg ggacctgcag gcatgcaagc ttgcatgcct 3900

gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 3960

ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 4020

tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 4080

tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 4140

attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 4200

ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 4260

ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 4320

cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 4380

aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 4440

ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 4500

agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg 4560

gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 4620

ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 4680

caggcggcct cctcctcctc tcacggcacg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct 4740

ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc 4800

cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc 4860

gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc 4920

tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg 4980

tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg 5040

tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat 5100

ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg 5160

gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc 5220

ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 5280

atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 5340

gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 5400

ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 5460

ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 5520

tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 5580

tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 5640

gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 5700

aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 5760

tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 5820

acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 5880

acttctgcag gtcgactcta gaggatcccc cgggggtacc gggccccccc tcgaggtcat 5940

caccactttg tacaagaaag ctgggtcggc gcgccgtttc aatgtagccc tcggaaaggg 6000

gcttgcccag acatgtgatg atgggttcta tggttaggtt tccagctgca attgcggccg 6060

gtaaaacgaa ctcaacggcg agcgcaacac tttgagggta gagatcgtgt gccaaaacaa 6120

taaacccagt tggaaggtca ggagcaccag caatgatagc ctggaagttt ttcaggacct 6180

gtgcgggagt gacgattcca gtggagattt tccagtcctg ggtgtcaaaa gtctgtccgg 6240

agggagcagt tgtccagatg attggtgtca agcccatggc catggcgatg taacgcactc 6300

ggtcatcgat atcaccgtat ggaggtcgca tggtgttggg cgtgacaccc aagacgtctt 6360

tgattacttt ctttgaccaa cccaactccg cgacaatttg ttcgttcgtc aaggttgtta 6420

agtaagggtg ggaccaggta tggacgctga tgcggccgcg gagcctgctt ttttgtacaa 6480

acttgtgata agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca 6540

tctagtggat cccccgggct gcaggaattc gatcgagtga agatcccttt cttgttaccg 6600

ccaacgcgca atatgccttg cgaggtcgca aaatcggcga aattccatac ctgttcaccg 6660

acgacggcgc tgacgcgatc aaagacgcgg tgatacatat ccagccatgc acactgatac 6720

tcttcactcc acatgtcggt gtacattgag tgcagcccgg ctaacgtatc cacgccgtat 6780

tcggtgatga taatcggctg atgcagtttc tcctgccagg ccagaagttc tttttccagt 6840

accttctctg ccgtttccaa atcgccgctt tggacatacc atccgtaata acggttcagg 6900

cacagcacat caaagagatc gctgatggta tcggtgtgag cgtcgcagaa cattacattg 6960

acgcaggtga tcggacgcgt cgggtcgagt ttacgcgttg cttccgccag tggcgcgaaa 7020

tattcccgtg caccttgcgg acgggtatcc ggttcgttgg caatactcca catcaccacg 7080

cttgggtggt ttttgtcacg cgctatcagc tctttaatcg cctgtaagtg cgcttgctga 7140

gtttccccgt tgactgcctc ttcgctgtac agttctttcg gcttgttgcc cgcttcgaaa 7200

ccaatgccta aagagaggtt aaagccgaca gcagcagttt catcaatcac cacgatgcca 7260

tgttcatctg cccagtcgag catctcttca gcgtaagggt aatgcgaggt acggtaggag 7320

ttggccccaa tccagtccat taatgcgtgg tcgtgcacca tcagcacgtt atcgaatcct 7380

ttgccacgca agtccgcatc ttcatgacga ccaaagccag taaagtagaa cggtttgtgg 7440

ttaatcagga actgttcgcc cttcactgcc actgaccgga tgccgacgcg aagcgggtag 7500

atatcaagct tatcgatacc gtcatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tccgcggccg 7560

catcagcgtc catacctggt cccaccctta cttaacaacc ttgacgaacg aacaaattgt 7620

cgcggagttg ggttggtcaa agaaagtaat caaagacgtc ttgggtgtca cgcccaacac 7680

catgcgacct ccatacggtg atatcgatga ccgagtgcgt tacatcgcca tggccatggg 7740

cttgacacca atcatctgga caactgctcc ctccggacag acttttgaca cccaggactg 7800

gaaaatctcc actggaatcg tcactcccgc acaggtcctg aaaaacttcc aggctatcat 7860

tgctggtgct cctgaccttc caactgggtt tattgttttg gcacacgatc tctaccctca 7920

aagtgttgcg ctcgccgttg agttcgtttt accggccgca attgcagctg gaaacctaac 7980

catagaaccc atcatcacat gtctgggcaa gcccctttcc gagggctaca ttgaaacggc 8040

gcgccgaccc agctttcttg tacaaagtgg tgataagggc gaattccagc acactggcgg 8100

ccgttactag tggatccgag ctcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt 8160

ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat 8220

tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt 8280

atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca 8340

aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attcgatatc 8400

aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 8460

acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 8520

caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga gcagcttgag 8580

cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata 8640

ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt tta 8673

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcacaggtc ctgaaaaact 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgttggcgg tttcaatgta 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggacccac gctgccaata acta 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggagtcccg aacaattatc cgct 24