灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂及其应用。

背景技术

目前，癌症是严重威胁人类生命和健康的疾病，其中结肠癌的发病率近年呈明显上升趋势。2015年的癌症致死率统计结果显示，世界结直肠癌的发病人数是102万，发病率高居所有致死癌症的第三位，而其中中国患者17.7万，排所有国家第四位。然而，目前仍缺乏有效的结肠癌等癌症的治疗药物。

灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属植物，2005版中华人民共和国药典收载，列入山银花项下。忍冬属植物含有大量的皂苷，主要为常春藤型和齐墩果酸型皂苷。灰毡毛忍冬皂苷乙(Macranthoidin B，MB)是从常春藤型皂苷中提取出的有效单体成分，但是该单体水溶性差，口服给药生物利用度低，吸收差，显效较慢，影响了其临床效果。

乳剂是指互不相溶的两种液体在乳化剂存在下，其中一相液体以液滴状态分散于另一相液体中形成的非均相液体分散体系，根据连续相和分散相不同分成油包水型乳剂(W/O)和水包油型乳剂(O/W)以及复乳，前者连续相为油相，分散相为水溶液，后者连续相为水溶液，分散相为油相。乳剂根据粒径的大小可以分为：(1)普通乳：粒径介于100 0nm-100μm，体系具有比较高的自由能、热力学不稳定且不透明。(2)亚微乳：粒径在100～1000nm之间，外观半透明或不透明，呈浑浊或乳状。(3)微乳：粒径介于1-100nm，由Hoar和Schulan在二十世纪四十年代提出，是一种由水、油、表面活性剂和助表面活性剂组成的、光学上各向同性、热力学上稳定的溶液体系，通常为透明状，倾向于自发形成。纳米乳是液滴直径为纳米级的乳液，亚微乳和微乳统称为纳米乳。与普通的乳状液相比，纳米乳具有多方面的特点：质点很小且大小均匀，具有很高的稳定性，放置长时间不分层、不破乳；制备时可以不需要作功；且微乳为热力学稳定体系，离心不分层；而一般乳剂是热力学不稳定体系，制备时需外力作功，离心分层。

发明内容

本发明要解决灰毡毛忍冬皂苷乙难溶于水、口服吸收差的技术问题，提供一种灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，该制剂显著提高了灰毡毛忍冬皂苷乙的口服生物利用度。

此外，还需要提供一种上述灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，包含灰毡毛忍冬皂苷乙、油相、表面活性剂，该灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂是通过将灰毡毛忍冬皂苷乙、油相、和表面活性剂混合搅拌直至灰毡毛忍冬皂苷乙完全溶解制备获得。

所述油相包括单亚油酸甘油酯、辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、中链脂肪酸甘油酯、大豆油、花生油、角鲨烯、或油酸。

所述表面活性剂包括聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚乙二醇-8-甘油辛酸/癸酸酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、吐温-80、司盘-80、泊洛沙姆、或卵磷脂。

所述灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂可以制成任意剂型，包括胶囊、微囊、片剂、丸剂、或颗粒剂。

所述灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂的制备方法包括以下步骤：

将适量灰毡毛忍冬皂苷乙和油相混合均匀，加入表面活性剂，25℃～80℃搅拌，直至药物完全溶解，即得灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂。

在本发明的另一方面，还提供了上述灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂在制备治疗癌症的药物中的应用。

优选的，所述癌症包括结肠癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌。更优选的，所述癌症为结肠癌。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗结肠癌的药物，包含灰毡毛忍冬皂苷乙或上述灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂。

本发明的灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，能显著增加灰毡毛忍冬皂苷乙的水中溶解度，降低了药物制剂的体积，提高了灰毡毛忍冬皂苷乙的生物利用度。经体外细胞实验和体内动物实验证实，本发明的灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，能诱导人结肠癌细胞凋亡，有效抑制人结肠癌细胞的生长，并能显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，非常适于制备成治疗结肠癌等癌症的天然抗肿瘤药物，具有广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂在体外抑制人结肠癌细胞HCT-116生长的折线图；

图2是本发明实施例3灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡结果图；

图3是本发明实施例4灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂抑制人结肠癌移植瘤生长的瘤体积外形示意图；

图4是本发明实施例4灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂抑制人结肠癌移植瘤生长的瘤体积折线图。

具体实施方式

本发明提供了一种灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，包含灰毡毛忍冬皂苷乙、油相、表面活性剂，该灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂是通过将灰毡毛忍冬皂苷乙、油相、和表面活性剂混合搅拌直至灰毡毛忍冬皂苷乙完全溶解制备获得。

将本发明灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂加入体外培养的人结肠癌HCT-116细胞中，可诱导该结肠癌细胞凋亡，并能抑制结肠癌细胞生长。在体内动物实验中，将本发明灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂对携带人结肠癌HCT-116细胞移植瘤的裸鼠进行腹腔注射，能明显抑制人结肠癌HCT-116细胞移植瘤生长，从而证明本发明灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂能在体内有效抑制肿瘤生长。

下面通过具体实施例阐述本发明。

实施例1灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂的制备

本发明中选择的油相有MCT、大豆油、花生油、角鲨烯、油酸等，表面活性剂有聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、吐温-80、司盘-80、泊洛沙姆、卵磷脂等。

1)精密称取灰毡毛忍冬皂苷0.01～0.5g，溶解于油相(MCT中链脂肪酸甘油酯、大豆油、花生油等)0.5～2g；

2)按聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)(或者聚氧乙烯蓖麻油或吐温-80或泊洛沙姆)：司盘-80(SP80)质量比1～6：1配制混合乳化剂；

3)将1)与2)混合均匀，于25～80摄氏度水浴及磁力搅拌下加入去离子水，即可形成O/W型自微乳。

实施例2灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂抑制人结肠癌HCT-116细胞生长

1.细胞培养

取人结肠癌细胞HCT-116(购自中科院细胞所)加入含100单位/ml青毒素、10μg/ml链霉素及10％小牛血清的DMEM养基，在37℃、5％CO2条件下恒温培养箱中培养，待细胞增殖进入对数生长期，进行实验。

2.MTT法检测灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂对细胞增殖的影响

MTT法的主要原理是利用具有活性细胞中线粒体将MTT转变为蓝紫色沉淀物，且活细胞数量越多沉淀物也越多，该沉淀物不溶于水，但能被DMSO溶解，因此可以使用全自动酶标仪在450nm的波长下检测其吸光值来间接观察活细胞的数量。为此，本发明设计该实验观察灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂(简称纳米化MB)对细胞的毒性作用，实验中灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂的浓度为20ug/ml。使用酶联免疫监测仪选择450nm波长测定各孔吸光度值。数值取3孔平均值为准，利用公式计算抑制率。

结果如图1所示，本发明灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂在体外能抑制人结肠癌细胞HCT-116的生长。

实施例3灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡

1.细胞培养

取人结肠癌细胞HCT-116(购自中科院细胞所)加入含100单位/ml青毒素、10μg/ml链霉素及10％小牛血清的DMEM养基，在37℃、5％CO2条件下恒温培养箱中培养，待细胞增殖进入对数生长期，进行实验。

2.流式细胞仪检测灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂对细胞凋亡的影响

分别取处于对数生长期的HCT-116细胞接种至6孔板内培养24小时后，加入实施例1制备的灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂，各空白对照组只加入培养基。继续培养72小时。分别将6孔板内培养液小心吸弃至10ml离心管内，PBS洗涤贴壁细胞后使用不含EDTA的胰酶将细胞消化。细胞消化后与前步骤细胞培养液混匀，1000r/min离心5min。收集离心后沉淀物，用PBS重悬后行细胞计数。取1×10⁵重悬细胞，1000r/min离心5min后吸弃上清液，再使用500μl结合液重悬细胞。分别往凋亡试管内加入5μl>

结果如图2所示，本发明灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂在体外能使人结肠癌细胞HCT-116的凋亡率增高，诱导人结肠癌细胞HCT-116的凋亡，肿瘤细胞凋亡率增高与抗肿瘤作用有关。

实施例4灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂抑制人结肠癌移植瘤的生长

1.细胞培养

取人结肠癌细胞HCT-116(购自中科院细胞所)加入含100单位/ml青毒素、10μg/ml链霉素及10％小牛血清的DMEM养基，在37℃、5％CO2条件下恒温培养箱中培养，待细胞增殖进入对数生长期，进行实验。

2.灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂抑制结肠癌移植瘤的生长

体外培养并收获HCT-116细胞，用PBS洗涤细胞，并制成密度为10⁷细胞/毫升的细胞悬液，每只裸鼠(Ba1b/C裸鼠，购自广州中医药大学动物实验中心)于右腋前皮下接种0.1毫升细胞悬液(10⁶个细胞)。继续饲养动物一周，待肿瘤长至100mm³时将小鼠随机分成为纳米化灰毡毛忍冬皂苷乙治疗组和随机序列阴性对照组，每组8只。用游标卡尺测量每个肿瘤的长径和短径，并做记录。通过公式:肿瘤体积＝长径X短径2/2，计算肿瘤体积。

对裸鼠腹腔用碘伏消毒，将40-60u1灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂(简称纳米化MB)注射到对应组别的小鼠腹腔中(3mg/Kg)。隔天测量并注射一次，共给药9次。将每次所得数据依上述公式计算每个肿瘤的体积。

结果如下表1和图3、4所示，灰毡毛忍冬皂苷乙自微乳制剂能有效抑制结肠癌移植瘤的生长。

表1纳米化MB对裸鼠hct接种瘤的抑制作用

*与模型对照组比较

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。