公开/公告号CN108125983A
专利类型发明专利
公开/公告日2018-06-08
原文格式PDF
申请/专利权人 遵义市第一人民医院;
申请/专利号CN201810094528.8
申请日2018-01-31
分类号A61K35/28(20150101);A61K31/58(20060101);A61P25/28(20060101);A61P29/00(20060101);A61P25/00(20060101);A61P39/06(20060101);
代理机构52112 遵义浩嘉知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人李雪梅
地址 563002 贵州省遵义市汇川区凤凰路98号
入库时间 2023-06-19 05:31:18
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-28
授权
授权
2018-07-03
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K35/28 申请日:20180131
实质审查的生效
2018-06-08
公开
公开
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，特别涉及使用丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植抗阿尔茨海默病神经炎症的应用。
背景技术
中国国家统计局《2016年国民经济和社会发展统计公报》数据显示，中国13.82亿人口中，60岁及以上的老人2.3亿人，占总人口比例为16.7%；65岁及以上人口数为1.5亿人，占比10.8%，中国已经成为世界上老龄化最严重的国家。伴随着老龄化社会的到来，以阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和帕金森病为主的神经退行性疾病的发病率也逐年上升。由于神经退行性疾病能够严重影响患者的生活自理能力，不仅会给社会和家庭带来沉重的经济负担，还将严重降低患者晚年的生活质量。因此对神经退行性疾病的防治具有重要的现实意义。
AD是以老年斑（senile plaque，SP）和神经纤维缠结（neurofibril tangle，NFT）为主要病理特征的神经退行性疾病。研究表明错误折叠和沉淀的蛋白与小胶质细胞模式识别受体的结合，是神经炎症异常激活的重要因素，而异常激活的神经炎症反应是AD进行性加重和发展的重要原因。早在1982年，炎症相关蛋白、补体因子和免疫球蛋白就已经在AD患者的老年斑中被发现。此后，进一步研究发现，在老年斑周围有大量被激活的小胶质细胞聚集，并且小胶质细胞异常激活引起的神经炎症促进tau蛋白形成神经纤维缠结。可溶性β-淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）可通过胞外蛋白酶解系统降解，但引起AD最主要的纤维状Aβ却是由小胶质细胞清除的，小胶质细胞可以通过相关受体识别Aβ从而被激活，主要包括白细胞分化抗原36（cluster of differentiation 36，CD36）、CD14、CD47、α6β1整合素，和TLRs（2、4、6和9）。激活的小胶质释放大量的细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β等）、NO和补体相关蛋白等，最初急性的炎症反应有助于清除Aβ和恢复内环境稳定，但持续的细胞因子浸润和免疫应答引起慢性神经炎症反应，负反馈调节使得Aβ吞噬受体表达下调，最终导致小胶质细胞吞噬能力不足，使Aβ进一步沉积，形成恶性循环，最终导致神经元结构和功能改变。此外，这些促炎细胞因子可能通过相关信号通路的传导，使NF-κB、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等表达上调，从而诱导神经元变性凋亡。这些细胞因子几乎参与了神经炎症的整个过程，并且是AD病人进行性功能丧失的重要原因。
间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cells)是最初在骨髓发现的，一种发源于中胚层的多功能干细胞，在特定的环境刺激下，具有分化成特定成熟细胞（神经、骨、心肌等细胞）的能力，是再生医学中用于修复的理想种子细胞。而MSC最引人注意的是其很强的免疫调节能力，在人体不同的炎症情况下，表现出惊人的调节能力。在炎症较弱的情况下，它可以促进免疫反应；而在炎症反应很强时，它可以抑制免疫反应，最终使体内的炎症免疫反应维持在一个合理的范围之内。除此之外，有研究者发现MSC拥有其他干细胞所没有的优点，在干细胞中只有它还有向损伤组织定向迁移的能力。正是这种可塑性和向损伤组织定向迁移的能力，使得MSC在抗阿尔茨海默病神经炎症中表现出良好的应用前景。
但是MSC的临床应用依然面临着很多的问题和挑战：由于MSC的数量不够，所以需要经过体外扩增后才能满足临床的大量需要；而经过扩增的MSC其干性往往会比初代的MSC低，出现老化，根据环境分化成具体成熟细胞的能力降低。
发明内容
因此为了解决体外扩增后的MSC在抗阿尔茨海默病神经炎症中的应用价值降低的技术问题，因此本发明提供的丹参酮ⅡA干预MSC的方法，将对调控阿尔茨海默病患者大脑内的神经炎症，阻止疾病的进行性加重具有重要的现实意义，将会在很大程度上改善患者晚年的生活质量。
丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植抗阿尔茨海默病神经炎症的应用，首先分离培养间充质干细胞，然后应用浓度为6～12μM的丹参酮IIA干预间充质干细胞 48～84h。进一步地，丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞可以制备或作为抗阿尔茨海默病神经炎症的药物进行应用。优选地，当丹参酮IIA对间充质干细胞的应用浓度为10μM、干预间充质干细胞的时间为 48 h时，对阿尔茨海默病神经炎症的治疗和预防效果更加显著。
丹参酮ⅡA用于制备间充质干细胞减少阿尔茨海默病经炎症导致的毒性蛋白的药物中的应用。进一步地，丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞可以制备或作为减少阿尔茨海默病经炎症导致的毒性蛋白的药物进行应用。
丹参酮ⅡA用于制备间充质干细胞减少或抑制阿尔茨海默病神经炎症导致的神经元凋亡的药物中的应用。进一步地，丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞可以制备或作为减少或抑制阿尔茨海默病神经炎症导致的神经元凋亡的药物进行应用。
丹参酮ⅡA用于制备间充质干细胞增加阿尔茨海默病神经炎症神经元抗氧化能力的药物中的应用。进一步地，丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞可以制备或作为增加阿尔茨海默病神经炎症神经元抗氧化能力的药物进行应用。
进一步地，丹参酮ⅡA在制备或作为促进间充质干细胞分化为神经元的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞在制备或作为用于改善神经元形态的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞在制备或作为增加神经元数量的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞在制备或作为增加神经递质的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞在制备或作为减轻脂质发生过氧化反应的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞在制备或作为抑制β淀粉样沉淀生成的药物中的应用。
进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞在制备或作为增加神经元分解过氧化酶的能力的药物中的应用。
本发明丹参酮ⅡA干预的MSC移植抗阿尔茨海默病神经炎症的应用，可以体现为丹参酮ⅡA干预MSC的具体干预时间和浓度。在动物模型验证丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植抗阿尔茨海默病神经炎症的作用，通过Aβ25-35大鼠侧脑室注射法建立AD大鼠模型，将足量的上述丹参酮ⅡA处理过的MSC（在具体操作时，BMSC浓度可以为1×106个细胞每毫升）定位定量接种于AD模型大鼠的海马部位，应用Morris水迷宫对AD模型大鼠进行学习记忆能力评价；取脑、血清等组织，测定免疫器官指数、氧化抗氧化相关指标、细胞凋亡，并检测神经损伤与再生相关基因和蛋白的表达。这些结果表明丹参酮ⅡA>
附图说明
图1为间充质干细胞图片（左边是正常的，右边是丹参酮ⅡA干预后的）；
图2 为间充质干细胞流式鉴定图；
图3为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠HE染色的影响；
图4 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠石蜡切片tunel的影响；
图5为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠硫黄素染色的影响（白色箭头所示为淀粉体沉淀）；
图6 丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠NeuN的影响（黑色箭头所示为NeuN）；
图7为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠NSE的影响（黑色箭头所示为NSE）；
图8 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠ACH的影响；
图9 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠SOD的影响；
图10 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠T-AOC的影响；
图11 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠GSH-PX的影响；
图12 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠MDA的影响；
图13 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠的AMPK、Tau、Aβ mRNA表达的影响；
图14 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠的AMPK、Tau、Aβ 蛋白表达的影响；
图15 为丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠的主要炎症因子IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 蛋白表达的影响。
具体实施方式
以下通过实施例进行验证丹参酮IIA干预的间充质干细胞移植具有明显的抗阿尔茨海默病神经炎症的效果。但以下实施例仅为验证本发明的效果，并不限定本发明的保护范围。
本发明中所述的试剂若无特殊说明均可以通过市购获得。本发明中的干细胞可以通过本领域常规的技术方法获得或者通过市购获得。
丹参酮IIA干预的间充质干细胞移植具有抗阿尔茨海默病神经炎症作用的实验步骤：
1.分组：正常对照组、假手术组（钻开颅骨后即缝合伤口）、模型组(注射Aβ蛋白+无血清DMEM)、干细胞组（只注射干细胞（用无血清DMEM稀释））、丹参酮IIA干预的干细胞组 （丹参酮+干细胞）。
2.丹参酮IIA浓度：6～12 μM；作用时间：48～84 h进行干预。
3.干细胞鉴定：采用特异生物标记CD24、34、90，采用流式细胞仪进行鉴定。
4.制模：大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g），麻醉后固定于大鼠脑立体定位仪上，右侧海马区进针，坐标为：AP-4 mm(前囟后)，MR-2．8 mm(中线右侧)，H-3 mm(自脑膜起的深度)。定位后钻开颅骨，微量注射器垂直进针3 mm，以0.2uL·min-1的速度缓慢注入2μl>25-35(10μg)，留针5min。NS组相应脑区注入等体积NS，假手术组钻开颅骨后即缝合伤口。制模后1周，开始给干细胞治疗，治疗时间为2周。（干细胞只注射一次，注射部位同前）。
5.血清——氧化、抗氧化指标：大鼠血清丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX) 活性。
6.神经再生指标：神经元特异性烯醇化醇 NSE（免疫组化）及神经元的核蛋白(NeuN)检测。
7.凋亡检测：脑组织切片tunel法检测。
8.采用硫黄素染色检测淀粉体沉淀。
9.采用PCR法检测丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠的AMPK、Tau、AβmRNA表达的影响。
10.采用western blot法检测丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植AD大鼠的AMPK、Tau、Aβ 蛋白表达的影响。
11.采用ELISA法检测主要炎症因子IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 蛋白表达变化情况。
统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件处理，各项指标的数据以均数±标准误（mean ± SEM）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）SNK检验，方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett's T3检验，P≤0.05认为有统计学意义，所有图表均使用GraphPad>
研究中发明人意外的表明，丹参酮IIA浓度：6～12 μM；作用时间：48～84 h，采用该条件进行干预间充质干细胞移植具有非常明显的抗阿尔茨海默病神经炎症的作用，因此可采用丹参酮ⅡA用于制备间充质干细胞并将其用于制备对抗因阿尔茨海默病神经炎症而引起的相关症状有治疗或预防作用的药物。经过实验证明，丹参酮ⅡA具有用于制备间充质干细胞减少阿尔茨海默病经炎症导致的毒性蛋白的药物的用途。经过实验证明，丹参酮ⅡA具有用于制备间充质干细胞减少阿尔茨海默病神经炎症导致的神经元凋亡的药物的用途。经过实验证明，丹参酮ⅡA具有用于制备间充质干细胞增加阿尔茨海默病神经炎症神经元抗氧化能力的药物的用途。
优选的，当丹参酮IIA浓度为10 μM；作用时间：48 h时，上述效果会更加显著。附图1～15，为该条件下的各项检测结果，从图1～15中可看出经过丹参酮ⅡA处理后的各项实验变化：
从图1中可看出经过丹参酮ⅡA处理后间充质干细胞的细胞形态更为清晰，形态上更为接近神经元。进一步地，丹参酮ⅡA可以制备或作为促进间充质干细胞分化为神经元的药物进行应用。
从图2中可看出，经过流式细胞术鉴定，实验所使用的骨髓间充质干细胞符合实验要求。
从图3 中可看出，HE染色结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠海马形态更为接近正常，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显改善神经元形态。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为用于改善神经元形态的药物进行应用。
从图4中可看出，Tunel染色结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠海马凋亡细胞比模型组明显减少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显抑制神经元凋亡。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为抑制神经元凋亡的药物进行应用。
从图5中可看出，硫黄素S染色结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠海马β淀粉样沉淀比模型组明显较少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显抑制β淀粉样沉淀生成。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为抑制β淀粉样沉淀生成的药物进行应用。
从图6中可看出，核蛋白NeuN神经元特异染色结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠海马神经元比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经元数量。从图7中可看出，神经元特异性烯醇化醇NSE结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠海马神经元比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经元数量。进一步地，图6和图7的结果表明，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为增加神经元数量的药物进行应用。
从图8中可看出，乙酰胆碱ACH结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的ACH比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经递质。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为增加神经递质的药物进行应用。
从图9中可看出，超氧化物歧化酶SOD结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的SOD比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经元抗氧化能力。从图10中可看出，总抗氧化能力T-AOC结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的T-AOC比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经元抗氧化能力。进一步地，图9和图10说明，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为增加神经元抗氧化能力的药物进行应用。
从图11中可看出，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的GSH-Px比模型组明显增加，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显增加神经元分解过氧化酶的能力。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为增加神经元分解过氧化酶的能力的药物进行应用。
从图12中可看出，丙二醛MDA结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的MDA比模型组明显减少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显减轻脂质发生过氧化反应。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为减轻脂质发生过氧化反应的药物进行应用。
从图13中可看出， AMPK、Tau、Aβ mRNA结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的AMPK mRNA比模型组增加、Tau和Aβ mRNA比模型组减少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显激活AMPK通路，抑制毒性蛋白mRNA的生成。从图14中可看出，AMPK、Tau、Aβ 蛋白的结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的AMPK 蛋白比模型组增加、Tau和Aβ 蛋白比模型组减少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显激活AMPK通路，抑制毒性蛋白的生成。进一步地，图13和图14表明，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为抑制毒性蛋白mRNA的生成的药物进行应用。
从图15中可看出，主要炎症因子IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 蛋白的结果为：移植经过丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞的AD大鼠的主要炎症因子比模型组减少，说明丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞能明显抑制神经炎症。进一步地，丹参酮ⅡA处理后的间充质干细胞可以制备或作为抑制神经炎症的药物进行应用。
本发明的保护范围不仅限于具体实施方式所公开的技术方案，凡将丹参酮ⅡA干预的间充质干细胞移植，从而对阿尔茨海默病的神经炎症进行调控的主要技术手段，以及在上述技术方案内容上进行的微小改进及等同替换，均属于本发明的保护范围。
机译： 雷帕霉素36-des（3-甲氧基-4-羟基环己基）-36-（3-羟基环肽基）衍生物;复合;药物组合物;癌症和/或B细胞恶性肿瘤的治疗方法，诱导或维持免疫抑制，移植排斥反应，移植物抗宿主病，自身免疫性疾病，炎症，血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元或治疗真菌感染;该化合物的用途;该化合物的制备方法;和组成或零件套件
机译： 39-脱甲氧基-39-甲基雷帕霉素衍生物;复合;药物组合物;治疗b细胞癌或恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫性疾病的方法;炎症，血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元再生或用于治疗真菌感染;使用化合物;制备式（i）化合物的方法;零件的组成和套件
机译： 脂肪组织来源的间充质干细胞在移植物抗宿主病治疗中的应用
