抗氧化斯科曼氏球菌W17及其应用

技术领域

本公开涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种新的斯科曼氏球菌。本 发明还涉及该菌作为抗氧化功能菌株方面的应用。

背景技术

适宜的环境条件是植物良好生长的前提，植物受到非生物胁迫(辐射、 氧化、高盐、高渗透压及高温等)时，其生长会受到抑制。其中，氧化胁迫 产生活性氧自由基对基因组DNA和细胞内的生物大分子(尤其是蛋白质)均 会造成严重损伤。

筛选具有抗氧化性能的菌株，鉴定其相关功能基因，进而转化入植物中， 有助于培育具有抗逆性能的植物，以适应外界不断变化的气候环境，具有重 要的现实意义。

新疆特有的地理气候环境孕育了大量抗逆微生物，土壤微生物通过不断 适应环境，进化形成合成类胡萝卜素的能力，进而抵御包括氧化在内的逆境 胁迫。

目前，已报道的具有氧化胁迫抗性的菌株多为革兰氏阳性菌，例如耐辐 射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1)、戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis I-0)等，还未见报道Skermanella属的革兰氏阴性菌具有抗氧化功 能。

发明内容

本发明的目的是分离出具有抗氧化能力的新种微生物。

本发明提供了一种斯科曼氏球菌，该斯科曼氏球菌的保藏编号为GDMCC 60236，且该斯科曼氏球菌为抗氧化的斯科曼氏球菌W17 (Skermanella sp W17)。

本发明还提供了如上所述的斯科曼氏球菌作为抗氧化功能菌株的应用。

本发明的抗氧化斯科曼氏球菌W17为Skermanella属的革兰氏阴性菌， 该属从未有报道具有氧化抗性的菌株。通过对其氧化抗性机理的研究，可以 进一步加深人们氧化抗性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得 其它优良性状。

因此，本发明的抗氧化斯科曼氏球菌W17，可以直接作为抗氧化转基因 生物的基因供体，将其优良的抗氧化基因转入其它生物体中，使其可以获得 优良的抗逆性状；同时，它也可能作为新的基因工程菌株，通过接受外来其 它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行 性状的改良，还可以获得更多优良性状的菌株。本发明的抗氧化斯科曼氏球 菌W17可以用于氧化性污水(例如双氧水污水)的处理。对研究其氧化抗 性机理、促进新的DNA技术在环境保护、生物修复、人类健康等的发展有 着重要意义。

生物材料保藏信息：

名称：抗氧化斯科曼氏球菌W17(Skermanella sp W17)

提议的分类学名称：Skermanella sp.

保藏编号：GDMCC No.60236

保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼

保藏时间：2017年9月15日。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与 下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在 附图中：

图1抗氧化斯科曼氏球菌W17与其它斯科曼氏球菌属成员之间的进化 分析(基于16S rDNA序列分析)；

图2抗氧化斯科曼氏球菌W17与对照菌株大肠杆菌(Escherichia coli K12)的抗氧化能力对比；

图3抗氧化斯科曼氏球菌W17的菌落形态；

图4抗氧化斯科曼氏球菌W17的透射电镜图片。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是， 此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公 开。

本发明人从新疆阿勒泰地区贾登峪的白桦林间的土壤中分离培养出一 种新的菌种，经鉴定确认该菌属于斯科曼氏球菌属，被命名为抗氧化斯科曼 氏球菌W17，Skermanella sp W17该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单 位广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2017年9月15日，保藏登 记号为GDMCC No.60236。

本发明发现该菌具有抗氧化功能。

所述的抗氧化斯科曼氏球菌W17的培养条件为：

(1)采用TSA琼脂培养基，具体配方为：酪蛋白水解物17g/L，大豆 酶解蛋白3g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖2.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L。

(2)pH＝7.3±0.2；

(3)培养温度：30℃。

本发明的抗氧化斯科曼氏球菌W17(Skermanella sp W17)具有下述性 质：

1.形态特征

在透射电镜下可见，为椭圆状细菌，具有端生鞭毛(图4)。

2.在各种培养基上的特征：

在R₂A琼脂培养基上，菌落呈现淡粉色、凸起状，表面湿润，边缘整齐，>

3.生理生化特征

该菌株为好氧生长，革兰氏阴性，白氨酸芳胺酶阳性，酸性磷酸酶阳性，α- 葡萄糖甙酶阳性，脲酶阴性，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶阴性，不产生H₂S。

4.碳源利用

能够以葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露糖为碳源，但不能以麦芽糖为碳源。

5.其它性质

最适生长温度为28℃。细胞壁脂肪酸含有Summed Feature 8(C_18:1ω7c>18:1ω6c),Summed>12:0aldehyde>18:1ω7c>18:1ω6c)为主。

本发明发现的抗氧化斯科曼氏球菌W17(Skermanella sp W17)的16S rDNA与同属的其它种的差异显著(相似度<98％)：

与Skermanella rosea M1的相似度为97.735％；

与Skermanella mucosa_8-14-6的相似度为97.438％；

与Skermanella aerolata_5416T-32的相似度为96.861％；

与Skermanella stibiiresistens_SB22的相似度为96.335％；

与Skermanella parooensis_ACM 2042的相似度为94.337％；

与Skermanella xinjiangensis_10-1-101的相似度为93.452％

此外，与斯科曼氏球菌属标准菌株-Skermanella parooensis ACM 2042以 及近缘菌株Skermanella rosea M1的对比实验显示，本发明发现的抗氧化斯 科曼氏球菌W17与以上两菌株的微生物学特性有显著差异。

表1抗氧化斯科曼氏球菌W17与Skermanella parooensis ACM 2042及Skermanella rosea M1的微生物学特性比较

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

本发明所述的抗氧化斯科曼氏球菌W17具有良好的氧化抗性，在20mM H₂O₂冲击30min后，菌株生长仅减弱一个数量级，而对照菌株大肠杆菌(E.>

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1抗氧化斯科曼氏球菌W17的分离培养

于新疆阿勒泰地区贾登峪的白桦林间采集土样。取土样1g左右，加入 20mL LB培养基中于30℃、200rpm下富集培养112小时，取富集培养物 100μL，按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6依次梯度稀释，分别取200μL>2A琼脂培养基平板上，倒置于30℃培养箱中培养几天，即可获得>

R₂A琼脂培养基：酪蛋白水解物0.5g/L；酵母提取物0.5g/L；胰蛋白>

实施例2抗氧化斯科曼氏球菌W17的氧化抗性试验

1、试验方法

(1)将本发明所述的抗氧化斯科曼氏球菌甘油保藏管LB平板划线活 化,30℃倒置培养；

(2)挑取平板上的菌落，接种到LB液体培养基中，30℃，200rpm,过 夜摇菌；

(3)测定OD₆₀₀，按照目的OD₆₀₀＝0.1～0.2，添加到新鲜LB液体培养>600为0.6～0.8；

取100μL菌液加到900μL PBS EP管中作为未处理样品，依次稀释10^-1、

10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6待用；

(5)取1mL菌液于EP管中(取7管)，避光条件下，依次加入H₂O₂，>

(6)30min后迅速稀释各个样品至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；

(7)LB平板上点样8μL，将平板晾干后，30℃倒置培养。

同时以OD₆₀₀＝0.3的大肠杆菌(Escherichia>

2、结果

实验结果表明，本发明菌株抗氧化斯科曼氏球菌W17(Skermanella sp. W17)在20mM H₂O₂冲击30min后，菌株生长仅减弱一个数量级，而对照>

实施例3抗氧化斯科曼氏球菌W17菌株16S rDNA的提取

本发明还提供了该抗氧化斯科曼氏球菌W17(Skermanella sp.W17)的 基因组提取、16S rDNA的扩增及测序方法，具体按照下述操作进行：

1.基因组提取方法

本发明所述的抗氧化斯科曼氏球菌W17基因组使用公司的 细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)进行提取，详见其说明书。

2.PCR扩增方法

本发明所述的抗氧化斯科曼氏球菌W17的16S rDNA的PCR扩增所用 的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京 六合华大基因科技有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于南京诺唯赞生物 科技有限公司。

正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)，

反向引物1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。

PCR扩增体系为：

PCR反应程序：95℃，5min；30个循环(95℃，30s；51℃，30s；72℃ 1.5min)；72℃，5min。

将扩增得到的16S rDNA序列，连接于公司的pJET 1.2/blunt 载体上，委托北京六合华大基因科技有限公司对于插入序列进行测序。测序 结果包括：16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。本发明发现的抗氧化斯科 曼氏球菌W17(Skermanella sp W17)的16S rDNA与同属的其它种的差异 显著(相似度<98％)：

与Skermanella rosea M1的相似度为97.735％；

与Skermanella mucosa_8-14-6的相似度为97.438％；

与Skermanella aerolata_5416T-32的相似度为96.861％；

与Skermanella stibiiresistens_SB22的相似度为96.335％；

与Skermanella parooensis_ACM 2042的相似度为94.337％；

与Skermanella xinjiangensis_10-1-101的相似度为93.452％。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限 于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开 的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 抗氧化斯科曼氏球菌W17及其应用

<130> 9253CAAS_B

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1375

<212> DNA

<213> 斯科曼氏球菌(Skermanella sp. )

<400> 1

catgcagtcg aacgagggtc tcgcttcggt ggggccctag tggcgcacgg gtgagtaacg 60

cgtgggaacc tgccctgtgg tacggaataa ctccgggaaa ctggagctaa taccgtatgt 120

gtcccctggg acaaagattc atcgccacgg gatgggcccg cgtaggatta gcttgttggt 180

ggggtaacgg cctaccaagg cttcgatcct tagctggtct gagaggatga tcagccacac 240

tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg 300

ggcgcaagcc tgatccagca atgccgcgtg agtgatgaag gccttcgggt tgtaaagctc 360

tttcgcacgc gacgatgatg acggtagcgt gagaagaagc cccggctaac ttcgtgccag 420

cagccgcggt aatacgaagg gggctagcgt tgttcggaat tactgggcgt aaagggcgcg 480

taggcggtgt gtcaagtcag gcgtgaaagc cccgggctca acctgggaac agcgcttgag 540

actggcacgc tcgagttcgg gagaggatgg tggaattccc agtgtagagg tgaaattcgt 600

agatattggg aagaacaccg atggcgaagg cagccatctg gaccgacact gacgctgagg 660

cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 720

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tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcatc 1020

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aaggcgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttatgggc tgggctacac acgtgctaca 1140

atggtggtga cagtgggcag cgagaccgcg aggtcgagcc aatctccaaa agccatctca 1200

gttcggattg cactctgcaa ctcgggtgca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1260

agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1320

ttggctttac ccgaagccgg tgcgctaact cggcaacgag aggcagccga ccacg 1419

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat catggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacggttacc ttgttacgac tt 22