一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器及其制备方法和在DNA检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器及其制备方法和在DNA检测中的应用。

背景技术

生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物敏感材料作识别元件、适当的理化换能器及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器具有接受器与转换器的功能。随着分子生物学研究的深入，对脱氧核糖核苷酸的检测手段变得越来越重要。传统的凝胶电泳法需要经过放射性标记、聚合酶链式反应、电泳等一系列操作过程，消耗时间长，劳动强度大。在这种情况下，以碱基配对为基础的DNA传感器应运而生。用DNA传感器不仅省去了放射性标记的危险性，而且免除了电泳操作带来的时间和人力的大力消耗，因此近些年来受到了全世界科技工作的广泛重视。目前广泛应用于DNA检测的传感器根据不同的检测信号产生原理，具体分为石英晶体传感器、电化学传感器、光纤传感器、光波导传感器、表面等离子传感器等。

近年来，高灵敏度和高选择性的石墨烯场效应晶体管生物传感器已被用于DNA的检测。但是现有技术中的石墨烯场效应晶体管生物传感器均采用两电极结构，在用于DNA检测时，需要将金纳米粒子固定在石墨烯上，然后连接DNA，操作困难；并且，低压下的灵敏度低，为了提高灵敏度，需要提高两电极之间的电流，安全性差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器及其制备方法和在DNA检测中的应用。本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器无需金纳米粒子固定DNA，使用方便，并且在较低的使用电压下具有较高的灵敏度，安全性好。

本发明提供了一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器，包括电子级玻璃和设置于所述电子级玻璃上的栅极、源极和漏极；所述源极和漏极之间设置有石墨烯沟道；所述栅极表面固定有单链DNA。

优选的，所述石墨烯沟道的宽度为0.2～0.3mm，石墨烯沟道的长度为4～8mm。

优选的，所述石墨烯沟道为单层石墨烯。

优选的，所述栅极、源极和漏极独立地包括铬层和金层，所述铬层位于电子级玻璃和金层之间。

优选的，所述铬层的厚度为6～10nm，所述金层的厚度为70～90nm。

优选的，所述单链DNA经巯基修饰固定于栅极表面。

本发明还提供了上述技术方案所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)在电子级玻璃表面制备栅极、源极和漏极，使所述源极和漏极之间存在沟道；

(2)将石墨烯平铺在源极和漏极之间的沟道上，得到石墨烯晶体管；

(3)在所述步骤(2)得到的石墨烯晶体管的栅极表面固定单链DNA，得到基于石墨烯晶体管的DNA传感器。

优选的，所述步骤(1)中栅极、源极和漏极的制备包括：采用热蒸发镀膜法在电子级玻璃表面依次蒸镀铬层和金层。

优选的，所述步骤(2)中石墨烯的平铺包括：采用湿法转移将金属基底单层石墨烯转移至源极和漏极之间的沟道上。

本发明还提供了上述技术方案所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器或按照上述技术方案制备的基于石墨烯晶体管的DNA传感器在DNA检测中的应用，将所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器的栅极和石墨烯沟道部分浸没于含有待测DNA的电解质中。

本发明提供了一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器，包括电子级玻璃和设置于所述电子级玻璃上的栅极、源极和漏极；所述源极和漏极之间设置有石墨烯沟道；所述栅极表面固定有单链DNA。本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器中单链DNA直接固定在栅极表面，无需在石墨烯上固定DNA；其三电极结构和石墨烯沟道，使其对电压的变化感应非常强，很小的电压变化就会引起相应的电流变化；利用输入栅极的电压来控制石墨烯沟道电流，降低了操作电压；同时应用石墨烯为沟道材料，增大传感器的灵敏度。实验结果表明，本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器探测器操作电压低于1V，检测灵敏度达到4pM。

附图说明

图1为本发明实施例1中基于石墨烯晶体管的DNA传感器的制备过程示意图；

图2为本发明实施例1中基于石墨烯晶体管的DNA传感器中三电极结构的示意图；

图3为本发明实施例1中基于石墨烯晶体管的DNA传感器检测10μM互补DNA时的转移特性曲线；

图4为本发明实施例1中基于石墨烯晶体管的DNA传感器检测5μM非互补DNA时的转移特性曲线；

图5为本发明实施例1中基于石墨烯晶体管的DNA传感器测试器件稳定性时的转移特性曲线；

图6为本发明实施例1中单链DNA在扫描电镜下的形貌；

图7为本发明实施例1中双链DNA在扫描电镜下的形貌；

图8为本发明实施例1中双链DNA在荧光显微镜下的形貌；

图9为本发明实施例3中基于石墨烯晶体管DNA传感器测试器件稳定性时的转移特性曲线；

图10为本发明实施例3中基于石墨烯晶体管DNA传感器检测4pM的DNA时的转移特性曲线；

图11为本发明实施例3中基于石墨烯晶体管DNA传感器检测4pM的DNA时的时间电流响应曲线；

图12为本发明基于石墨烯晶体管DNA传感器的原理图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于石墨烯晶体管的DNA传感器，包括电子级玻璃和设置于所述电子级玻璃上的栅极、源极和漏极；所述源极和漏极之间设置有石墨烯沟道；所述栅极表面固定有单链DNA。

本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器包括电子级玻璃。本发明对所述电子级玻璃的种类和来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售电子级玻璃即可。在本发明中，所述电子级玻璃优选为GL-10173-1.1。在本发明中，所述电子级玻璃作为石墨烯晶体管的基底。

本发明对所述电子级玻璃的尺寸没有特殊的限定，根据器件大小进行调整即可。在本发明中，所述电子级玻璃的长和宽优选独立地优选为(10～15)mm，更优选为12mm；所述电子级玻璃的厚度优选为2mm。

本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器包括设置于所述电子级玻璃上的栅极、源极和漏极。在本发明中，所述栅极、源极和漏极优选顺次间隔设置于电子级玻璃的同一个表面上。在本发明中，所述源极和漏极之间优选形成宽度为0.2～0.3mm的沟道。本发明对所述栅极、源极和漏极的形状没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的电极的形状即可。

在本发明中，所述栅极、源极和漏极优选独立地包括铬层和金层，所述铬层位于电子级玻璃和金层之间。在本发明中，所述栅极、源极和漏极中铬层的厚度独立地优选为6～10nm，更优选为8nm；所述栅极、源极和漏极中金层的厚度独立地优选为70～90nm，更优选为80nm。在本发明中，所述铬层使金层牢固地附着于电子级玻璃表面，避免后期操作中金层的脱落。

在本发明中，所述栅极、源极和漏极的三电极结构使DNA检测过程中能够利用输入栅极的电压来控制沟道电流，实现低于1V的操作电压。

本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器包括设置于所述源极和漏极之间的石墨烯沟道。在本发明中，所述石墨烯沟道的宽度优选为0.2～0.3mm，石墨烯沟道的长度优选为4～8mm。在本发明中，所述石墨烯优选填充满源极和漏极之间的空隙。在本发明中，所述石墨烯沟道优选为单层石墨烯。在本发明中，所述石墨烯沟道能够增大传感器的灵敏度。

本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器包括固定于栅极表面的单链DNA。本发明对所述单链DNA的种类没有特殊的限定，根据待检测DNA链段进行选择即可，所述单链DNA为与待检测DNA互补的DNA链段。本发明利用DNA的碱基互补配对原则，在栅极上固定单链DNA对其互补DNA进行检测，选择性高。

在本发明中，所述栅极表面单链DNA的物质的量优选为0.1～0.2nmol，更优选为0.15nmol。在本发明中，所述单链DNA优选经巯基修饰固定于栅极表面。本发明对所述单链DNA的巯基修饰的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的巯基修饰DNA的技术方案即可。

本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器的原理图如图12所示，栅电极和石墨烯沟道之间由电解质导通，形成一个“双电容”结构，而加在栅极和石墨烯沟道之间的电压是一定的，栅极上加的电压因为固定了DNA，和DNA发生杂化时发生改变(电压会减小)，同时引起沟道上电压的变化(电压减小)，所以反馈出来的栅极电压增大，即狄拉克点右移。

本发明中的三电极结构和石墨烯沟道对电压的变化感应非常强，很小的电压变化就会引起相应的电流变化，因此无需荧光标记DNA；同时，DNA直接固定在栅极表面，无需在石墨烯上固定DNA。

本发明还提供了上述技术方案所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)在电子级玻璃表面制备栅极、源极和漏极，使所述源极和漏极之间存在沟道；

(2)将石墨烯平铺在源极和漏极之间的沟道上，得到石墨烯晶体管；

(3)在所述步骤(2)得到的石墨烯晶体管的栅极表面固定单链DNA，得到基于石墨烯晶体管的DNA传感器。

本发明在电子级玻璃表面制备栅极、源极和漏极，使所述源极和漏极之间存在沟道。在本发明中，所述栅极、源极和漏极的制备优选包括：采用热蒸发镀膜法在电子级玻璃表面依次蒸镀铬层和金层。

本发明对所述热蒸发镀膜法的具体参数没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的参数，能够制备得到所需厚度电极即可。在本发明中，所述热蒸发镀膜优选在真空条件下进行；所述真空的真空度优选为8×10^-4Pa以下，更优选为4×10^-4Pa。在本发明中，所述铬层的蒸镀温度优选为180～200℃，更优选为185～190℃；所述金层的蒸镀温度优选为100～120℃，更优选为105～110℃。

本发明优选在使用前将所述电子级玻璃进行清洗和干燥。在本发明中，所述清洗优选为超声清洗，更优选依次采用丙酮、异丙醇和乙醇进行超声清洗。在本发明中，所述丙酮、异丙醇和乙醇的超声清洗的时间独立地优选为8～12min，更优选为10min。本发明对所述超声清洗的频率没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的频率即可。在本发明中，所述干燥优选为烘干。

栅极、源极和漏极制备完成后，本发明将石墨烯平铺在源极和漏极之间的沟道上，得到石墨烯晶体管。在本发明中，所述石墨烯的平铺优选包括：采用湿法转移将金属基底单层石墨烯转移至源极和漏极之间的沟道上。在本发明中，所述金属基底单层石墨烯优选为铜基底CVD法单层石墨烯。本发明对所述金属基底单层石墨烯的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售产品，或按照本领域技术人员熟知的制备方法制备即可。

本发明对所述湿法转移的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的湿法转移单层石墨烯的技术方案即可。在本发明中，所述湿法转移单层石墨烯的技术方案优选参照陈牧,颜悦,张晓锋,等.大面积石墨烯薄膜转移技术研究进展[J].航空材料学报,2015,35(2):1-11.中公开的技术方案。

石墨烯的转移完成后，本发明优选将所述转移后的产物进行退火，得到石墨烯晶体管。在本发明中，所述退火的温度优选为110～130℃，更优选为120℃；所述退火的时间优选为20～30min，更优选为25min。在本发明中，所述退火能够去除样品表面的水分，同时能够使石墨烯与电子级玻璃结合更加紧密。

得到石墨烯晶体管后，本发明优选在所述石墨烯晶体管的栅极表面固定单链DNA，得到基于石墨烯晶体管的DNA传感器。在本发明中，所述单链DNA优选经巯基修饰固定于栅极表面。本发明对所述巯基修饰和固定DNA的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA的巯基修饰和在金表面固定的方法即可。

本发明还提供了上述技术方案所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器或按照上述技术方案制备的基于石墨烯晶体管的DNA传感器在DNA检测中的应用，将所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器的栅极和石墨烯沟道部分浸没于含有待测DNA的电解质中。在本发明中，所述电解质优选为1x的PBS；所述电解质的pH值优选为7.2～7.4。在本发明中，所述栅极和石墨烯沟道通过电解质连接，利用输入栅极的电压来控制石墨烯沟道的电流。

在本发明中，所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器的栅极和源极优选与电源的正极连接，漏极优选与电源的负极连接。本发明对所述基于石墨烯晶体管的DNA传感器在DNA检测中的应用的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的晶体管测定DNA的技术方案即可。

本发明提供的制备方法中电极和石墨烯的制备和转移方法简单，DNA固定的方法简单，跟传统的检测DNA的传感器相比，本发明制备的基于石墨烯晶体管的DNA传感器无需标记目标DNA，固定需要检测的DNA的配对单链后便可检测，根据碱基互补配对原则可知此种方法的选择性非常高；跟传统的检测DNA的传感器相比，本发明制备的基于石墨烯晶体管的DNA传感器的检测方法更加简单，无需用到大型的检测仪器，非常经济。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1:

用以检测浓度为10μM互补DNA的基于石墨烯晶体管传感器的制备：

测试浓度为10μM，碱基序列为5’-GATC GCTG GAAT CCAG-3’的DNA的基于石墨烯晶体管的DNA传感器，制备过程如图1所示：电子级玻璃基底经电极金属沉积制备得到三电极，然后转移石墨烯，得到石墨烯沟道，再进行单链DNA的固定，得到基于石墨烯晶体管的DNA传感器；经DNA杂化实现DNA检测。

热蒸发镀膜：

将电子级玻璃切割成12*12mm大小，依次用丙酮、异丙醇、乙醇超声清洗十分钟，烘干箱中烘干后用高温胶将玻璃片粘贴在特定形状的掩模版上，称取适量的铬和金放入钨舟中准备真空热蒸发镀膜。

蒸发时先蒸铬：厚度为7nm。

再蒸镀金层：厚度为70nm。

得到的电极形状、结构和尺寸如图2所示。图中，G为gate即栅极，S为source即源极，D为drain即漏极，源极和漏极之间的6*0.25mm大小的沟道转移石墨烯后即为石墨烯沟道。

湿法转移单层石墨烯：

将250mg分子量为9960000g/mol的甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶于5mL苯甲醚中，在磁力搅拌器上搅拌得到澄清透明的浓度为50mg/mL的PMMA/苯甲醚溶液。

将通过电化学沉积法得到的单层铜基底石墨烯裁剪至12mm*12mm大小，在石墨烯表面滴加10μL旋涂制备的PMMA/苯甲醚溶液，设置匀胶机的转速为3000rpm，旋涂时间30s，旋涂完毕室温干燥30分钟，得到PMMA/石墨烯。

配置100mg/mL氯化铁溶液，将干燥后的PMMA/石墨烯剪切成3*6mm大小后，旋涂过PMMA/苯甲醚溶液的那一面朝上，置于氯化铁溶液中，使铜基底刻蚀完全。

用载玻片将刻蚀掉铜基底的PMMA/石墨烯转移至去离子水中浸泡10min/次，换2次去离子水，用去离子水将PMMA/石墨烯上残留的氯化铁溶液洗干净；取热蒸发镀膜制成的电极片，分别用丙酮，异丙醇，去离子水超声清洗，干燥后用氧等离子体处理电极片表面，改善电极片的亲水性。

将洗净后的PMMA/石墨烯转移至洗净的电极上，使其平铺置于电极片表面的源极和漏极之间的沟道上，自然晾干至肉眼观察不到表面水分后置于热台120℃退火，彻底去除样品表面水分，得到PMMA/石墨烯/电极片。

冷却至室温后用牙签将沟道两边多余的PMMA/石墨烯除去。然后用丙酮换洗两次PMMA/石墨烯/电极片，每次10分钟，然后将PMMA/石墨烯/电极片放入丙酮溶液中65℃加热3小时，除掉表面PMMA，得到需要的石墨烯晶体管。3小时后用去离子水换洗石墨烯晶体管，自然干燥后至于手套箱中120℃退火30分钟以除去石墨烯晶体管表面附着的水分和杂质。

固定DNA：

本实施例中使用的单链DNA在扫描电镜下的形貌如图6所示；双链DNA在扫描电镜下的形貌和荧光显微镜下的形貌分别如图7和图8所示。

将购买的DNA通过离心处理后，根据说明书稀释至100μM。

然后将S1单链DNA逐级稀释至5μM，与S1互补的S1’单链DNA稀释至10μM。

将S1单链DNA经巯基修饰固定至石墨烯晶体管的栅极上：取30μL浓度为5μM的DNA滴在栅极上。固定时间为12h后，用磷酸缓冲液润洗掉栅极上未固定的DNA以及其它杂质，得到基于石墨烯晶体管的DNA的传感器。

实施例2:

将实施例1中传感器栅极和源极接正极，漏极接负极，接在KEITHLEY2400上，电解质为1x的PBS溶液，pH值在7.3～7.4之间。

对实施例1制备的DNA传感器器件稳定性进行测试，得到转移特性曲线如图5所示。从图5可以看出，实施例1制备的DNA传感器的稳定性良好，其转移特性曲线随着时间的变化不会有太大(或者超过实验响应变化)的变化，性能稳定，良好。

检测完毕后自然干燥2小时，滴加10μM的互补DNA与其杂化6小时，6小时后测试其转移特性曲线。

按照以上方法利用labview软件对本实施例1制备的基于石墨烯晶体管的DNA传感器进行电学测试，检测10μM互补DNA时的转移特性曲线如图3所示；图3中，对照曲线为未固定DNA时器件的转移特性曲线，单链DNA曲线为固定DNA后得到的DNA传感器的转移特性曲线，双链DNA曲线为杂化后的转移特性曲线。从图3中可以看出，实施例1制备的DNA传感器可以检测到浓度为10μM的互补DNA，响应为150mV。

检测5μM非互补DNA时的转移特性曲线如图4所示；图4中，对照曲线为未固定DNA时器件的转移特性曲线，单链DNA曲线为固定DNA后得到的DNA传感器的转移特性曲线，双链DNA曲线为杂化后的转移特性曲线。图3和图4对比可知，实施例1制备的DNA传感器具有较高的选择性，只检测需要检测的互补DNA，对非互补DNA几乎没有响应。

实施例3:

用以检测浓度为4pM互补DNA的基于石墨烯晶体管传感器的制备：

测试所用DNA的碱基序列为5’-GATC GCTG GAAT CCAG-3’。

热蒸发镀膜：

将电子级玻璃切割成12*12mm大小，依次用丙酮、异丙醇、乙醇超声清洗十分钟，烘干箱中烘干后用高温胶将玻璃片粘贴在特定形状的掩模版上，称取适量的铬和金放入钨舟中准备真空热蒸发镀膜。

蒸发时先蒸铬：厚度为7nm。

再蒸镀金层：厚度为80nm。

得到电极的尺寸和间距与实施例1相同。

湿法转移单层石墨烯：

将250mg分子量为9960000g/mol的甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶于5mL苯甲醚中，在磁力搅拌器上搅拌得到澄清透明的浓度为50mg/mL的PMMA/苯甲醚溶液。

将通过电化学沉积法得到的单层铜基底石墨烯裁剪至12mm*12mm大小，在石墨烯表面滴加10μL旋涂制备的PMMA/苯甲醚溶液，设置匀胶机的转速为3000rpm,旋涂时间30s，旋涂完毕室温干燥30分钟，得到PMMA/石墨烯。

配置100mg/mL氯化铁溶液，将干燥后的PMMA/石墨烯剪切成3*6mm大小后，旋涂过PMMA/苯甲醚溶液的那一面朝上，置于氯化铁溶液中，使铜基底刻蚀完全。

用载玻片将刻蚀掉铜基底的PMMA/石墨烯转移至去离子水中浸泡10min/次，换2次去离子水，用去离子水将PMMA/石墨烯上残留的氯化铁溶液洗干净；取(1)中通过热蒸发镀膜制成的电极片若干，分别用丙酮，异丙醇，去离子水超声清洗，干燥后用氧等离子体处理电极片表面，改善电极片的亲水性。

将洗净后的PMMA/石墨烯转移至洗净的电极上，使其平铺置于电极片表面的源电极(source)和漏电极(drain)之间的沟道上，自然晾干至肉眼观察不到表面水分后置于热台120℃退火，彻底去除样品表面水分，得到PMMA/石墨烯/电极片。

冷却至室温后用牙签将沟道两边多余的PMMA/石墨烯除去。然后用丙酮换洗两次PMMA/石墨烯/电极片，每次10分钟，然后将PMMA/石墨烯/电极片放入丙酮溶液中65℃加热3小时，除掉表面PMMA，得到需要的石墨烯晶体管。

3小时后用去离子水换洗石墨烯晶体管，自然干燥后至于手套箱中120℃退火30分钟以除去石墨烯晶体管表面附着的水分和杂质。

固定DNA：

将购买的DNA通过离心处理后，根据说明书稀释至100μM。

然后将S1单链DNA逐级稀释至5μM，与S1互补的S1’单链DNA稀释至4pM。将S1单链DNA固定至石墨烯晶体管的栅极上。固定时间为12h后用磷酸缓冲液润洗掉栅极上未固定的DNA以及其它杂质，得到基于石墨烯晶体管的DNA的传感器。

实施例4:

检测实施例2制备的基于石墨烯晶体管的DNA的传感器的转移特性曲线如图9所示。从图9可以得出，实施例3制备的DNA传感器的稳定性良好，其转移特性曲线随着时间的变化不会有太大(或者超过实验响应变化)的变化，性能稳定，良好。

待器件周围环境稳定时测试其时间电流响应曲线，达到平台期后滴加4pM的互补DNA，使其杂化，杂化时间约为6h达到另一个平台，6小时后测试其转移特性曲线。

实施例3中基于石墨烯晶体管的DNA的传感器检测4pM的DNA时的转移特性曲线如图10所示；图10中，对照曲线为未固定DNA时器件的转移特性曲线，单链DNA曲线为固定DNA后得到的DNA传感器的转移特性曲线，双链DNA曲线为杂化后的转移特性曲线。从图10可以看出，实施例3制备的DNA传感器可以检测到浓度为4pM的互补DNA，而且响应为20mV。

实施例3中基于石墨烯晶体管DNA传感器检测4pM的DNA时的时间电流响应曲线如图11所示；此图说明DNA杂化的时间约为6h，而且由于DNA的杂化导致电流的降低，此图的意义在于证明DNA杂化对器件带来的影响。

由以上对比例和实施例可以看出，本发明提供的基于石墨烯晶体管的DNA传感器制备方法简单，操作电压低于1V，检测灵敏度达到4pM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。