结核分枝杆菌蛋白Rv1508c在制备抗结核药物增敏剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及结核分枝杆菌功能性蛋白Rv1508c在制备抗结核药物增敏剂中的应用。

背景技术

结核病是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，结核分枝杆菌所致结核病是人畜共患的结核病。全球目前有近三分之一的人感染结核分枝杆菌，据WHO《2016全球结核报告》估计2015年新发结核病例1040万例，因结核病死亡人数达140万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国结核病患病人数居世界第三位。

结核多重耐药患者数目增长非常迅速，数据显示，2012年全球新感染多重耐药结核的患者已达到了45万例。如此庞大的数据告诉我们，治疗结核病迫在眉睫。现临床上为了避免药物治疗期间耐药性的出现，多采用抗结核药物联合用药的给药方案，但也无疑加重了患者的负担。近年来，艾滋病的流行以及结核疫情的回升，加之结核菌耐药性不断产生，使得医生与患者对于更为高效、更具挑战力的新型抗结核药物的需求更加迫切。因此研发新型抗结核药物已成为目前最受关注的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供结核分枝杆菌蛋白Rv1508c作为抗结核药物增敏剂的应用，可增加结核分枝杆菌对链霉素的敏感性。为临床结核病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗结核药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：

本发明的第一方面，提供结核分枝杆菌蛋白Rv1508c在制备抗结核药物增敏剂中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，本发明提供结核分枝杆菌蛋白Rv1508c在增加结核分枝杆菌对链霉素的敏感性中的应用。

优选地，本发明提供结核分枝杆菌蛋白Rv1508c作为药物靶标在筛选促进Rv1508c表达的药物中的应用。

本发明的第二方面，提供结核分枝杆菌蛋白Rv1508c作为药物靶标在筛选结核耐药逆转剂中的应用。

本发明从毒性人型结核分枝杆菌H37Rv的RD6、RD9以及RD15区基因中，筛选与利福平、异烟肼以及链霉素这3种药物敏感或耐药相关的基因。发现结核分枝杆菌Rv1508c基因能促进链霉素杀伤分枝杆菌。Rv1508c是一种仅在结核菌株H37Rv和H37Ra中表达的基因，研究表明它可能是一种膜蛋白，推测在糖基转移酶的GT-C超家族中，可以参与结核分枝杆菌细胞壁的合成等细胞过程。推测链霉素以Rv1508c蛋白质为靶点，经细菌细胞膜转运入细胞内，通过抑制细胞质中蛋白的合成来杀伤分枝杆菌。因此，Rv1508c促进结核分枝杆菌对链霉素敏感，在今后研究中，其可以作为一个靶点，筛选促进Rv1508c表达的药物。

本发明的有益效果：本发明为防治结核病提供了一个重要的靶标基因或靶标蛋白。本发明所述的结核菌功能性蛋白能增加分枝杆菌对链霉素的敏感性，以该基因或蛋白作为抗结核药物增敏剂，可增加结核菌对链霉素药物敏感性。本发明成果可为临床结核病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗结核药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发抗结核药物增敏剂。此外，该成果还对寻找新的药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。

附图说明

图1RD6、RD9与RD15区基因重组pMV261质粒的双酶切鉴定。

图2重组MS::RDs的PCR鉴定，

M：代表DNA标准分子量-Marker。

图3利福平、异烟肼以及链霉素对耻垢分枝杆菌与重组耻垢分枝杆菌的半抑菌浓度的测定，

(A)利福平对耻垢分枝杆菌与重组耻垢分枝杆菌的半抑菌浓度的测定。(B)异烟肼对耻垢分枝杆菌与重组耻垢分枝杆菌的半抑菌浓度的测定。(C)链霉素对耻垢分枝杆菌与重组耻垢分枝杆菌的半抑菌浓度的测定(实验重复3次，每次做3个复孔)。*：p<0.05，Rv1508c与control组比较；**：p<0.01，Rv1508c与pMV261组比较。

图4Rv1508c在各分枝杆菌中的分布的PCR鉴定，

Marker：代表DNA标准分子量-Marker；H37Rv：结核分枝杆菌；H37Ra：减毒结核分枝杆菌；M.s：耻垢分枝杆菌；BCG：卡介苗；M.marinum：海洋分枝杆菌；M.intracellulare：胞内分枝杆菌。Control：无模板对照。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

如无特殊说明，以下实施例中所使用的实际均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。

【实施例1】RD6区、RD9以及RD15区部分基因的重组pMV261原核穿梭质粒的构建和鉴定

提取H37Rv基因组后，利用RD6区、RD9区以及RD15区基因引物(如表1所示)，通过PCR从H37Rv基因组中获取RD6、RD9与RD15区基因，将PCR产物用割胶回收试剂盒回收后，用酶BamHI、EcoRI、HindⅢ将回收产物和pMV261载体分别双酶切，回收后用高效T4连接酶Ligation high连接并转化到E.coli DH5中，涂板后培养过夜。挑选细胞单克隆，提取质粒并测序。成功构建了11个重组质粒，分别经双酶切鉴定成功，图1中已标记各基因分子量大小。测序结果显示序列正确。

表1：RD6区、RD9区以及RD15区基因引物序列表

【实施例2】穿梭重组质粒pMV261-Rv系列质粒电转至耻垢分枝杆菌

制备耻垢分枝杆菌感受态后，将重组质粒1μL加入200μL的耻垢分枝杆菌感受态中，冰浴15min-20min，无菌操作、混匀后转入电转杯中。用美国Bio-Rad公司的电穿孔仪电转18-25ms后，加入1ml分枝杆菌病培养基，37℃100rpm培养1h后涂布于含Kan的7H11固体培养基，3天后挑阳性克隆，做菌落PCR鉴定。PCR结果显示以rMS:RDs菌落为模板时，均能扩增出大小正确的RDs条带。结果如图2所示。

【实施例3】利福平、异烟肼以及链霉素对重组耻垢分枝杆菌的半抑菌浓度的测定

为了筛选出RD区对利福平、异烟肼以及链霉素敏感或耐药的基因，我们将将耻垢分枝杆菌与重组耻垢分枝杆菌与倍比稀释的利福平、异烟肼以及链霉素共培养2天后，利用酶标仪检测细菌的A600值，未加药物培养重组耻垢分枝杆菌作为阴性对照，仅加培养基的孔作为空白对照。利用Graphpad Prism5计算IC50值，再利用GraphpadPrism5绘制柱形图，并做生物统计学分析，结果如图3所示。结果显示利福平以及异烟肼对以上基因都没有明显作用；而在链霉素组中，链霉素对耻垢分枝杆菌，重组空载耻垢分枝杆菌以及重组Rv1508c基因的耻垢分枝杆菌的IC50平均值分别为0.4549、0.6488和0.1853μg/ml，Rv1508c基因的IC50值明显低于耻垢分枝杆菌，重组空载耻垢分枝杆菌，通过生物统计学分析发现，有显著的统计学意义，说明结核分枝杆菌Rv1508c基因促进分枝杆菌对链霉素药物的敏感性。

【实施例4】不同分枝杆菌中Rv1508c基因分布的PCR鉴定

以各种分枝杆菌(结核分枝杆菌标准株H37Rv(strain ATCC 25618)、减毒结核分枝杆菌H37Ra、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌取自武汉大学动物实验中心)基因组为模板，以Rv1508c引物做PCR，检测Rv1508c在不同分枝杆菌中的表达。结果如图4所示，发现Rv1508c仅在在H37Rv和H37Ra中表达，在牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、胞内分枝杆菌以及海洋分枝杆菌中无表达。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 结核分枝杆菌蛋白Rv1508c在制备抗结核药物增敏剂中的应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 599

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 1

Val Ile Pro Val Met Ser Ala Arg Phe Thr Gly Phe Pro Leu Leu Pro

1 5 1015

Val Ala Leu Arg His Gly Ile Thr Ser Gly Arg Gly Cys Gly Phe Ile

202530

Leu Asp Val Gly Ala Gln Arg Pro Phe Gly Asn Asp Val Leu Leu Ser

354045

Val Ala Thr Arg Lys Ile Arg Ser Arg Leu Pro Gly Asp Arg Val Gly

505560

Asn His Gly Ala Leu Leu Pro Phe Arg Ala Glu Pro Arg Arg Ile Gln

65707580

Met Lys Arg Pro Pro Glu Val Leu Arg Gly Ala Val Thr Ala Ser Arg

859095

Glu Arg Leu Trp Ala Ile Gly Ser Gln Ser Glu Arg Thr Leu Met Leu

100 105 110

Gly Thr Ile Leu Leu Ala Ser Val Ile Ser Ala Ala Thr Ala Tyr Ala

115 120 125

Leu Ser Gln Trp Tyr Ala Val Asp Val Phe Ser Thr Leu Leu Val Val

130 135 140

Pro Gly Asp Cys Trp Leu Asp Trp Gly Met Asn Ile Gly Arg His Cys

145 150 155 160

Phe Ser Asp Tyr Ala Met Val Ala Ala Ala Gly Ile Gln Pro Asn Pro

165 170 175

Ala Asp Tyr Leu Ile Ser Leu Pro Ala Asp Tyr Gln Pro Thr Ala Val

180 185 190

Ala Ala Trp Ala Pro Ala Arg Ile Pro Tyr Ala Ile Phe Gly Leu Pro

195 200 205

Ser His Trp Leu Gly Ala Pro Arg Leu Gly Leu Ile Cys Tyr Leu Val

210 215 220

Ala Leu Thr Met Ala Val Ile Ser Pro Ala Ile Trp Ala Ala Arg Gly

225 230 235 240

Ala Arg Gly Leu Glu Arg Val Val Ile Phe Val Thr Leu Gly Ala Ala

245 250 255

Ala Ile Pro Ala Trp Gly Val Ile Asp Arg Gly Asn Ser Thr Gly Phe

260 265 270

Val Val Pro Ile Ala Leu Ala Tyr Phe Val Ala Leu Ser Arg Gln Arg

275 280 285

Trp Gly Leu Ala Thr Ile Thr Val Ile Leu Ala Val Leu Val Lys Pro

290 295 300

Gln Phe Val Val Leu Gly Val Val Leu Leu Ala Ala Arg Gln Trp Arg

305 310 315 320

Trp Ala Gly Ile Gly Ile Thr Gly Val Val Val Ser Asn Ile Ala Ala

325 330 335

Phe Leu Leu Trp Pro Arg Gly Phe Pro Gly Thr Ile Ala Gln Ser Ile

340 345 350

His Gly Ile Ile Lys Phe Asn Ser Ser Phe Gly Gly Leu Arg Asp Pro

355 360 365

Arg Asn Val Ser Phe Gly Lys Ala Leu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ile

370 375 380

Lys Asn Tyr Gln Ser Gly Lys Ile Pro Glu Gly Phe Leu Thr Gly Pro

385 390 395 400

Arg Thr Gln Ile Gly Phe Ala Val Leu Val Ile Val Val Val Ala Val

405 410 415

Leu Ala Leu Gly Arg Arg Ile Pro Pro Val Met Val Gly Ile Val Leu

420 425 430

Leu Ala Thr Ala Thr Phe Ser Pro Ala Asp Val Ala Phe Tyr Tyr Leu

435 440 445

Val Phe Val Leu Pro Ile Ala Ala Leu Val Ala Arg Asp Pro Asn Gly

450 455 460

Pro Pro Gly Ala Gly Ile Phe Asp Gln Leu Ala Ala His Gly Asp Arg

465 470 475 480

Arg Arg Ala Val Gly Val Cys Val Ser Leu Ala Val Ala Leu Ser Ile

485 490 495

Val Asn Val Ala Val Pro Gly Gln Pro Phe Tyr Val Pro Leu Tyr Gly

500 505 510

Gln Leu Gly Ala Lys Gly Val Val Gly Thr Thr Pro Leu Val Phe Thr

515 520 525

Thr Val Thr Trp Ala Pro Phe Leu Trp Leu Val Thr Cys Val Val Ile

530 535 540

Ile Val Ser Tyr Ala Arg Lys Pro Ala Arg Pro His Asp Ser His Asn

545 550 555 560

Gly Pro Thr Arg Glu Ser Asp Gln Asp Thr Ala Ala Ser Thr Thr Ser

565 570 575

Cys Leu Pro Asn Pro Val Glu Glu Ser Ser Pro Arg Gly Pro Gly Pro

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Ile Cys Gln Asn Tyr Thr Pro

595

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 26

<212> DNA

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<400> 7

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 30

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<210> 11

<211> 22

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<400> 11

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<210> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 13

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 14

<211> 27

<212> DNA

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<210> 15

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<212> DNA

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<210> 16

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<210> 17

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<210> 20

<211> 26

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<211> 25

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<210> 22

<211> 29

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

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