法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-03-27
授权
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2018-10-23
实质审查的生效 IPC(主分类):A61L27/56 申请日:20180413
实质审查的生效
2018-09-21
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球及其制备方法，属于高分子材料领域。
背景技术
利用组织工程材料进行细胞培养是目前研究的热门领域，其中材料界面与生物体的相互作用是一个重要课题。在生物体和体外培养过程中，细胞分泌的细胞外基质的主要成分含有大量蛋白质材料，而基质结构则为纳米纤维。研究发现，具有微纳结构的生物材料能刺激并调控细胞行为，并能加强材料与组织的相容性。微载体在组织工程应用中相比其他模型如膜、支架等具有不可比拟的一系列优势，比如其独特的可注射性，此外，微载体还具有可以为细胞生长提供更大的比表面积、获得足够数量细胞、维持细胞分化表型和便于调节、监控细胞培养环境等优点。其中多孔微载体不仅能促进细胞黏附，相比于实心微载体，其具有的孔结构还可方便细胞进入微载体内部，为细胞提供保护环境。
蚕丝是一种天然纤维，其中丝素蛋白是一种天然大分子蛋白，由18种人体氨基酸组成，降解产物无毒，并且可模拟组织中蛋白质组分和功能，具有良好的生物相容性，同时又有易加工修饰和低免疫原性等优点，这使丝素蛋白成为一类极有发展前途的新型生物材料。丝素蛋白纳米纤维常被制成膜或者支架，具有促进伤口愈合，促使骨组织、血管组织细胞等结构快速增长的功能，但往往伴随着材料孔隙不够大或缺乏连通性等问题。丝素蛋白用来制备多孔微球不仅空隙可调，连通性强，还可以模拟细胞外基质成分，通过构建含有纳米纤维微结构的丝素多孔微球，可以同时实现对细胞外基质在结构和成分上的有效模仿。
发明内容
本发明针对丝素纳米纤维在组织工程应用中存在的结构上的不足等问题，结合丝素蛋白的特点和优势，提出了利用液致相分离原理，乳液法结合冷冻干燥技术制备具有纳米纤维微结构的丝素蛋白多孔微球。本发明制备的微球可以在成分和结构上有效地模拟细胞外基质。本发明的具体技术方案如下：
本发明公开了一种具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球，多孔微球的组成成分是丝素，所述的多孔微球的孔隙率在80％以上，孔径为5μm—30μm，纳米纤维直径在100nm—500nm。
本发明还公开了一种具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球的制备方法，所采用的具体制备步骤如下：
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得1.75％—7％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加异丙醇于丝素溶液中，搅拌，静置；
3)取石油醚在-30℃—-50℃预冷3.5h以上；
4)另取石油醚于新烧杯中，加入乳化剂，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷的石油醚中，并重新置于-30℃—-50℃静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
作为进一步地改进，本发明所述的异丙醇添加量在7％-20％的丝素体积范围内，静置时间不能超过5d。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤6)获得的具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球，通过后续醇类处理增强其力学性能。
与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：
1)本发明制备的微球由于具有纳米纤维微结构，可以模拟细胞外基质的结构和形貌，促进细胞黏附增殖；
2)丝素蛋白是一种天然的蛋白分子，不会对人体产生刺激作用，安全可靠，具有优良的生物相容性和生物可降解性；
3)相比丝素纳米纤维薄膜或支架，本发明制备的丝素蛋白多孔微球具有可注射性，可以免除外科手术过程，同时可以扩大细胞三维培养，提高细胞培养面积和维持细胞表型；
4)本发明所涉及的材料成本低廉，有机溶剂可有效回收，环保无污染。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得1.75％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min使其均匀，静置4d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
所得的多孔微球的组成成分是丝素，所述的多孔微球的孔隙率在80％以上，孔径为5μm—30μm，纳米纤维直径在100nm—500nm。
实施例2
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得7％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min使其均匀；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例3
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得7％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置5d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例4
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得3.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min使其均匀；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例5
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得3.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例6
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得3.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1.35ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置3d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例7
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例8
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得2.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例9
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得2.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加0.7ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例10
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得2.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-30℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
实施例11
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得2.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加2ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
以下表格提供了对比例1-4与实施例7作对比，对比例1-4仅仅改变了有机溶剂的种类，其余技术特征均与实施例7相同，从而通过形貌观察得出了有机溶剂选择对于本发明技术方案的重要性。
以下表格提供了对比例5-6分别与实施例8和实施例11作对比，对比例5-6仅仅改变了异丙醇添加量，其余技术特征均与实施例8相同，从而通过形貌观察得出了异丙醇添加量的选择对于本发明技术方案的重要。
以下表格提供了对比例7-8与实施例3作对比，对比例7-8仅仅改变了丝素浓度，其余技术特征均与实施例3相同，从而通过形貌观察得出了丝素浓度的选择对于本发明技术方案的重要性。
以下表格提供了对比例7与实施例5-6作对比，对比例7仅仅改变了静置时间，其余技术特征均与实施例3相同，从而通过形貌观察得出了静置时间的选择对于本发明技术方案的重要性。
以下表格提供了对比例9-10与实施例8作对比，对比例9-10仅仅改变了预冷温度，其余技术特征均与实施例8相同，从而通过形貌观察得出了预冷温度的选择对于本发明技术方案的重要影响。
实施例12
1)将蚕茧剪碎、脱胶、溶解后，再经过过滤、透析、浓缩，获得2.5％(w/v)丝素蛋白水溶液；
2)在搅拌情况下，滴加1ml异丙醇于10ml丝素溶液中，搅拌5min，静置1d；
3)取450ml石油醚于500ml烧杯中，在-50℃预冷4h；
4)另取40ml石油醚于100ml烧杯中，加入0.7ml span-80，搅拌均匀；
5)将2)混合溶液倒入4)混合溶液，搅拌成均匀球形后，迅速倒入3)预冷好的石油醚中，并重新置于冷冻环境静置沉淀；
6)在冷冻氛围下倒去5)溶液中的液体，再通过冷冻干燥可获得具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球。
7)将6)获得的具有纳米纤维微结构的丝素多孔微球与乙醇混合固定30min后，用去离子水冲洗干净乙醇，再经过冷冻干燥获得不溶于水的掺锶的丝素蛋白多孔微球。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的几个具体实施例子以及对比例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
机译： 一种制备微结构或纳米结构的方法以及具有该微结构或纳米结构的基材
机译： 具有增强的除砷能力的纤维素微结构模板的纳米复合材料的制备方法
机译： 具有增强的除砷能力的纤维素微结构模板的纳米复合材料的制备方法
