一种植物乳杆菌及其在发酵制备四川香肠中的应用

技术领域

本发明涉及微生物及肉类食品发酵领域，具体涉及植物乳杆菌（Lactobacillus>plantarum）1-1及其在四川香肠中的应用。

背景技术

四川香肠麻辣爽口，风味独特，酸度适中，受到众多消费者的喜爱。市面上的四川香肠分为四川传统香肠和现代化大规模生产的四川香肠。四川传统香肠属于自然发酵肉制品，其发酵微生物主要来源于原料肉和加工环境，含有丰富的具有地域特色的菌种资源。四川传统香肠具有独特的风味、质构、色泽、滋味，以及低酸的优点，但存在生产周期长以及安全卫生难以保证的缺点。现代化大规模生产的四川香肠安全卫生并且质量稳定，但滋味和风味不及四川传统香肠。虽然已有较多关于四川香肠发酵剂的研究报道，但到将筛选的发酵剂应用于实际生产还有一定的距离，而国外已有大量的商业肉类发酵剂。若使用国外已有的商业发酵剂生产四川香肠，可能会导致四川香肠失去本地特有的感官特性，特别是酸度增加，产生不愉快的感官体验。

发酵香肠的特殊风味归功于挥发性物质和非挥发性物质之间的平衡，而乳酸菌能够促进蛋白质降解，蛋白质降解会产生多肽和游离氨基酸等非挥发性物质，某些游离氨基酸和多肽是滋味物质，某些游离氨基酸通过转氨基作用、脱氨基作用和脱羧作用生成醛类、醇类、酯类和其他挥发性物质，从而调节挥发性物质和非挥发性物质的含量。然而，在微生物氨基脱羧酶的作用下，蛋白质降解产生的游离氨基酸也可以通过脱羧作用形成生物胺，且乳酸菌代谢产生的有机酸造成的低pH环境也利于生物胺的形成。摄入过多的生物胺可引起心悸、头痛、呼吸窘迫、高或低血压甚至死亡。因此，筛选能够同时降解肌肉蛋白和生物胺的乳酸菌十分必要。

已有关于降解蛋白和生物胺发酵剂的研究报道如下：1）程艳，四川香肠中产蛋白酶和脂肪酶霉菌菌株的分离、鉴定及其初步应用[D]，《四川农业大学》2012年，本文从四川自然发酵香肠中筛选到一株产活性强的产黄青霉，并将其与实验室保存的戊糖乳杆菌L76和腐生葡萄球S25为复合发酵剂对四川香肠进行初步应用。经蛋白质水解指数和挥发性风味物质分析，接种的发酵剂能促进四川香肠蛋白质降解和增加四川香肠醇类、酮类、酯类和醛类风味物质的相对含量，但本文却没有关注蛋白质水解可能带来生物胺含量增加的问题。2）樊康，接种发酵对中式香肠品质的影响及其发酵剂的研制[D]，《南京农业大学》，2012年，从侗族酸肉中筛选到一株希腊魏斯菌，将其分别与植物乳杆菌和戊糖片球菌作为发酵剂接种到香肠中，通过测定香肠蛋白水解指数，两种复合发酵剂均具有较好的蛋白质降解能力，但本文同样没有关注蛋白质水解可能带来生物胺含量增加的问题。3）谢翀，应用植物乳杆菌降低发酵香肠中生物胺含量的研究，《南京农业大学》，2015年，将植物乳杆菌和木糖葡萄球菌作为发酵剂接种到香肠中，经生物胺含量分析和感官评定，接种的发酵剂能够降低香肠中86%的腐胺、63%的尸胺、82%的组胺和43%的酪胺，并能提高香肠感官评定的得分，但香肠的pH低于5.5，而中国消费者喜爱低酸香肠，即pH高于5.5的香肠。4）孙霞，四川香肠中生物胺降解菌的筛选鉴定及其初步应用[D]，《四川农业大学》2016年，本研究从四川香肠中分离筛选得到既符合肉品发酵剂标准又对生物胺具有较高降解率的屎肠球菌和粪肠球菌，并将其作为发酵剂接种至四川香肠，经生物胺含量和氨基酸含量分析，接种的发酵剂能够促进四川香肠中的蛋白质和生物胺降解，但能够显著降解的生物胺只有尸胺、组胺和色胺的含量。从以上文献报道进一步说明，鉴于目前的肉类发酵剂还难以保证四川香肠独特风味和安全性，因此，从四川传统香肠中筛选出能够促进蛋白质和生物胺降解的乳酸菌，对于推动四川香肠传统工艺和现代化产业的有机结合，具有十分必要的意义。

发明内容

针对在四川香肠的生产中，缺少用于保证其独特风味和安全的肉类发酵剂的这一问题，本发明从采集于四川省都江堰市青城山的传统香肠中筛选到一种植物乳杆菌（Lactobacillus>）1-1，该植物乳杆菌的主要发酵特征满足肉类发酵剂的要求，并且在体外模拟体系和四川香肠中均能够促进肌浆蛋白和生物胺降解，有利于提升四川香肠风味、滋味和安全，具有运用于四川香肠实际生产的潜力。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

植物乳杆菌（Lactobacillus>）1-1，于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为CGMCC NO.15467。

所述植物乳杆菌1-1是从采集自四川省都江堰市青城山的传统香肠中分离获得。

所述植物乳杆菌1-1在De Man Rogosa Sharpe（MRS）琼脂培养基上生长良好，菌落为乳白色，凸起，圆形，光滑，边缘整齐。通过光学显微镜对其菌体形态进行观察，该菌株细胞呈短杆状，无芽孢和鞭毛。

所述植物乳杆菌1-1，通过采用细菌通用引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增，得到有1403碱基对（bp）组成的目的基因序列，如SEQUENCE LISTING 所示。将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的Lactobacillus>标准菌株MG983980.1相似率达99%，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus>）。

所述植物乳杆菌1-1的主要发酵特征满足肉类发酵剂的要求，即具有蛋白酶活性，不产NH₃、生物胺、H₂S和CO₂，能够耐受6%>2，并能够在pH4.2>

进一步，为探究植物乳杆菌1-1降解肌浆蛋白和生物胺的能力，本发明通过将植物乳杆菌1-1分别接种到两种体外模拟体系，即猪肉肌浆蛋白提取液，以及含有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺的磷酸盐缓冲液，并证明所述植物乳杆菌1-1在体外模拟体系中能够促进猪肉肌浆蛋白和生物胺降解。

又进一步，为探究植物乳杆菌1-1对四川香肠肌浆蛋白降解情况和生物胺含量的影响，本发明通过将所述植物乳杆菌1-1应用于四川香肠中，并证实所述植物乳杆菌1-1能够促进四川香肠肌浆蛋白降解和减少四川香肠色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺的含量。

以上研究结果表明，本发明提供的植物乳杆菌1-1的主要发酵特征满足肉类发酵剂的要求，并具有降解肌浆蛋白和生物胺的能力，有运用于四川香肠实际生产的潜力。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1、本发明提供的植物乳杆菌（Lactobacillus>）1-1，筛选分离自四川省都江堰市青城山的传统香肠制品，在De Man Rogosa Sharpe（MRS）琼脂培养基上生长良好，主要发酵特征满足肉类发酵剂的要求，即具有蛋白酶活性，不产NH₃、生物胺、H₂S和CO₂，能够耐受6%>2，并能够在pH4.2-6.0和10-30℃生长，该菌种主要发酵特征适合实际生产的条件。

2、本发明提供的植物乳杆菌1-1在体外模拟体系中具有较好的降解肌浆蛋白和生物胺能力，具有较强的应用潜力。

3、本发明提供的植物乳杆菌1-1应用于四川香肠，既能使四川香肠的肌浆蛋白发生明显降解，又能够显著减少四川香肠中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺含量（P<0.05），从而保证并提升了四川香肠独特的风味、滋味和安全，有望推动四川香肠传统工艺和现代化产业的有机结合。

附图说明

图1为植物乳杆菌1-1在MRS琼脂培养基的菌落形态图；

图2为植物乳杆菌1-1在光学显微镜下的细胞形态图；

图3为肌浆蛋白条发酵液在不同发酵天数的条带变化SDS-PAGE图谱，其中，M为蛋白Marker，0-4为发酵天数（天）；

图4为四川香肠在不同加工阶段的肌浆蛋白条带变化SDS-PAGE图谱，其中，M为蛋白Marker，1-5：分别代表第0天、发酵结束、成熟第2天、成熟第4天和干燥结束；

图5为干燥结束后四川香肠中的生物胺含量示意图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不限于此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下为本发明实施例中所采用的培养基：

一、MRS琼脂培养基：10 g蛋白胨、1 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、5 g乙酸钠、2g磷酸二氢钾、2 g柠檬酸铵、0.5 gMgSO₄•7H₂O、0.25>4•4H₂O、1>

二、主要发酵特征检测培养基：

1）耐亚硝酸盐试验培养基：同MRS液体培养基，但再加入NaNO₂，使得NaNO₂的终浓度为150mg/L。

2）耐盐实验培养基：同MRS液体培养基，但再加入NaCl，使得NaCl的终浓度为6%。

3）葡萄糖产气培养基：10 g蛋白胨、5 g氯化钠、1 L蒸馏水、pH调至7.4，1 mL 1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液、20 g葡萄糖，分装于试管，将杜氏小管倒置放入试管中，121℃灭菌30min。

4）精氨酸产NH₃培养基：20>2HPO4、2>4•7H₂O、0.25>4•4H₂O、1>

5）产H₂S培养基：10>

6）石蕊牛奶培养基：10 g脱脂奶粉，0.1 L蒸馏水，4 mL 25 g/L的石蕊，113℃灭菌15 min。

7）脂肪酶活性检测培养基：同MRS固体培养基，但再加入15%的猪油和中性红指示剂。

8）氨基酸脱羧酶试验培养基：5 g蛋白胨、3 g酵母膏、1 g葡萄糖、1 mL1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液、5 g L-氨基酸、1 L蒸馏水，调pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于试管，再在试管中加入一层液体石蜡，115℃灭菌10 min。

上述培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。

下述实施例中所采用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

植物乳杆菌1-1的分离、培养及分子鉴定

在无菌条件下，称取5 g剪碎的样品，置于装有50 mL无菌蒸馏水的三角瓶中，室温摇床震荡30 min。静置数分钟，吸取上清液依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布于MRS固体培养基上，37℃倒置培养48 h。根据培养基上的菌落形态和初步镜检观察，挑选不同的特征菌落，经多次划线分离纯化。纯化之后的菌株，用相应的液体培养基进行增殖培养后，提取菌株基因组DNA，并使用细菌通用引物27F和1492R对其16S rDNA进行扩增，扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃最终延伸10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳验证为单一条带，条带长度为1500 bp左右，送出测序。

上述细菌通用引物27F和1492R由Invitrogen公司（上海）合成。27F序列为AGAGTTTGATCCTGGCTC，1492R序列为CTACGGCTACCTTGTTACGA。

扩增片段测序长为1403 bp，将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，与Genebank中的Lactobacillus>标准菌株MG983980.1相似率达99%，初步鉴定菌株1-1为一株Lactobacillus>，即植物乳杆菌。

将所述植物乳杆菌1-1划线于MRS琼脂培养基上，37℃倒置培养48 h后，对菌株的菌落形态进行观察。如图1所示，所述菌株1-1在MRS培养基上生长良好，菌落为乳白色，凸起，圆形，光滑，边缘整齐。

对所述植物乳杆菌1-1的菌体形态进行光学显微镜观察，如图2所示，植物乳杆菌1-1细胞呈短杆状，无芽孢和鞭毛。

实施例2

植物乳杆菌1-1主要发酵特征的检测

1、耐盐试验：将植物乳杆菌1-1接种到耐盐试验培养基中，37℃培养24 h后于600 nm处测定OD值。NaCl耐受性（%）=（OD_{600（添加了NaCl）}/OD_{600（没添加NaCl）}）×100%

2、耐亚硝酸盐试验：将植物乳杆菌1-1接种到耐亚硝酸盐试验培养基中，37℃培养24h后于600 nm处测定OD值。NaNO₂耐受性（%）=（OD_{600（添加了NaNO2）}/OD_{600（没添加NaNO2）}）×100%

3、不同温度生长情况：将植物乳杆菌1-1接种到MRS液体培养基中，分别在不同温度下培养24 h，600 nm处测定OD值。

4、不同pH生长情况：将植物乳杆菌1-1接种到pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的MRS液体培养基中，37℃培养24 h，600 nm处测定OD值。

5、产过氧化氢酶试验：将植物乳杆菌1-1接种到MRS琼脂培养基上。37℃培养24 h。滴加5 %的过氧化氢溶液到菌苔上，有气泡产生为阳性，反之为阴性。

6、蛋白质分解试验：将植物乳杆菌1-1接种于石蕊牛奶培养基中，37℃培养48 h。乳酸菌利用培养基中的乳糖产酸，酸度增高，牛奶凝固。如果菌株为蛋白酶阳性菌，蛋白会被分解，培养基会较澄清略透明。

7、脂肪分解试验：取0.1 ml稀释到合适浓度的植物乳杆菌1-1的菌液均匀涂布于脂肪培养基上，37℃培养24 h，观察培基上是否有产生红色斑点，有红色斑点出现为阳性，反之为阴性。

8、产NH₃试验：将植物乳杆菌1-1接种到产氨培养基中，另做一个空白对照，37℃培养24>

9、氨基酸脱羧酶试验：将植物乳杆菌1-1接种于氨基酸脱羧酶试验培养基，37℃培养24 h，由于氨基脱羧酶阳性菌株会产生碱性生物胺，培养基会颜色变为紫色，阴性菌株会代谢葡萄糖产生有机酸，使培养基颜色变成黄色。对照管应为黄色。

10、产H₂S试验：将植物乳杆菌1-1接种于产H₂S培养基中，将无菌乙酸铅纸条悬挂在接种试管中。37℃培养24>

11、葡萄糖产气试验：将植物乳杆菌1-1接种到葡萄糖产气培养基中进行培养，观察杜氏小管中是否有气泡，有气泡的为阳性。

通过上述试验，检测到所述植物乳杆菌1-1的主要发酵特征如表1所示，从表1可以得知，该菌株具有蛋白酶活性，不产NH₃、生物胺、H₂S>2，能够耐受6%>2，并能够在pH>

表1 植物乳杆菌1-1的主要发酵特征

注：+表示阳性结果，-表示阴性结果。

实施例3

体外模拟体系探究植物乳杆菌1-1降解肌浆蛋白和生物胺能力

1、体外模拟体系探究植物乳杆菌1-1降解肌浆蛋白能力：称取6 g剪碎的猪背最长肌，加入10倍体积冰过的去离子水，匀浆1 min。匀浆液先在4 ℃下静置30 min，再在4℃下，10000 × g离心10 min。Whatman 4号滤纸过滤上清液。滤液中补充1%的葡萄糖，并将滤液pH调至6.0，滤液用0.22 μm的滤膜过滤除菌，即得肌浆蛋白提取液。将经3次传代培养的植物乳杆菌1-1的菌体按照10^{7>cell/mL的终浓度接种至肌浆蛋白提取液中，混匀，放于37℃培养4天。以不加菌体的肌浆蛋白提取液同样条件下培养4天作为对照。每天取样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。吸取120 μL肌浆蛋白发酵液和30 μL 5×加样缓冲液，混合均匀，沸水浴5 min，8000× g离心5 min，取15 μL上清液上样，进行电泳。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。样品在浓缩胶中时电压为80 V，样品进入分离胶后电压改为120 V。电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，放于考马斯亮蓝R-250染色液中染色30 min。将凝胶从染色液中取出，置于脱色液中，多次脱色至蛋白条带变清晰，背景干净。将脱色好的凝胶置于凝胶成像系统拍照。结果如图3所示，在发酵第4天，与对照相比，植物乳杆菌1-1能使除63.0 kDa处的条带之外的其余条带均降解消失。说明菌株1-1对肌浆蛋白具有较强的降解作用，有改善香肠风味和滋味的潜力。}

2、体外模拟体系探究植物乳杆菌1-1降解生物胺能力：将经3次传代培养的植物乳杆菌1-1的菌体按照10⁷>3溶液和12>2CO₃溶液，混合均匀，调pH至9.2，再加入16.65>2CO₃）和1>

生物胺降解率=（对照组上清液生物胺含量-实验组上清液生物胺含量）/对照组上清液中生物胺含量×100%

表2 生物胺分析的梯度洗脱程序

在体外模拟体系中植物乳杆菌1-1对生物胺的降解情况如表3所示。从表3可看出，该植物乳杆菌对8种生物胺均有一定的降解作用，降解率均高于10%，其中对腐胺的降解率最高，至16.55%。植物乳杆菌1-1有望用于香肠生产，从而提高香肠的安全性。

表3 植物乳杆菌1-1对生物胺的降解率

实施例4

植物乳杆菌1-1应用于四川香肠

1、四川香肠的制作：将10 kg原料肉（猪肉，肥瘦比1︰4）绞碎，加入250 g食用盐，搅拌均匀，在4℃下腌制4 h。在腌制好的香肠肉片中加入100 g白砂糖、100 g白酒、100 g花椒粉和200 g辣椒粉，搅拌均匀。按照10⁷>9>

2、SDS-PAGE分析四川香肠肌浆蛋白降解情况：称取5 g剪碎的样品，加入10倍体积冰过的去离子水，匀浆1 min。匀浆液先在4℃下静置30 min，再在4℃下，10000 × g离心10min。Whatman 4号滤纸过滤上清液，即得肌浆蛋白提取液。肌浆蛋白提取液的SDS-PAGE分析步骤同实施例3中SDS-PAGE的分析步骤。结果如图4所示，对照香肠的肌浆蛋白条带在干燥之前几乎没有变化，在干燥结束后发生了一定程度的降解。接菌香肠的肌浆蛋白条带在第0天到成熟第2天几乎没有变化，在成熟第4天发生了轻微的降解，在干燥结束后，多处条带降解或消失，例如100.0 kDa下方的条带，63.0 kDa下方的条带，48.0 kDa和35.0 kDa之间的条带以及20.0 kDa下方的条带。说明接种到四川香肠中的植物乳杆菌1-1能够促进肌浆蛋白降解，而蛋白质降解对香肠的特殊风味和滋味的形成具有重要贡献。

3、HPLC分析四川香肠生物胺含量：取5g剪碎的四川香肠，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液，匀浆2 min。匀浆液在4℃下8000 × g离心10 min，收集上清液，即得生物胺提取液。吸取1 mL生物胺提取液，按照实施案例3中的方法进行柱前衍生和HPLC测定。结果如图5所示，两种香肠中含量最多的生物胺均是酪胺，其次是精胺，尸胺和组胺。对照香肠中这四种生物胺的含量依次为87.29 mg/kg，40.90 mg/kg，36.70 mg/kg和21.88 mg/kg，接菌香肠中这四种生物胺的含量依次为58.14 mg/kg，40.87 mg/kg，14.88 mg/kg和9.68 mg/kg。接菌香肠中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺的含量均显著低于对照香肠中这6种生物胺的含量（P>< 0.05），说明接种到四川香肠的植物乳杆菌1-1能够减少生物胺含量，提高四川香肠的安全性。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>一种植物乳杆菌及其在发酵制备四川香肠中的应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1403

<212>DNA

<213>植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400>1

gttaccccac cgactttggg tgttacaaac tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60

gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat 120

gtaggcgagt tgcagcctac aatccgaact gagaatggct ttaagagatt agcttactct 180

cgcgagttcg caactcgttg taccatccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240

ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag 300

agtgcccaac tcaatgctgg caactgataa taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360

caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag 420

ggaacgtcta atctcttaga tttgcatagt atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta 480

gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt 540

tcagccttgc ggccgtactc cccaggcgga atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag 600

ggcggaaacc ctccaacact tagcattcat cgtttacggt atggactacc agggtatcta 660

atcctgtttg ctacccatac tttcgagcct cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct 720

tcgccactgg tgttcttcca tatatctacg catttcaccg ctacacatgg agttccactg 780

tcctcttctg cactcaagtt tcccagtttc cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct 840

ttcacatcag acttaaaaaa ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg 900

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ataccgtcaa tacctgaaca gttactctca gatatgttct tctttaacaa cagagtttta 1020

cgagccgaaa cccttcttca ctcacgcggc gttgctccat cagactttcg tccattgtgg 1080

aagattccct actgctgcct cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc 1140

gattaccctc tcaggtcggc tacgtatcat tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta 1200

gctaatacgc cgcgggacca tccaaaagtg atagccgaag ccatctttca agctcggacc 1260

atgcggtcca agttgttatg cggtattagc atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct 1320

gggcaggttt cccacgtgtt actcaccagt tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg 1380

caagcaccaa tcaataccag agt 1403