一种快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记Marker Sex 1及鉴定方法

技术领域

本发明属于水产动物生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记Marker Sex 1及鉴定方法。

背景技术

三疣梭子蟹( Portunus>) 隶属于甲壳纲( Crustacea) 、十足目 ( Decapoda) 、梭子蟹科( Portunidae) 、梭子蟹属 (Portunus) ，是我国重要的渔业捕捞对象和海水养殖对象，具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富等优点，是经济价值高的重要海产品，市场需求不断增加。三疣梭子蟹雌蟹经济价值显著高于雄蟹，因此，为提高养殖效益，急需突破三疣梭子蟹全雌或高雌性比苗种培育和鉴定方法，其关键技术之一是获取一种能够鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记。然而，目前尚未见三疣梭子蟹性别分子标记的报道。

发明内容

本发明针对背景技术中提到的问题，提供了一种快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记及鉴定方法。利用本发明的技术方案，可以简便快捷的确定三疣梭子蟹的性别。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记Marker Sex 1，其具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明提供了利用所述的分子标记Marker Sex 1鉴定三疣梭子蟹遗传性别的鉴定方法，它包括以下步骤：

1）提取三疣梭子蟹肌肉组织的基因组DNA；

2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应；

3）对PCR扩增产物进行纯化、测序；将测序结果与所述分子标记Marker Sex 1的DNA序列进行比对，若测序峰图出现单峰且与分子标记Marker Sex 1的DNA序列一致则为雌性，若测序峰图出现双峰则为雄性。

进一步的：所述步骤1）中选取质量和完整性均较好的基因组DNA，用灭菌ddH₂O稀释到60-80ng/μL。

进一步的：所述步骤2）中PCR扩增的引物为：

pF：5′-TACCTACTGACTCATTGCTGCC-3′；

pR：5′-CAGGATCATTTATTATTTGGCAAC-3′。

进一步的：所述步骤2）中PCR反应程序为：95℃，30s；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；72℃，10min。

进一步的：所述步骤2）中PCR反应体系为：DNA模板2μL；HiFi Buffer 2.0μL；dNTP1.6μL；上下游引物1μL；5U/ΜL 的HiFi酶0.2μL；灭菌水补至20μL。

进一步的：所述步骤3）中测序峰图中分子标记Marker Sex 1在65bp后出现大范围双峰。

进一步的：所述步骤3）中所述单峰对应的条带为276bp；双峰对应的条带分别是276bp和259bp。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明所述鉴定方法操作简便快捷，对样品的要求低，鉴定结果准确性高，且不受组织特异性及环境的影响，对促进全雌或高雌性比苗种培育技术的建立具有重要的作用。

附图说明

图1是测序峰图显示为雌性的结果图；

图2是测序峰图显示为雄性的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细阐述。

实施例1：

1）DNA抽提

取三疣梭子蟹的肌肉组织，利用经典酚氯仿法提取基因组DNA。经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提DNA进行质量检测。选取质量和完整性均较好的DNA用灭菌ddH₂O稀释到60-80ng/μL备用。

2）引物设计

利用Primer Premier 5.0软件，根据性别分子标记DNA序列设计引物。引物设计标准：1）PCR产物长度尽量覆盖标记序列，2）引物退火温度58-65℃，3）尽量避免引物本身、引物之间形成稳定的二聚体和发夹结构。本发明用到的引物信息如下：

pF：5′-TACCTACTGACTCATTGCTGCC-3′（SEQ ID NO:2）；

pR：5′-CAGGATCATTTATTATTTGGCAAC-3′（SEQ ID NO:3）。

3）PCR扩增

以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应；利用全式金公司的高保真酶进行PCR扩增，设置反应程序为：95℃，30s；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；72℃，10min。

PCR体系如下：DNA模板2μL；HiFi Buffer 2.0μL；dNTP(2.5mM) 1.6μL；引物(上下游) 1μL；HiFi酶(5U/ΜL) 0.2μL；灭菌水补至20μL。

4）PCR产物测序及序列比对

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，选取条带较亮且单一的目的PCR产物送公司进行测序，pF为测序引物。利用vector NTI软件将测序序列进行比对，将测序结果与MarkerSex 1分子标记的DNA序列进行比对，雌性和雄性的测序峰图如图1和图2所示，如果测序峰图无杂峰且与Marker Sex 1分子标记的DNA序列一致则为雌性，因为雌性的PCR扩增产物为单一条带276bp。如果测序峰图中分子标记Marker Sex 1在65bp后出现大范围双峰则为雄性（因为17bp在65-81bp之间，测序也就在65bp后出现双峰或杂峰）。因为雄性的PCR扩增产物条带为两条条带，分别是276bp和259bp，两条条带相比较之间相差一段17bp的indel突变，所述17bp indel位点在Marker Sex 1上的具体位置为：65-81bp。

其中，所用的分子标记Marker Sex 1的核苷酸序列为（SEQ ID NO:1）：

gatatacctactgactcattgctgcccagtttgcaccacttaatccgtagactgcaacgtgcattatgtgatgaacagcatgtaagtgtgacttaaatcatataatgtaaagactatttttaaacttggtagcatacatttcactcccatatgtcttgaaattatgtttgagaactcaccatgagtccacactgtttgtgtgttgacaataaagtagaagaaacttttcctttatgttagactatgcggatacagtgttgccaaataataaatgatcctgaataata。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种快速鉴定三疣梭子蟹遗传性别的分子标记Marker Sex 1及鉴定方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 287

<212> DNA

<213> 三疣梭子蟹(Tripod crab)

<400> 1

gatataccta ctgactcatt gctgcccagt ttgcaccact taatccgtag actgcaacgt 60

gcattatgtg atgaacagca tgtaagtgtg acttaaatca tataatgtaa agactatttt 120

taaacttggt agcatacatt tcactcccat atgtcttgaa attatgtttg agaactcacc 180

atgagtccac actgtttgtg tgttgacaat aaagtagaag aaacttttcc tttatgttag 240

actatgcgga tacagtgttg ccaaataata aatgatcctg aataata 287

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

<210> 3

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3