一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法

技术领域

本发明涉及痕量有机物检测技术领域，尤其是涉及一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法。

背景技术

内分泌干扰物是环境中能干扰生物体正常内分泌系统并导致异常效应的外源性化学物质。研究表明，内分泌干扰物能够在沉积物、水体、土壤和生物体内检出，并在环境中呈现出持久性，毒性，累积性和远距离传输等特征。目前已有数百种化学物质被认定为内分泌干扰物。

河口沉积物是水环境生态系统的重要组成部分之一，被认为是各类有机污染物的汇聚体。作为地表迁移物质和大气散落物质的重要宿体，河口沉积物是研究过去环境变化的良好载体。进入水体的内分泌干扰物将通过沉降作用汇集于底部沉积物，其检测可能存在各种干扰。

目前，国内外已公开了多种内分泌干扰物的检测方法，但现有检测方法仅适用于水相，难以做到在复杂河口沉积物中多类内分泌干扰物的同时测定。如申请日为2017.06.30的中国专利CN107121518A中公开了一种同时富集检测饮用水中酚类、雌激素类和雄激素类内分泌干扰物的方法，所述方法涉及一种水环境内分泌干扰物检测技术，可同时检测三大类11种内分泌干扰物，但抗干扰能力较差，仅适用于饮用水环境中的内分泌干扰物检测。

沉积物中内分泌干扰物的检测需要从基质中提取水样，提取方法既影响待测物的提取效率，也影响待测物净化和检测技术的选择。因此，建立适用于不同基质中内分泌干扰物提取测定技术非常关键。同时考虑到河口沉积物检测的复杂性，单一的提取法尚不足以应对沉积物中由类固醇激素、酚类化合物和药物化合物组成的多种内分泌干扰物。因此，亟需提出一种能够有效提取测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法，包括以下步骤：

(1)取冻干的河口沉积物样品，加入氧化铝和硅藻土进行研磨、过筛，加入内标物，得到预处理样品；

(2)取所述预处理样品加入溶剂进行索氏提取，浓缩索氏提取得到的提取液，得到浓缩液；

(3)在所述浓缩液中加入稀释剂，后加入到活化后的固相小柱进行萃取，再用淋洗液淋洗固相小柱并真空干燥，接着用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，通氮气吹干，加入有机溶液定容，混匀过滤得到待测样品液；

(4)采用LC-MS/MS绘制待测内分泌干扰物的标准曲线，从而测定水样中河口沉积物中内分泌干扰物的类别与含量。

优选地，步骤(1)中氧化铝：硅藻土：冻干的河口沉积物的质量比为1：(1～1.5)：(9～11)。

优选地，步骤(1)中内标物为雌二醇-D2、乙炔雌二醇-D4和黄体酮-D9。

优选地，步骤(2)中所述溶剂为甲醇/丙酮溶液。本发明中使用的甲醇/丙酮溶液指的是甲醇与丙酮的混合溶液，优选步骤(2)中溶剂为甲醇与丙酮按体积比1:1混合形成的溶液，即甲醇/丙酮(1:1，v/v)。

进一步地，步骤(2)中待测样品：溶剂的质量比为1：(40～50)。

优选地，步骤(3)中所述洗脱剂为乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵溶液。本发明中乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵指的是乙腈、甲基叔丁基醚和氢氧化铵混合形成的溶液，优选步骤(3)中洗脱剂为乙腈：甲基叔丁基醚：氢氧化铵按体积比为35:5:1形成的溶液，即乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)。

优选地，步骤(3)中固相小柱为C18固相萃取小柱，并依次采用乙腈、乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵、纯水/乙腈溶液对固相小柱进行活化。本发明中纯水/乙腈溶液指的是乙腈的水溶液，优选步骤(3)中依次采用乙腈、乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)、纯水/乙腈(9:1，v/v)对固相小柱进行活化。

优选地，步骤(3)中：固相小柱采用C18固相萃取小柱，并依次用乙腈、乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵和纯水/乙腈溶液对小柱进行活化，稀释剂为纯水/乙腈溶液，淋洗液为纯水/乙腈，洗脱剂为乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵溶液，有机溶液为纯水/甲醇溶液。优选步骤(3)中稀释剂为纯水/乙腈(9:1，v/v)，淋洗液为纯水/乙腈(9:1，v/v)，真空干燥时间为5min，洗脱剂为乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)，氮气吹干时设置氮吹仪干燥温度为40℃，定容时有机溶液为纯水/甲醇(7:3，v/v)，过滤采用0.22μm筒式PTFE滤膜。

优选地，步骤(4)中LC-MS/MS的运行参数为：色谱柱型号为30mm×2.1mm，ParticleSz.1.7μm的C18核壳反相色谱柱，柱温为40℃，进样流速为0.25mL/min，进样体积10uL，有机流动相为含0.2％NH₄OH的A/纯水溶液，水相为含0.2％NH₄OH的纯水/A混合溶液，所述有机溶液A为乙腈/甲醇溶液，梯度洗脱程序：0到3min，95％的水相线性降低到5％，保持2min，在5min时回到95％，保持5min；所述内分泌干扰物为双氯芬酸、双酚A、雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、辛基苯酚、壬基酚中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为4500V，干燥气温为600℃，雾化器压力为20psi；所述内分泌干扰物为扑米酮、睾酮、黄体酮中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为5500V，干燥气温为550℃，雾化器压力为20psi。本发明中A/纯水指的是A的水溶液，乙腈/甲醇指的是乙腈与甲醇的混合溶液，优选步骤(4)中有机流动相为含0.2％NH4OH的A/纯水(95:5，v/v)溶液，水相为含0.2％NH4OH的纯水/A(95:5，v/v)混合溶液，所述有机溶液A为乙腈/甲醇(3:2，v/v)溶液，其中A/纯水(95:5，v/v)指的是A:纯水的体积比为95:5，纯水/A(95:5，v/v)指的是纯水:A的体积比为95:5。

优选地，所述内分泌干扰物为双氯芬酸、双酚A、17β-雌二醇、雌酮、17α-乙炔雌二醇、4-辛基苯酚、4-壬基酚、扑米酮、睾酮、黄体酮中的至少一种。

本发明的有益效果是：

(1)本发明联用索氏提取与固相萃取的方式提取河口沉积物中内分泌干扰物，克服了单独使用索氏提取法耗时长、试剂用量大的缺点，达到了对目标物的高效富集，减少了目标物的损失。

(2)本发明适用于河口沉积物中多种内分泌干扰物的测定，检测精度高，结果可靠，实用性强。

附图说明

图1为本发明对河口沉积物内分泌干扰物的测定流程示意图；

图2为实施例4中采用不同索氏提取时间的测定结果数据图；

图3为实施例5中采用不同固相萃取柱的测定结果数据图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1

参见图1，本实施例提供一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法，包括以下步骤：

(1)河口沉积物预处理：称取5g冻干的河口沉积物样品，分别添加浓度为100ug/L十种目标内分泌干扰物混合标准溶液，加入氧化铝和硅藻土进行研磨，其中氧化铝：硅藻土：冻干的河口沉积物的质量比为1:1:9，得到的固体颗粒过筛，加入内标物，完成预处理；

(2)索氏提取：取1质量份的步骤(1)中预处理得到的样品加入纤维素管，加入40质量份的甲醇/丙酮(1:1，v/v)溶液，索氏提取8h，然后将得到的提取液旋转蒸发至约1～2mL；

(3)固相小柱的活化：取C18固相萃取小柱，并依次用5mL的乙腈、乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)和纯水/乙腈(9:1，v/v)溶液对固相小柱进行活化；

取步骤(2)中旋转蒸发得到的浓缩液，加入15mL纯水/乙腈(9:1，v/v)进行稀释，然后加入到步骤(3)中活化的固相小柱中进行萃取，再加入10mL纯水/乙腈(9:1，v/v)淋洗柱子并进行真空干燥5min，接着使用三份5mL乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)洗脱，收集洗脱液，通氮气吹干时，设置氮吹仪干燥温度为40℃，加入有机溶液纯水/甲醇(7:3，v/v)定容，采用0.22μm筒式PTFE滤膜过滤得到待测样品液；

(4)采用LC-MS/MS绘制待测样品液中内分泌干扰物的标准曲线，从而测定水样中河口沉积物中内分泌干扰物的类别与含量，其中LC-MS/MS的运行参数为：色谱柱型号为30mm×2.1mm，Particle Sz.1.7μm的C18核壳反相色谱柱，柱温为40℃，进样流速为0.25mL/min，进样体积10uL，有机流动相为含0.2％NH₄OH的A/纯水(95:5，v/v)溶液，水相为含0.2％NH₄OH的纯水/A(95:5，v/v)混合溶液，所述有机溶液A为乙腈/甲醇(3:2，v/v)溶液，梯度洗脱程序：0到3min，95％的水相线性降低到5％，保持2min，在5min时回到95％，保持5min；所述内分泌干扰物为双氯芬酸、双酚A、雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、辛基苯酚、壬基酚中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为4500V，干燥气温为600℃，雾化器压力为20psi；所述内分泌干扰物为扑米酮、睾酮、黄体酮中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为5500V，干燥气温为550℃，雾化器压力为20psi。

经检测，本实施例的检测方法的回收率、基质效应、方法检出极限和线性度的结果如表1所示。

表1本实施例的检测方法的参数

结果表明，待检测内分泌干扰物在本实施例的仪器条件下线性关系良好，线性相关系数R²＞0.99，待检测物质的方法检出限低，方法检出限范围为0.02～0.35ng/g，使用本发明的检测方法分析结果准确，回收率高且抗干扰能力强，低浓度水平检出限保证了该分析方法检测河口沉积物痕量内分泌干扰物的可能性。

实施例2

本实施例提供一种测定河口沉积物中多种内分泌干扰物含量的方法，包括以下步骤：

(1)从华南某河口采集的沉积物样品，冷干河口沉积物样品，称取5g冻干的河口沉积物样品，分别添加浓度为100ug/L十种目标内分泌干扰物混合标准溶液，加入氧化铝和硅藻土进行研磨，其中氧化铝：硅藻土：冻干的河口沉积物的质量比为1:1.5:11，得到的固体颗粒过筛，加入内标物，完成预处理；

(2)索氏提取：取1质量份的步骤(1)中预处理得到的样品加入纤维素管，加入40质量份的甲醇/丙酮(1:1，v/v)溶液，索氏提取8h，然后将得到的提取液旋转蒸发至约1～2mL；

(3)固相小柱的活化：取C18固相萃取小柱，并依次用5mL的乙腈、乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)和纯水/乙腈(9:1，v/v)溶液对固相小柱进行活化；

取步骤(2)中旋转蒸发得到的浓缩液，加入15mL纯水/乙腈(9:1，v/v)进行稀释，然后加入到步骤(3)中活化的固相小柱中进行萃取，再加入10mL纯水/乙腈(9:1，v/v)淋洗柱子并进行真空干燥5min，接着使用三份5mL乙腈/甲基叔丁基醚/氢氧化铵(35:5:1，v/v/v)洗脱，收集洗脱液，通氮气吹干时，设置氮吹仪干燥温度为40℃，加入有机溶液纯水/甲醇(7:3，v/v)定容，采用0.22μm筒式PTFE滤膜过滤得到待测样品液；

(4)采用LC-MS/MS绘制待测样品液中内分泌干扰物的标准曲线，从而测定水样中河口沉积物中内分泌干扰物的类别与含量，其中LC-MS/MS的运行参数为：色谱柱型号为30mm×2.1mm，Particle Sz.1.7μm的C18核壳反相色谱柱，柱温为40℃，进样流速为0.25mL/min，进样体积10uL，有机流动相为含0.2％NH₄OH的A/纯水(95:5，v/v)溶液，水相为含0.2％NH₄OH的纯水/A(95:5，v/v)混合溶液，所述有机溶液A为乙腈/甲醇(3:2，v/v)溶液，梯度洗脱程序：0到3min，95％的水相线性降低到5％，保持2min，在5min时回到95％，保持5min；所述内分泌干扰物为双氯芬酸、双酚A、雌二醇、雌酮、乙炔雌二醇、辛基苯酚、壬基酚中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为4500V，干燥气温为600℃，雾化器压力为20psi；所述内分泌干扰物为扑米酮、睾酮、黄体酮中的至少一种时，质谱采用负离子模式扫描，毛细管电压为5500V，干燥气温为550℃，雾化器压力为20psi。经上述检测步骤分析检测的结果如表2所示。

表2华南某河口沉积物检测结果

实验结果表明，本发明的检测方法已成功应用于华南某河口沉积物中的内分泌干扰物的检测。

对比例1：对比例1与实施例1相同，不同之处在于去除步骤(3)，然后将步骤(2)中旋转蒸发得到的浓缩液中加入纯水/甲醇(7:3，v/v)定容，混匀过滤膜得到待测样品液，然后进行步骤(4)。

对比例2：对比例1与实施例1相同，不同之处在于步骤(2)具体为：将步骤(1)中预处理得到的样品加入甲醇/丙酮(1:1，v/v)溶液超声30min，离心分离得到上清液，旋转蒸发至约1～2mL。

经实施例1和对比例1-2中的检测方法测定河口沉积物中内分泌干扰物，测定结果如表3所示。

表3实施例1和对比例1-2的检测方法的测定结果

实验结果显示，使用本发明的检测方法时待测物质的回收率要明显优于对比例1和对比例2，表明索氏提取与固相萃取的联用效果要明显优于两者的单独使用。

实施例3：索氏提取时间优化

为充分合理利用时间，实现各种内分泌干扰物的高效提取，本发明优化了索氏提取效率，考察不同提取时间(4h、6h、8h和10h)对回收率的影响，结果如图2所示。实验结果表明，随索氏提取时间的增加，目标内分泌干扰物的回收率不断提高，当提取时间为8h时，各组分回收率增幅减缓，基本趋于恒定，所以选择索氏提取的时间为8h，既保证较高的回收率，又适当节省时间。

实施例4：固相萃取柱优化

不同萃取柱对不同种类内分泌干扰物的富集效果不同，由于本发明专利涉及多类内分泌干扰物，为实现各种内分泌干扰物的高效萃取和富集，本发明根据经验比较了3种常用固相萃取柱(HLB、MCX和C18)的选择对目标物富集效率的影响，结果如图3所示。结果表明，采用C18柱萃取时，富集效果最佳，可实现多类内分泌干扰物的有效富集。