一种检测红细胞变形性的微流控芯片及其方法

技术领域

本发明涉及微流芯片技术，具体涉及一种检测红细胞变形性的微流控芯片及其方法。

背景技术

红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，呈双面凹的圆饼状，直径6～8μm，厚度边缘约2μm、中央约1μm，具有极强的变形性，使其能够在120天的寿命中多次穿过小于其直径的毛细血管而不受到损伤，这种变形性是维持人体内血液循环、物质交换、能量转移等多种生命活动的保证。以微流控芯片为基础的微流控系统是一种常见的红细胞变形性检测的方法，现有的微流控芯片中模拟红细胞挤压通过毛细血管的通道多为单通或多通的直通道，给通过其中的红细胞提供垂直于前进方向的挤压应力使红细胞发生形变进而检测变形性。然而人体内的毛细血管形状蜿蜒曲折多种多样，红细胞在前进过程中不只受到血管壁的挤压，同时在不停的转弯中还发生了弯折形变，因此传统的直通道对于通过其中的红细胞只能提供单一的挤压应力，对于血管的模拟效果不够好。

发明内容

针对以上现有技术中存在的问题，本发明提出了一种检测红细胞变形性的微流控芯片及其方法。

本发明的一个目的在于提出一种检测红细胞变形性的微流控芯片。

本发明的检测红细胞变形性的微流控芯片包括：基板、波浪形微流通道和盖板；其中，在硬质的模板上形成具有波浪形微流通道的阳纹图案；基板的原液铺盖在模板上，覆盖整个阳纹图案，原液凝固后形成基板，在基板的表面形成波浪形微流通道的阴纹图案；基板的具有阴纹图案的表面与透光的盖板通过键合方式密封在一起，从而在基板的表面与盖板之间形成封闭的通道，即波浪形微流通道；波浪形微流通道包括依次连接的入口、第一缓冲直通道、第一连接部分、波浪通道、第二连接部分、第二缓冲直通道以及出口，第一和第二缓冲直流通道的宽度大于红细胞的最大直径，高度大于红细胞的最大厚度，使红细胞通过时不发生挤压，第一和第二连接部分为等腰梯形，高度大于红细胞的最大厚度；第一连接部分的前端宽度与第一缓冲直流通道的宽度相同，末端宽度与波浪通道的宽度相同，第二连接部分前端宽度与波浪通道的宽度相同，末端宽度与第二缓冲直流通道的宽度相同；波浪通道的宽度大于1μm且小于红细胞的最小直径，高度大于1μm且小于红细胞的最小直径，使红细胞通过时发生挤压变形，形状为弯曲的曲线；在基板上分别开设有入口通孔和出口通孔，入口通孔连通至波浪形微流通道的入口，出口通孔连通至波浪形微流通道的出口。

基板采用透光且性质稳定并对红细胞无毒性作用的材料。盖板采用透光且性质稳定并对红细胞无毒性作用的材料。

第一和第二连接部分的侧边的夹角在30～120°，使波浪通道和缓冲直通道平滑的连接。

波浪通道的路径长度在显微镜CCD摄录范围内越长越好。

进一步，本发明采用灌流液推进装置将红细胞的灌流液灌流入检测红细胞变形性的微流控芯片中；灌流液推进装置包括入口灌流液容器、连接软管以及出口灌流液容器；在入口灌流液容器和出口灌流液容器中分别盛放灌流液，入口灌流液容器与出口灌流液容器内的灌流液的液面存在高度差h；入口灌流液容器和出口灌流液容器的底端分别通过连接软管连接至微流控芯片的入口通孔和出口通孔，h＞0。

本发明的另一个目的在于提供一种检测红细胞变形性的微流控芯片的制备方法。

本发明的检测红细胞变形性的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)提供能够重复使用的硬质的模板，在模板上形成波浪形微流通道的阳纹图案；

2)将基板的原液铺盖在模板上，覆盖整个阳纹图案；

3)将原液凝固形成基板，从而在基板的表面形成波浪形微流通道的阴纹图案，波浪形微流通道包括依次连接的入口、第一缓冲直通道、第一连接部分、波浪通道、第二连接部分、第二缓冲直通道以及出口；

4)在基板没有阴纹图案的表面打孔分别形成入口通孔和出口通孔，分别连接波浪形微流通道的入口和出口；

5)将基板具有阴纹图案的表面与透光的盖板通过键合方式密封在一起，从而在基板的表面与盖板之间形成封闭的通道，即波浪形微流通道。

本发明的又一个目的在于提供一种检测红细胞变形性的微流控芯片的检测方法。

本发明的检测红细胞变形性的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：

1)倒置荧光显微镜，将检测红细胞变形性的微流控芯片设置于荧光显微镜之上，盖板一侧向下对着荧光显微镜；

2)采用灌流液推进装置，通过高度差控制的压强梯度法，将灌流液注入至检测红细胞变形性的微流控芯片中，推动微流芯片中灌流液的流动；

3)光源从基板一侧垂直照射波浪形微流通道；

4)打开倒置荧光显微镜的摄录功能，录制红细胞在固定压强梯度下通过波浪形微流通道的录像；

5)根据红细胞通过波浪形微流通道的速度，表征红细胞变形性。

在步骤2)中，在压强梯度法中，压强梯度定义为灌流液进入出入口之间压强差Δp＝ρgh与波浪形微流通道的长度L之比，其中，ρ为灌流液的密度，g为重力加速度，h为灌流液推进装置的入口灌流液容器与出口灌流液容器内的灌流液的液面高度差，压强梯度＝Δp/L，单位Pa/μm。当液面持平时，即高度差为0时，波浪形微流通道中灌流液呈静止状态，固定的压强梯度对应微流芯片通道中固定的流体速度。压强梯度法适用于灌流液的流量较低的情况：大于0小于50000μm³/s，即每小时流量0.18ml，测试期间对应灌流液容器页面下降高度基本可以忽略不计，灌流液容器要求：使用的注射器容量大于20ml，使液体表面张力影响可以被忽略。

传统的注射泵方法最小流量单位约10⁶μm³/s，即只能实现流量大于10⁶μm³/s的灌流液体积流量并且提供的灌流液流量变化是跳跃的，即最小流量单位的正整数倍，灌流液体积流量＝横截面*灌流液流速，对于本发明这种横截面较小的通道，会导致灌流液流速过快，对CCD帧频要求过高影响检测，与之相比，本发明的压强梯度法对应的灌流液流量变化对应的高度差h是一个大于等于0的连续数值，因此能够实现注射泵无法达到的灌流液流速度调节精度和最低流速，同时也降低了对CCD帧频的要求。

在步骤5)中，固定压强梯度下，测量红细胞通过波浪形微流通道的速度，通过速度越快则变形性越强，反之越弱。

本发明的优点：

本发明采用波浪形微流通道，包括依次连接的入口、第一缓冲直通道、第一连接部分、波浪通道、第二连接部分、第二缓冲直通道以及出口，在提供持续挤压应力的同时，红细胞还随着波浪的变化发生弯折变形，提供了另一种形式的应力；采用灌流液推进装置，通过高度差控制的压强梯度法，将灌流液注入至检测红细胞变形性的微流控芯片中，推动微流芯片中灌流液的流动；本发明能够达到体外检测红细胞变形性目的，能够从直径更是从形状上有效模拟人体毛细血管血液微循环环境，尤其能够体外实验模拟红细胞在脾脏处挤压情况。

说明书附图

图1为本发明的检测红细胞变形性的微流控芯片的一个实施例的示意图；

图2为本发明的检测红细胞变形性的微流控芯片的一个实施例的波浪形微流通道的俯视图。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

如图1所示，本实施例的检测红细胞变形性的微流控芯片包括：基板1、波浪形微流通道和盖板2；其中，基板1的具有阴纹图案的表面与透光的盖板2通过键合方式密封在一起，从而在基板的表面与盖板之间形成封闭的通道，即波浪形微流通道；如图2所示，波浪形微流通道包括依次连接的入口3、第一缓冲直通道4、第一连接部分41、波浪通道5、第二连接部分、第二缓冲直通道以及出口；在基板上分别开设有入口通孔和出口通孔，入口通孔连通至波浪形微流通道的入口，出口通孔连通至波浪形微流通道的出口。灌流液推进装置包括入口灌流液容器6、连接软管以及出口灌流液容器7；入口灌流液容器和出口灌流液容器的底端分别通过连接软管连接至微流控芯片的入口通孔和出口通孔。

在本实施例中，波浪形微流通道的高为4μm；入口和出口的平面的形状为直径1mm的圆形；第一和第二缓冲直通道的宽度为30μm，用于稳定从入口进入的灌流液速度；第一和第二连接部分的侧面夹角为30°；波浪通道的平面的形状为包括8个周期且每个周期为两个相连接相等的半圆形，宽度为3μm；出口与入口之间的直线距离长度219μm，实际路程长343.8μm。

以“红细胞通过速度”来表征变形性的通道有其特有的检测限制，其速度检测上限公式为：V_max＝红细胞路程*CCD最大帧频。相比直通道，在出口与入口之间的直线距离相同的情况下，波浪形通道路程为原来的π/2倍，由公式可知，通道可检测速度上限也增大π/2倍。

本实施例的检测红细胞变形性的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)提供能够重复使用的硬质的硅板作为模板，在模板上形成波浪形微流通道的阳纹图案；

2)制备聚二甲基硅氧烷PDMS的原液，PDMS的预聚物按照基本组分的比例：固化剂＝10:1混合，搅拌充分后抽真空，铺盖在模板上，覆盖整个阳纹图案；

3)在80℃烘干40min，将原液凝固形成基板，从而在基板的表面形成波浪形微流通道的阴纹图案，波浪形微流通道包括依次连接的入口、第一缓冲直通道、第一连接部分、波浪通道、第二连接部分第二缓冲直通道以及出口；

4)在基板没有阴纹图案的表面打孔分别形成入口通孔和出口通孔，分别连接波浪形微流通道的入口和出口；

5)将基板具有阴纹图案的表面与透光的0.1mm厚的玻璃的盖板通过氧等离子体键合在一起5s，从而在基板的表面与盖板之间形成封闭的通道，即波浪形微流通道。

本实施例的检测红细胞变形性的微流控芯片的检测方法，包括以下步骤：

1)倒置荧光显微镜9，将检测红细胞变形性的微流控芯片设置于荧光显微镜之上，盖板一侧向下对着荧光显微镜；

2)采用灌流液推进装置，通过高度差控制的压强梯度法，入口灌流液容器与出口灌流液容器7之间的高度差为h，将灌流液注入至检测红细胞变形性的微流控芯片中，推动微流芯片中灌流液的流动；

3)光源8从基板一侧垂直照射波浪形微流通道；

4)打开倒置荧光显微镜的摄录功能，录制红细胞在固定压强梯度下通过波浪形微流通道的录像；

5)根据红细胞通过波浪形微流通道的速度，表征红细胞变形性。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。