超顺磁性氧化铁纳米颗粒在制备用于治疗神经性疾病的神经磁刺激增强剂中的应用

技术领域

本发明涉及磁性纳米粒子的应用，具体涉及超顺磁性氧化铁纳米颗粒在制备用于治疗神经性疾病的神经磁刺激增强剂中的应用。

背景技术

电磁刺激引起的神经功能调制作用被成功应用于多种神经源性疾病的临床治疗,比如脑神经刺激能对认知障碍性疾病进行有效的控制，具有可调及可逆等独特的优势，能缓解、改善甚至消除相应病症，使病人能较好地维持日常生活功能，提高生存质量。磁场作为一种非入侵性物理因子，能直接作用于生物体，从而产生相应的生物学效应。当机体所处的磁场发生改变时会影响细胞分子活性进而影响机体的活动。生物体的组织中含有大量的自由电子，在自然状态下这些自由电子是静止的。但是，当生物体组织处在电磁环境中时，就会激发生物组织内的自由电子不断的移动，因此在不断变化的电磁场中的生物体可以在很小的刺激下产生非常强烈的应答反应。

磁性纳米颗粒为纳米颗粒与磁性元素如铁、镍等结合成化学复合物，具有特殊的磁效应、磁导向性、良好的生物相容性、低毒性及长血液循环时间及因其小尺寸呈现出其特有的优点等。一方面，氧化铁颗粒已通过ISO国际质量管理体系安全认证，对生物体具有低的细胞毒性；另一方面，超顺磁纳米颗粒的剩磁Mr和矫顽力Hc基本趋于为零，导致颗粒与颗粒相互之间仅仅存在很微弱的磁偶极作用，能形成稳定的磁性流体。目前大量的体内外实验研究已证实磁性纳米颗粒在外磁场的作用较易透过血脑屏障，表面不需要进一步的化学或物理改变即可被脑部毛细血管内皮细胞吸收，并透过内皮细胞进入星形胶质细胞。而且磁性纳米颗粒的众多特点中最有优势的一个就是其超顺磁性-只有在磁性区域中被磁化，在磁性区域的影响下，颗粒被拽向磁场方向从而聚集在靶向位置附近，有外加磁场存在则可显现出磁性，而一旦撤去磁场，则颗粒重新迅速恢复无磁性状态。经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)利用时变磁场产生感应电场，引起生物电流在组织中传导，改变大脑皮层神经细胞的动作电位，影响脑内代谢和神经电活动。TMS技术已成为神经外科、精神科等临床科室的常用诊断与治疗手段，在脑功能研究方面也展示出巨大的潜力。然而，目前临床TMS的空间分辨率较差，较难准确作用某些脑区，缺乏标准化的小动物TMS设备，限制了机制方面的研究。已有的TMS设备只对其输出的磁场强度、刺激深度和聚焦区域分布进行理论推导，对实际磁场尚不能实现实时动态检测，温度检测不准确，只能给出大致预警作用温度范围。根据电磁场理论，TMS诱发的感应电场大体呈涡流状，很难实现针对某一靶点的磁刺激。磁刺激在非靶组织中存在能力损耗，在靶组织中的能量占用率相对较低。其中脑脊液层电导率较大，其产生的感应电场强度也较大，而头皮头骨上损耗的能量不仅使得靶组织的能力占用率减小，并且可能引起一定疼痛感。人脑与实验动物脑部在尺寸上的差异，离体研究和动物实验都只能与人体TMS研究进行简单的比对尚不能准确对应。

发明内容

发明目的：本发明提供了超顺磁性氧化铁纳米颗粒在制备用于治疗神经性疾病的神经磁刺激增强剂中的应用。超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为神经磁刺激增强剂，在外加磁场的作用下靶向脑区聚集，磁化或机械振动局部神经细胞，影响神经电活动，从而用于制备治疗神经性疾病神经磁刺激增强剂。

技术方案：本发明提供了超顺磁性氧化铁纳米颗粒在制备用于治疗神经性疾病的神经磁刺激增强剂中的应用。具体的应用方法为超顺磁性氧化铁纳米颗粒在外加磁场存在下制备神经磁刺激增强剂。磁体产生磁场并通过磁场发生相互作用，当机体所处的磁场发生改变时会影响细胞分子活性进而影响机体的活动。利用法拉第电磁感应定律，变化的磁场可以产生电场，可以在体外施加磁场，通过电磁感应在神经组织中产生一个脉冲电流，当感应电流超过神经组织兴奋域值时，达到活化神经环路的目的。

所述神经性疾病即神经系统的组织发生病变或机能发生障碍的疾病。

其中，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒具备如下性质：利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒的神经磁刺激增强作用，利用脑定位将超顺磁性氧化铁纳米颗粒施加到致病灶，在外加弱磁场的引导下，超顺磁性氧化铁纳米颗粒被拽向磁场方向从而聚集在靶向位置附近并与靶向脑区产生生物学效应，刺激其周围的神经细胞，产生动作电位，活化神经环路。

优选地，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒为核壳结构，其内部为三氧化二铁纳米颗粒，外层包被多聚糖；更优选地，所述多聚糖为改性右旋糖酐。

其中，外层包被改性右旋糖酐的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法参考WO2016/078576，具体参考实施例1。

参考WO2016/078576中的实施例1的方法，使用右旋糖酐T10为原料，还原右旋糖酐T10后进行羧甲基(-CH₂COOH)取代，可制备得到聚葡萄糖山梨醇羧甲醚(钠盐形式)。

反应瓶中分别加入400mg聚葡萄糖山梨醇羧甲醚(钠盐形式)和3mL蒸馏水，室温下机械搅拌使原料充分溶解；鼓入氮气、搅拌5min后，反应瓶中加入6mL水溶液(300mg六水合三氯化铁和150mg四水合氯化亚铁)，搅拌15min；撤去氮气，滴加氨水(1mL质量浓度为28％的浓氨水加水1mL稀释而得)，pH值调至11。启动高频感应加热设备，搅拌20min(80℃)；鼓入空气、搅拌25min(80℃)；关闭高频感应加热设备，停止搅拌。待降至室温，反应溶液直接转入透析袋(100KDa)中并在注射用水透析24h，透析后溶液离心超滤管(100KDa)浓缩，管内溶液经0.22μm滤膜过滤1次后，即得2.2mL超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

优选地，所述体外外加磁场为旋转磁场，旋转磁场的形成可以参考现有旋转磁场发生器。

优选地，所述旋转磁场的场强＜0.5T。外加磁场参数的检测方法如下：利用微磁学对磁场进行磁感应线分布模拟仿真。实验中，使用特斯拉计测量磁场强度周期性变化情况，磁场强度值最大值约为100.94mT，而且产生的磁场波形与脉冲磁场类似。

更优选地，所述旋转磁场由一对对称摆放的锥形磁铁以1-20Hz均匀旋转产生，在刺激部位产生的磁场波形为序列脉冲形状。这种结构的旋转磁场脉冲波形可以实现脑深层刺激。

优选地，所述神经性疾病为抑郁症、躁动症或精神分裂症。

有益效果：(1)在外加磁场的作用下，超顺磁性氧化铁纳米颗粒较易透过血脑屏障，具有特殊的磁效应、磁导向性、逃避吞噬、粘附细胞表面、良好的生物相容性、低毒性及长血液循环时间等优点，避免了血脑屏障被破坏、血管损伤，对附近神经细胞影响较小，尚未触动生物机体的免疫反应；(2)本发明利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒的神经磁刺激增强作用，利用脑定位将超顺磁性氧化铁纳米颗粒施加到致病灶，在外加磁场的引导下，超顺磁性氧化铁纳米颗粒被拽向磁场方向从而聚集在靶向位置附近并与靶向脑区产生生物学效应，刺激其周围的神经细胞，产生动作电位；(3)本发明中使用的旋转磁场脉冲波形可以实现脑深层刺激。

附图说明

图1为本发明中旋转磁场发生器的结构示意图；

图2为本发明中磁场的微磁学磁感线分布模拟；

图3为本发明中磁场的磁场强度周期性波形变化；

图4为超顺磁性氧化铁纳米颗粒在外加磁场的作用下对行为绝望抑郁模型小鼠的影响。

具体实施方式

实施例1超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备

参考WO2016/078576中的实施例1的方法，使用右旋糖酐T10为原料，还原右旋糖酐T10后进行羧甲基(-CH₂COOH)取代，可制备得到聚葡萄糖山梨醇羧甲醚(钠盐形式)。

反应瓶中分别加入400mg聚葡萄糖山梨醇羧甲醚(钠盐形式)和3mL蒸馏水，室温下机械搅拌使原料充分溶解；鼓入氮气、搅拌5min后，反应瓶中加入6mL水溶液(300mg六水合三氯化铁和150mg四水合氯化亚铁)，搅拌15min；撤去氮气，滴加氨水(1mL质量浓度为28％的浓氨水加水1mL稀释而得)，pH值调至11。启动高频感应加热设备，搅拌20min(80℃)；鼓入空气、搅拌25min(80℃)；关闭高频感应加热设备，停止搅拌。待降至室温，反应溶液直接转入透析袋(100KDa)中并在注射用水透析24h，透析后溶液离心超滤管(100KDa)浓缩，管内溶液经0.22μm滤膜过滤1次后，即得2.2mL超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

实施例2超顺磁性氧化铁纳米颗粒在外加磁场的作用下对行为绝望抑郁模型小鼠的影响实验

(1)实验动物及分组

5-6周龄雄性C57BL/6小鼠(C57BL/6J JAX^TMmice>

(2)动物给药与磁场作用

实施例1制备的超顺磁性氧化铁纳米颗粒溶解或混悬至所需给药浓度，小鼠适应期后第一天给药，利用脑定位注射仪精准注射于小鼠内侧前额叶mPFC，并利用自主研发的磁场进行磁场治疗；1％戊巴比妥(35-40mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，固定于脑立体定位注射仪上，采用Micro4^TM超微注射泵控制器和瑞沃德(RWD)脑立体定位仪，连接10微升的微量注射器，注射量为每侧300nL，磁性纳米颗粒浓度为1.67mg/mL，注射速度为150nL/min，进针后和注射后均停针5min。

旋转磁场发生器见图1，包括搅拌器1、磁场支架2、磁体3，搅拌器1和磁体支架2通过搅拌器1下端的插孔连接，磁体3设在磁体支架2的两端。支架2包括一体连接的垂直杆21和横杆22，垂直杆21插入搅拌器1，横杆22的两端分别设有圆柱体23，圆柱体23和磁体3通过圆柱体23下端的插孔连接。其中，磁体3为锥形磁铁。

将小鼠固定于50mL离心管中，分别置于磁体下，使磁体尖端距离小鼠头部5mm，磁场频率5Hz，治疗5天，每天2次，两次间隔8h，每次5min。

(3)检测指标

评估指标为：悬尾试验的绝望时间和旷场实验中小鼠的自发活动和探索行为。行为学实验前，将小鼠放入检测房间适应环境1h，所有的行为学评估在17:00-23:00PM完成。

悬尾试验(Tail suspension test，TST)：小鼠尾部1.0cm处用医用胶带粘于50cm×50cm×50cm的不透明箱顶部，使小鼠呈倒挂状态，离底部15cm，定义肢体无挣扎为不动。计时6min，统计后4min不动时间，即为悬尾试验结果。其原理是将小鼠悬挂于高处会表现出挣扎的状态，发现无法逃避后放弃挣扎肢体静止，不动时间即可反应抑郁状态。小鼠不动标准为小鼠停止挣扎，除呼吸外所有肢体均不动。

旷场试验(Open Field Test，OFT)：旷场试验是测定小鼠自发活动和探索行为的行为学范式。旷场试验箱由5面白色亚克力板组成，箱底部平均划为16格(每格12.5cm×12.5cm)，使用ANY-MAZE软件将旷场底部人为划分中央4格为中央区，其余12格为外周区；在安静且昏暗的房间，捏住小鼠尾巴(距尾部1/3处)轻放入实验箱中央，观察其在5min内总活动路程和中央区停留时间，红外照明，摄像头记录过程；每只小鼠试验后需清理箱内粪便等残留物，喷洒酒精并用纱布擦拭干净，以除去上一只小鼠的气味，避免影响下一只小鼠实验结果。焦虑小鼠更喜欢停留在旷场的“外周区”，对“中心区”探索行为减少，通过统计小鼠在“中心区”停留时间、活动路程和活动速度反映小鼠的焦虑程度。

数据分析：采用ANY-MAZE对行为学实验进行图像采集及数据分析。采用SPSS 17统计软件包进行统计学分析。数据采用均数±标准误表示，组间均数的比较采用方差分析(ANOVA)，组内均数的比较采用配对t检验，结果见图4。

由图4可知，注射超顺磁性氧化铁纳米颗粒组小鼠悬尾试验和旷场试验中的绝望时间均有显著改善，与sham-saline对照组相比，注射超顺磁性氧化铁纳米颗粒组小鼠悬尾试验的不动时间显著缩短，旷场中心区活动距离显著延长，并具有统计学差异。由此可初步得出超顺磁性氧化铁纳米颗粒在外加磁场的作用下，磁刺激内侧前额叶mPFC可减轻小鼠焦虑行为。