一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法

技术领域

本发明涉及作物逆境生理生态检测技术领域，具体涉及一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法。

背景技术

迄今，世界上许多地区，干旱仍然是农业的巨大威胁。世界上有三分之一的可耕地处于供水不足状态。许多国家和地区由于经常发生干旱，往往给农业生产带来巨大的灾难。因此，国际上对农作物的旱害问题正予以越来越多的关注，如何减轻干旱对作物的伤害，增加粮食产量，成为世界各国共同关心的问题。

由于玉米在发展国民经济和提高人民生活水平中具有重要的地位和不可代替的作用，因此，国家对依靠科技进步，提高玉米单产非常重视。但是，我国由于受季风气候影响，降雨量时空分布不均，在玉米生长发育的不同时期，常遇到不同程度的干旱，影响玉米生产。

花丝活力是指玉米花丝在吐出后一定时间内接受花粉并能受精结实的能力。在玉米雌穗吐丝期，如果遇到干旱等不良气候条件，花丝往往不能正常接受花粉而受精造成玉米果穗结实不良，对玉米产量影响严重。

截至目前，对花丝活力的研究方法均是在花丝吐出前给干旱胁迫下的玉米雌穗套袋，然后在花丝吐出后第7天进行人工饱和授粉，以保证每个花丝均有授精结实的机会，收获后统计每穗的结实数。花丝活力用结实率表示：结实率(％)＝(单穗结实数/穗行数×每行应结籽粒数)×100。玉米从授粉到收获一般80天左右，此种方法耗时长、效率低，限制了研究人员对玉米旱害程度的准确判断及抗旱应变措施的快速制定，截至目前还没有关于玉米花丝活力快速、准确测定方法的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法。本发明提供的测定方法能够及时对花丝活力进行检测，突出玉米花丝活力测定的原位性、快速性与准确性，能够为玉米抗旱应变措施的制定提供良好的参考依据。

本发明提供了一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法，包括以下步骤：

1)对在玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期发生干旱的玉米植株的雌穗进行套袋，得到套袋雌穗；

2)当步骤1)所述套袋雌穗吐丝第4～7天时，采用非干旱胁迫玉米植株的花粉对套袋雌穗的花丝进行人工饱和授粉，得到授粉后的花丝；

3)从步骤2)得到的授粉后的花丝中任意采集样品花丝，对所述样品花丝进行第一固定、染色、脱色和第二固定后，镜检测定花丝活力；所述第一固定用试剂包括乙醇水溶液和乳酸水溶液；所述第二固定用试剂包括乳酸水溶液；

所述花丝活力的计算公式为：

优选的是，步骤1)所述套袋为对长度为3～5cm的雌穗进行套袋。

优选的是，步骤3)所述采集为人工饱和授粉后，每隔4h采集一次。

优选的是，步骤3)所述第一固定用试剂中乙醇水溶液和乳酸水溶液的体积比为2:1，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为950g/kg，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为800g/kg；

所述第二固定用试剂中，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为800g/kg。

优选的是，步骤3)所述第一固定的时间为2h，所述第二固定的时间为24h。

优选的是，步骤3)所述染色用试剂包括含苯胺蓝的乳酸乙氧基苯胺溶液，所述苯胺蓝与乳酸乙氧基苯胺的质量比为1g：1kg，所述乳酸乙氧基苯胺包括体积比为1:1:1:1的乳酸、石碳酸、甘油和水。

优选的是，步骤3)所述染色时间为90min。

优选的是，步骤3)所述脱色用试剂为乳酸水溶液，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为400g/kg。

优选的是，步骤3)所述脱色的时间为90min。

优选的是，步骤3)所述镜检后，样品花丝呈蓝色表明花丝中存在花粉管。

本发明提供了一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法。本发明提供的测定方法立足于生产实践，能够突出玉米花丝活力测定的原位性、快速性与准确性，理论与实践相结合，对玉米抗旱应变措施的制定具有指导作用。一、玉米花丝处理原位性：本发明花丝活力的测定是在田间玉米自然生长状态下进行的，玉米的立地条件及各个器官的生长发育状态均保持完完全全的原位性，实现了在自然状态下对玉米花丝活力进行原位测定的目的，对生产实践的指导性更强。二、花丝活力测定快速性：本发明花丝活力的测定从样品花丝的采集到花丝活力的测定用时短，体现了该方法的快速性。而常规玉米花丝活力测定方法均是在花丝吐出前给干旱胁迫下的玉米雌穗套袋，在花丝吐出后一定时间进行人工饱和授粉，收获后统计每穗的结实数，然后用结实率(结实率(％)＝(单穗结实数/穗行数×每行应结籽粒数)×100)代表花丝活力。此种方法从授粉到收获一般80天左右，耗时长、效率低，限制了研究人员对玉米旱害程度的及时判断及抗旱应变措施的快速制定。三、花丝活力测定准确性：常规的用结实率代表花丝活力的最大弊端是，无法判断在玉米授粉后，因栽培条件没有得到充分满足而导致的在子粒形成期停止发育的籽粒数量，这直接影响花丝活力测定的准确性。本发明测定方法在花丝固定染色后进行镜检，统计花丝中存在花粉管的比率，即花丝活力，本发明的测定方法能够直接给出测定条件下准确的花丝活力。

具体实施方式

本发明提供了一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法，包括以下步骤：

1)对在玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期发生干旱的玉米植株的雌穗进行套袋，得到套袋雌穗；

2)当步骤1)所述套袋雌穗吐丝第4～7天时，采用非干旱胁迫玉米植株的花粉对套袋雌穗的花丝进行人工饱和授粉，得到授粉后的花丝；

3)从步骤2)得到的授粉后的花丝中任意采集样品花丝，对所述样品花丝进行第一固定、染色、脱色和第二固定后，镜检测定花丝活力；所述第一固定用试剂包括乙醇水溶液和乳酸水溶液；所述第二固定用试剂包括乳酸水溶液；

所述花丝活力的计算公式为：

本发明对在玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期发生干旱的玉米植株的雌穗进行套袋，得到套袋雌穗。本发明待套袋玉米植株的生长阶段选取的是玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期，在此时期若发生干旱，干旱发生4天左右时间即达到中度干旱胁迫水平，这样的干旱将严重影响玉米的花丝活力，进而影响玉米的授粉、受精及最终的籽粒产量。对花丝活力进行及时检测，准确掌握玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期玉米花丝活力受损状况，以及时制定抗旱应变措施能够最大限度地减少玉米的产量损失。在本发明中，所述套袋优选为对长度为3～5cm的雌穗进行套袋。本发明所述套袋能够防止花丝自由受粉。本发明对所述套袋的方法以及套袋所需材料没有特殊的限定，采用常规套袋方法和材料进行操作即可。

得到套袋雌穗后，本发明当套袋雌穗吐丝第4～7天，更优选为第6天时，采用非干旱胁迫玉米植株的花粉对套袋雌穗的花丝进行人工饱和授粉，得到授粉后的花丝。在本发明中，所述非干旱胁迫玉米植株优选为正常供水的玉米植株。本发明所述授粉保证能每条花丝均有机会授粉。本发明对所述授粉的操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规人工饱和授粉方法即可。

得到授粉后的花丝后，本发明从授粉后的花丝中任意采集样品花丝，对所述样品花丝进行第一固定、染色、脱色和第二固定后，镜检测定花丝活力；所述第一固定用试剂包括乙醇水溶液和乳酸水溶液；所述第二固定用试剂包括乳酸水溶液；

所述花丝活力的计算公式为：

在本发明中，所述采集优选为人工饱和授粉后，每隔4h采集一次。在本发明中，所述第一固定用试剂包括体积比为2:1的乙醇水溶液和乳酸水溶液，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为950g/kg，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为800g/kg。本发明对所述乙醇和乳酸的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规乙醇、乳酸市售产品即可。在本发明中，所述第一固定的时间为2h。本发明在所述第一固定后，优选对第一固定后的样品花丝进行冲洗，采取去离子水进行冲洗即可。得到第一固定后的样品花丝后，本发明对第一固定后的样品花丝进行染色，在本发明中，所述染色用试剂包括含苯胺蓝的乳酸乙氧基苯胺溶液，所述苯胺蓝与乳酸乙氧基苯胺的质量比为1g：1kg，所述乳酸乙氧基苯胺包括体积比为1:1:1:1的乳酸、石碳酸、甘油和水。在本发明中，所述染色时间为90min。得到染色后的花丝样品后，本发明对染色后的花丝样品进行脱色，在本发明中，所述脱色用试剂为乳酸水溶液，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为400g/kg。在本发明中，所述脱色的时间为90min。本发明在所述脱色后，优选对脱色后的花丝样品进行冲洗，所述冲洗用溶剂优选为去离子水。冲洗后，本发明对所述花丝样品进行第二固定，所述第二固定优选采用乳酸水溶液进行，所述乳酸水溶液中乳酸的含量为800g/kg。在本发明中，所述第二固定的时间优选为24h。镜检后，样品花丝呈蓝色表明花丝中存在花粉管。本发明对所述镜检没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的光学显微镜进行检测即可。

本发明得到花丝活力的测定结果后，优选采用以下4种MOC(Maize and OtherCrops)抗旱剂，MOC-1：FA+KH₂PO₄+尿素；MOC-2:FA+Br；MOC-3:爱农；和MOC-4:FA+胆固醇。本发明叶面喷洒MOC抗旱剂能够减轻玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期所受干旱胁迫的影响程度，使分化发育中后期的雌穗长和宽分别较对照平均增加18.8％和13.2％，每行粒数平均增加14.1％。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种干旱胁迫条件下玉米花丝活力的测定方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

在中国吉林省洮南市吉林省农业科学院农业试验基地进行试验。

①玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期发生干旱，进行玉米花丝活力测定。

②雌穗套袋处理：在玉米植株雌穗伸出3～5cm时进行套袋处理，防止花丝自由受粉。

③花丝人工授粉：用正常供水株的花粉给干旱胁迫条件下吐丝第6天的花丝进行人工饱和授粉，保证每条花丝均有机会授粉。

④花丝固定染色：考查干旱胁迫株的花丝中存在花粉管的比率，对人工授粉后的花丝每隔4小时取样一次。花丝在第一固定用试剂(乙醇水溶液和乳酸水溶液的体积比为2:1，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为950g/kg，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为800g/kg)中固定2h，而后用无离子水冲洗；固定的花丝用1.0g/kg苯胺蓝在乳酸乙氧基苯胺(体积比为1:1:1:1:的乳酸、石炭酸、甘油和水)中染色90min，染色的花丝在400g/kg乳酸水溶液中脱色，脱色时间与染色相同，样品用无离子水冲洗，再在800g/kg水溶液乳酸中固定，24h后在光学显微镜下检验。

⑤显微镜下检验：在光学显微镜下检验，组织呈现蓝色表明花丝中存在花粉管，统计花丝中存在花粉管的比率，结果以％表示，即为花丝活力。花丝活力＝花丝中存在花粉管的花丝数/花丝总数×100。

技术应用效果：采用本发明提供的测定方法，不但能够准确判断干旱胁迫条件下玉米花丝活力，而且可以及时采取相应的抗旱应变措施，提高玉米的抗旱性。与不采取任何措施的对照相比，可使玉米叶片相对含水量较对照提高6～9％，气孔阻力增加16～38％，蒸腾速率下降15～40％，从而增强了叶片的保水能力，增强玉米授粉、受精及最终籽粒产量形成能力。单株粒重较对照提高8～18％、百粒重提高16～30％、最终产量较对照增加7～13％。这表明干旱胁迫条件下玉米花丝活力测定方法的运用，可及时采取抗旱应变措施，增强了玉米的抗旱性，维持或提高了干早胁迫下玉米的生产能力，提高了玉米的产量。

实施例2：

在中国吉林省白城市农业科学院农业试验基地进行了试验。

①玉米雌穗顶部花丝可见、雄穗散粉初期发生干旱，进行玉米花丝活力测定。

②雌穗套袋处理：在玉米雌穗伸出3～5cm时进行套袋处理，防止花丝自由受粉。

③花丝人工授粉：用正常供水株的花粉给干旱胁迫条件下吐丝第6天的花丝进行人工饱和授粉，保证每条花丝均有机会授粉。

④花丝固定染色：考查干旱胁迫株的花丝中存在花粉管的比率，对人工授粉后的花丝每隔4小时取样一次。花丝在第一固定用试剂(乙醇水溶液和乳酸水溶液的体积比为2:1，所述乙醇水溶液中乙醇的质量浓度为950g/kg，所述乳酸水溶液中乳酸的质量浓度为800g/kg)固定2h，而后用无离子水冲洗；固定的花丝用1.0g/kg苯胺蓝在乳酸乙氧基苯胺(体积比为1:1:1:1:的乳酸、石炭酸、甘油和水)中染色90min，染色的花丝在400g/kg乳酸水溶液中脱色，脱色时间与染色相同，样品用无离子水冲洗，再在800g/kg乳酸水溶液中固定，24h后在光学显微镜下检验。

⑤显微镜下检验：在光学显微镜下检验，组织呈现蓝色表明花丝中存在花粉管，统计花丝中存在花粉管的比率，结果以％表示，即为花丝活力。花丝活力＝花丝中存在花粉管的花丝数/花丝总数×100。

技术应用效果：采用本发明测定方法，不但能够准确判断干旱胁迫程度，而且可以及时采取叶面喷施抗旱剂等抗旱应变措施，提高玉米的抗早性。与不采取任何措施的对照相比，可使玉米叶片相对含水量较对照提高6～8％，气孔阻力增加17～37％，蒸腾速率下降15～38％，从而增强了叶片的保水能力，增强玉米授粉、受精及最终籽粒产量形成能力。单株粒重较对照提高9～17％、百粒重提高17～29％、最终产量较对照增加9～12％。这表明干旱胁迫条件下玉米花丝活力测定方法的运用，可及时采取抗旱应变措施，增强了玉米的抗旱性，维持或提高了干早胁迫下玉米的生产能力，提高了玉米的产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。