lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用

技术领域

本发明属于医药生物学技术领域，涉及lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用。

背景技术

膀胱癌是泌尿生殖系统中常见恶性肿瘤之一。据全球癌症最新统计显示，2018年世界范围内新增膀胱癌549,393例，死亡199,922例，其中男性膀胱癌发病率和死亡率分别为9.6/10万和3.2/10万，约为女性发病率的4倍（2.4/10万）和死亡率的3.6倍（0.9/10万）。在我国，因烟草消费的增加、职业防护的不完善以及人口老龄化的日益加速，膀胱癌的发病率与死亡率逐年递增，截至2015年，膀胱癌已成为我国泌尿生殖系统发病率与死亡率最高的恶性肿瘤。膀胱癌的早期症状不典型，约75%的患者就诊时被确诊为非肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌是依据肿瘤是否浸润至肌层而区分出的两类膀胱癌，两者的生物学特性、临床治疗和预后情况存在明显差异。非肌层浸润性膀胱癌的临床分期包括原位癌、非浸润性乳头癌和浸润粘膜固有层膀胱癌，临床首选经尿道膀胱肿瘤切除术（TUR-BT）治疗，但约45%患者单用TUR-BT治疗后1年内出现复发，6%-17%患者进展为肌层浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌恶性程度高，疾病进展快，虽针对性采取根治性膀胱切除术辅以盆腔淋巴结清扫，但术后五年生存率仅为23%-46%。尽管近年来医疗技术飞速发展，但膀胱癌患者仍需面对高昂的治疗费用和定期随访观察，这给患者及其整个家庭带来了沉重的精神负担与经济压力。因此，寻找高效的新型肿瘤治疗靶点对膀胱癌的精准诊疗具有重要的指导意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的无明显蛋白编码潜能的转录本。大量证据表明lncRNAs可以从表观遗传、转录及翻译后修饰等层面调节基因的表达，直接或间接影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为。近年来，研究人员发现膀胱癌的发生发展受内在动态复杂的生物分子网络调控，lncRNAs在其中也发挥着关键作用。尿路上皮癌胚抗原（urothelial carcinoma antigen,UCA1）是膀胱癌恶性进展中的重要lncRNAs之一，研究发现UCA1可通过激活PI3K/AKT信号通路以促进CREB的表达及磷酸化，进而驱动癌细胞的细胞周期进程。Lin等研究显示lncRNALBCS能够结合并募集hnRNPK和EZH2至干性基因Sox2的启动子区域，通过调节该区域H3K27me3修饰水平而抑制Sox2的表达，该研究揭示了lncRNA LBCS在维持膀胱癌细胞干性中的重要作用。尽管部分lncRNA在膀胱癌恶性进展中的功能已被报道，但仍有许多lncRNA的功能机制及其在临床治疗中的价值尚不明确。

发明内容

本发明针对传统膀胱癌发病率、死亡率高且早期症状不明显、治疗后复发率高、患者生存率低等问题提出一种新型的lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明提出一种新型膀胱癌治疗靶标lncRNA RP11-394O4.6，其核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示。

作为优选方案，通过qRT-PCR检测lncRNA RP11-394O4.6时使用的引物序列如下。

用于检测lncRNA RP11-394O4.6的引物序列SEQ ID N0:2和3如下：

SEQ ID N0:2 F: 5’-AATATCCCAAAAGGGCTCCCC-3’

SEQ ID N0:3 R: 5’-AAGAGGTCACTGGGGCTAGA-3’

用于检测GAPDH（内参）的引物如下：

F: 5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’

R: 5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’。

本发明提供检测lncRNA RP11-394O4.6表达水平的引物，通过qRT-PCR可定量检测所述lncRNA在组织和细胞中的表达水平。

本发明提出lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用。

本发明还提出能够上调lncRNA RP11-394O4.6表达的过表达质粒，即在载体pLenti CWV-MCS-EF1α-ZsGreen1-PKG-Puro中连接SEQ ID N0:1所示的lncRNA RP11-394O4.6。

能够上调lncRNA RP11-394O4.6表达的物质在如下（a）-（c）至少一种中的应用：（a）抑制膀胱癌细胞增殖；（b）抑制膀胱癌细胞迁移；（c）抑制膀胱癌细胞侵袭。

针对的膀胱癌细胞为5637细胞和J82细胞。

本发明采用RTCA实时无标记细胞分析系统检测上调lncRNA RP11-394O4.6表达对膀胱癌细胞增殖的影响，采用Transwell实验检测上调lncRNA RP11-394O4.6表达对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明针对传统膀胱癌发病率、死亡率高且早期症状不明显、治疗后复发率高、患者生存率低等问题提出了一种新型lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用，是膀胱癌治疗和检测的新思路。Transwell迁移实验表明过表达lncRNA RP11-394O4.6后，5637细胞和J82细胞的迁移、侵袭能力能力显著下降。

附图说明

图1为lncRNA RP11-394O4.6在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的表达。

图2为lncRNA RP11-394O4.6在膀胱癌各细胞系中的表达。

图3为lncRNA RP11-394O4.6在膀胱癌细胞中的过表达效率。

图4为过表达lncRNA RP11-394O4.6抑制膀胱癌细胞的增殖能力的影响。A为5637细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6的增殖曲线；B为J82细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6的增殖曲线。

图5为过表达lncRNA RP11-394O4.6抑制膀胱癌细胞的迁移能力的影响。A为5637细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6细胞迁移能力；B为J82细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6细胞迁移能力。

图6为过表达lncRNA RP11-394O4.6抑制膀胱癌细胞的侵袭能力的影响。A为5637细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6细胞侵袭能力；B为J82细胞过表达lncRNA RP11-394O4.6细胞侵袭能力。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1. lncRNA RP11-394O4.6在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的表达

1)样本收集：收集膀胱癌及对应癌旁新鲜组织，样本收集标准为：①病理学检查确诊为膀胱癌；②未合并其他恶性肿瘤或疾病；③术前未接受任何放化疗等治疗；④经随访具有确定的预后信息。将术后组织用预冷的PBS清洗组织表面残余血液，在冰上分装，迅速置于液氮速冻30min，-80℃超低温冰箱中保存。

2）组织RNA制备及定量分析：将组织用去酶眼科剪剪碎，加入1000μl Trizol试剂，使用组织破碎仪裂解组织，室温静置10分钟；加入200 μl氯仿，涡旋10秒，室温静置3分钟，4℃ 12000 g离心15分钟；吸取400 μl上清液并加入400 μl预冷异丙醇，室温静置15分钟，4℃ 2000 g离心10分钟；1 ml无水乙醇洗涤沉淀，4℃条件下7500 g离心10分钟；晾干，加入10 μl DEPC水溶解RNA沉淀。采用PrimeScript™ RT试剂盒逆转细胞RNA为cDNA。应用CFX96Real-Time PCR检测系统，以上述cDNA为模板，按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行qRT-PCR。

用于检测lncRNA RP11-394O4.6的引物序列SEQ ID N0:2和3如下：

SEQ ID N0:2 F: 5’-AATATCCCAAAAGGGCTCCCC-3’

SEQ ID N0:3 R: 5’-AAGAGGTCACTGGGGCTAGA-3’

用于检测GAPDH（内参）的引物如下：

F: 5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’

R: 5’-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3’

图1所示，lncRNA RP11-394O4.6在膀胱癌组织中的表达水低于癌旁正常组织，且差异具有统计学意义（P<0.05）。

实施例2. lncRNA RP11-394O4.6的细胞表达谱分析

采用正常尿路上皮细胞系（SV-HUC）和人膀胱癌细胞系（T24、5637、J82、UM-UC-3和RT4），所有细胞系均购自中国科学院细胞库。使用胰酶将处在对数生长期的细胞进行消化处理，采用RNA fast 2000试剂盒（购自上海飞捷生物技术有限公司）提取细胞RNA：向细胞沉淀中加入RA2液500 μl，混匀后室温条件下13000转离心1分钟；弃去外套管废液，向内套管中加入500 μl洗液，室温条件下13000转离心1分钟，重复一次；弃去外套管废液，室温条件下13000转离心1分钟；弃去外套管废液，向内套管的膜中央加入洗脱液25 μl，室温静置1分钟，13000转离心1分钟，弃内套管，1.5 ml去酶管内所得液体即为RNA样本。采用PrimeScript™ RT试剂盒逆转细胞RNA为cDNA。应用CFX96 Real-Time PCR检测系统，以上述cDNA为模板，按照TB GreenTM Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行qRT-PCR。用于检测lncRNA RP11-394O4.6的引物序列SEQ ID N0:2/3和用于检测GAPDH（内参）的引物如实施例1

图2所示，lncRNA RP11-394O4.6在5637、J82、T24、UM-UC-3和RT4的表达水平均低于SV-HUC，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。

实施例3. 建立lncRNA RP11-394O4.6过表达细胞系

将lncRNA RP11-394O4.6过表达质粒和空载体质粒分别采用lipo2000转染5637和J82细胞，培养48小时后，利用qRT-PCR检测lncRNA RP11-394O4.6的过表达效率。lncRNA RP11-394O4.6过表达质粒以pLenti CWV-MCS-EF1α-ZsGreen1-PKG-Puro为载体（购自领恪（上海）生物科技有限公司），连接lncRNA RP11-394O4.6全长序列：TCATATCTTACTCAAGTTTAATATCCCAAAAGGGCTCCCCATTGCCCTCAGGCTGAATTCTGAAGCCCTTCCCAAAGCCTGCGAGGGTCTGCCGCATCTAGCCCCAGTGACCTCTTCCTCTTGGGCTACAGCTCATAGATGTCCTTCCATTCTCCTAGGGAGCCCTGTGCCCACCCACTTCGGGCTCCCAGGGACTGTGCTGCTCCCCGTCACTCTCCCTGCCCATCTCTTCCTCCTGTGCTAGGTCTCTAATCAAGTGGCCACTCTGGGAAACCCTCCTTGACTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGACACAACAGAATGGAAAGCGAATTGACAGGGAGCATTCTGTTGTGGAATGGATCAGTTGCTCCCTGTGAATTTGCTTTCAGTCCTATTTACCGTGGGGTACAAAGCCTCAGTTTG。

如图3所示，在5637和J82细胞中，lncRNA RP11-394O4.6过表达组中所述lncRNA的表达水平较空载体对照组显著升高。该结果表明转染所述lncRNA过表达质粒对lncRNARP11-394O4.6上调效果明显。

实施例4. 过表达lncRNA RP11-394O4.6对膀胱癌细胞增殖能力的影响

将lncRNA RP11-394O4.6过表达质粒和空载体质粒分别采用lipo2000转染5637和J82细胞，培养48小时后，采用RTCA实时无标记细胞分析系统检测不同处理组细胞的增殖曲线，具体操作如下：将各组细胞调整浓度至5*10

如图4所示，在5637和J82细胞中，lncRNA RP11-394O4.6过表达组中细胞增殖能力较空载体对照组显著增强。该结果表明上调lncRNA的表达可促进膀胱癌细胞的增殖能力。

实施例5. 过表达lncRNA RP11-394O4.6对膀胱癌细胞迁移能力的影响

将lncRNA RP11-394O4.6过表达质粒和空载体质粒分别采用lipo2000转染5637和J82细胞，培养48小时后，采用Transwell迁移实验检测不同处理组细胞的迁移表型。具体操作如下：用无血清培养基重悬各处理组细胞沉淀并制备成单细胞悬液，按照700 μl/孔，将含20%血清的培养基加入24孔板内各孔；将Transwell小室放入24孔板，并按照200 μl/孔，将混合均匀的细胞悬液加入Transwell小室的上室；将24孔板置于细胞培养箱中培养适宜的时间；夹出小室，PBS冲洗2次；向小室的上室和下室加入800 μl甲醇，固定30分钟；弃去甲醇，加入800 μl吉姆萨染液，染色30分钟；去除上残余染液，使用中性树脂进行封片，显微镜下拍照并分析。

图5所示，Transwell迁移实验表明过表达lncRNA RP11-394O4.6后，5637细胞和J82细胞的迁移能力显著下降。

实施例6. 过表达lncRNA RP11-394O4.6对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

将lncRNA RP11-394O4.6过表达质粒和空载体质粒分别采用lipo2000转染5637和J82细胞，培养48小时后，采用Transwell侵袭实验检测不同处理组细胞的侵袭表型。实验步骤与迁移实验基本相同，两者差别在于侵袭实验需要Matrigel基质胶存在。铺胶方法如下：将-20℃分装的基质胶取出并于4℃融化。按1：8的比例，用预冷的无血清培养基稀释基质胶，按60 μl/孔包被Transwell小室膜的上室面，将小室置于24孔板并在细胞培养箱中孵育过夜使完全凝固。其余步骤同迁移实验。

图5、图6所示，Transwell迁移实验表明过表达lncRNA RP11-394O4.6后，5637细胞和J82细胞的侵袭能力显著下降。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> lncRNA RP11-394O4.6在抑制膀胱癌细胞生物学功能中的应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcatatctta ctcaagttta atatcccaaa agggctcccc attgccctca ggctgaattc 60

tgaagccctt cccaaagcct gcgagggtct gccgcatcta gccccagtga cctcttcctc 120

ttgggctaca gctcatagat gtccttccat tctcctaggg agccctgtgc ccacccactt 180

cgggctccca gggactgtgc tgctccccgt cactctccct gcccatctct tcctcctgtg 240

ctaggtctct aatcaagtgg ccactctggg aaaccctcct tgactttttt ttttttttga 300

gacagagaca caacagaatg gaaagcgaat tgacagggag cattctgttg tggaatggat 360

cagttgctcc ctgtgaattt gctttcagtc ctatttaccg tggggtacaa agcctcagtt 420

tg 422

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acccactcct ccacctttga c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgttgctgta gccaaattcg tt 22