基于耐药基因MecA检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于耐药基因MecA检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法。

背景技术

凝固酶阴性葡萄球菌(Cpagulase negative staphylococcus,CNS)如表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌等属于人体的正常菌群，我们人体体表及腔道都可存在，通常较少引起感染。然而，当机体免疫力低下，CNS菌群易位进入非正常部位时，可成为感染性病原菌。由于各类高档抗生素的广泛应用，临床介入诊疗操作的增多，CNS已成为院内感染的重要病原菌，可导致各种侵袭性感染

近年来，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)分离率持续增高，已成为全球面对的公共卫生问题。全国细菌耐药监测网(CARSS)统计分析，2018年度MRCNS全国平均检出率为75.7％，我省高达78.2％。南通大学附属医院2019年度共检出CNS 591株，其中MRCNS分离率为72.3％。耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)耐药主要通过MecA基因编码低亲和力青霉素结合蛋白，从而导致对所有对β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢菌素类(头孢洛林除外)及碳青霉烯类药物耐药。携带mecA基因的葡萄球菌常常连锁携带对其他药物的耐药基因，所以导致了MRS的高耐药率。因此，需高度重视MRS在临床上的耐药情况及相关耐药机制，CARSS及江苏省细菌耐药监测网均将其列为重点监测点之一。

正确掌握MRS的鉴定和耐药分析技术，对临床耐药具有重要意义，且可为全国细菌耐药监测提供准确的数据。MRS常规检测方法有表型检测法、基因检测法、蛋白检测法。目前，临床微生物实验室多采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的头孢西丁纸片扩散法或者苯唑西林最低抑菌浓度法。Naccache等研究发现，在适宜的条件下，如选择合适的抗生素、培养温度、菌液浓度等条件下，运用表型法检测MRSA与金标准基因法检测MecA基因有较高的符合率。然而对于CNS，运用表型法来检测MRS，会出现假性增高的现象

早在20世纪九十年代，众多学者即运用PCR技术来检测mec A基因。通常可根据mecA基因的靶序列设计引物或探针，再提取检测菌的基因组DNA，摸索并优化扩增条件，PCR扩增后产物行琼脂糖凝胶电泳观察产物。PCR具有较高的灵敏度，常被作为MRS检测的“金标准”。随着分子生物学技术的发展，研究者们不断改善检测mecA基因的PCR方法，如采用多重PCR、实时荧光定量PCR等检测分离菌的耐药基因，目前已有技术可采用临床标本对其直接进行检测

发明内容

本发明的目的在于以MecA基因为靶序列设计引物，运用探针技术，建立了一种有效检测MRS的荧光PCR法，并就其灵敏度、特异性和重复性进行临床评价，获得具有较高敏感性、特异性、经济性的方法，满足临床对MRS检测的精准需求。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的检测方法，包括：

S1：设计引物与探针；

S2：抽提标本中的基因组DNA；

S3：实时荧光PCR进行检测；

所述引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

应当理解，本发明中的方法并不限于上述步骤，在S1之前、S1与S2之间、S2与S3之间，S3之后，本领域技术人员可以根据需要，增加其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。

应当理解，与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列具有90％以上(例如92％、95％和98％等)同源性，且功能相同的序列均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述探针为TaqMan荧光探针。

应当理解，与SEQ ID NO：3序列具有90％以上(例如92％、95％和98％等)同源性，且功能相同的序列均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。

优选的，所述引物浓度为0.25μM/L-1μM/L；更优选的，所述引物浓度为0.5μM/L。

优选的，所述探针浓度为100-300nmol/L；更优选的，所述探针浓度为200nmol/L。

优选的，在S3中，PCR体系中Taq酶的用量为5.0U Taq酶。

优选的，在S3中，PCR体系中退火温度为55℃，退火时间为30s。

优选的，在S3中，PCR反应条件：依次94℃预变性5min；进行35个循环扩增；再72℃延伸7分钟；

其中，所述循环扩增条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s。

本发明第二个方面公开了上述的方法在临床菌种检测中的应用。

优选的，所述菌种为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明通过以MecA基因为靶序列设计引物，运用探针技术，建立了一种新的有效检测MRS的荧光PCR法，并就其灵敏度、特异性和重复性进行临床评价，证实该方法具有较高的敏感性、特异性和重复性，且该方法具有经济性，能够实现临床对MRS检测的精准需求。

附图说明

图1为本发明实施例中PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例中PCR产物双向测序图(BioEdit Sequence AlignmentEditor软件分析后部分片段截图)。

图3为本发明实施例中MecA基因PCR扩增曲线图。

图4为本发明实施例中MecA基因PCR溶解曲线图。

图5为本发明实施例中实时荧光PCR检测MecA基因的灵敏度的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1

本实施例的设计思路如下：

一、根据MecA基因序列以及探针的设计原则合成引物和探针，建立一种有效检测MRS菌株的实时荧光定量PCR法；

二、对建立的PCR方法进行优化(PCR反应体系及反应条件)；

三、对建立的方法进行临床应用评价(灵敏度和重复性试验)。

具体的，本发明的技术方案如下：

1、引物与探针的设计

从Genebank中查找MecA基因序列，运用MegAlign软件分析该序列，设计引物和探针(如表1所示)，TaqMan荧光探针5’端均标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。引物与探针由Invitrogen公司合成。

表1引物和探针序列

2、基因组DNA抽提

共收集2018年南通大学附属医院各类标本中分离的MRCNS临床分离株共40株，设置ATCC 25923为阴性对照，ATCC 43300为阳性对照。取活化后的分离菌株4区划线接种在血平板上，35℃，补充5％CO

3、实时荧光PCR检测

PCR反应条件：94℃预变性5min,而后进行35个循环扩增(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s)，随后72℃延伸7分钟，ABI 7500于每个循环退火温度下收集荧光，运行程序结束后由仪器自带软件分析处理数据。

4、PCR体系和条件的优化

4.1引物浓度

PCR反应体系中，引物是PCR特异性反应的关键。引物浓度过低，会降低PCR扩增的产率；而引物浓度过高则会诱发错配，从而出现非特异性扩增。故设置了0.25、0.5、0.75及1.0μM/L 4个浓度进行优化，上下游引物浓度一致。

4.2荧光探针的浓度

适宜的探针浓度可明显提高检测的灵敏度，本研究共设置了100、150、200、300nmol/L4个浓度进行优化。

4.3 Taq酶的用量

适当增加Taq酶的用量，可提高PCR扩增效率，但过高可能导致非特异性条带的产生。比较了1.0、2.0、2.5、5.0U/体系时的扩增效率，选择最佳浓度。

4.4 PCR退火温度

变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。退火温度一般取决于引物的长度、碱基组成及其浓度、靶基序列的长度。退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。因此，在Tm值附近选择退火温度，共设定了56、55、54及53℃4个温度进行实验。

4.5 PCR退火时间

退火时间对PCR产物的稳定性有较大影响，故选择了10、20、30、40s 4个时间进行比较，确定最佳退火时间。

5、评估所建立的荧光定量PCR方法

5.1灵敏度实验

以ATCC 43300基因组DNA为模板构建MecA基因重组质粒，用TE倍比稀释，配制浓度为10

5.2重复性实验

选择1×10

6、临床样本检测

对收集的40株临床分离菌进行PCR扩增，检测MecA基因。每次实验需设立阳性、阴性及无模板对照。

7、结果评价

7.1 PCR体系和条件的优化

当引物浓度为0.25μM/L时，扩增效率变差，当引物浓度为0.5μM/L时，扩增效率稳定且无非特异性扩增；当TaqMan探针浓度为200nmol/L时，PCR扩增荧光强度值最高，且Ct值较小；Taq酶的用量对PCR的扩增效率有较大影响，当每个体系中加入5.0U Taq酶，扩增效率较高；选择退火温度为55℃，退火时间为30s，PCR扩增效率较高，且结果稳定。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，并送公司测序验证扩增产物为目的基因(实验结果如图1-4所示)。

7.2灵敏度分析

5个稀释浓度参考样品均呈阳性反应，且在参考样品10

7.3重复性分析

1×10

7.4临床样本检测

对临床收集的40株CNS进行MecA基因型检测，其中运用表型法苯唑西林最低抑菌浓度法(VITEK 2COMPACT测定)均鉴定为MRCNS，其中仅有21株MecA基因阳性。

综上所述，近年来，MRCNS是引起医院相关性感染的重要病原菌之一，分离率持高不下，世界各地也相继报道了MRCNS所致的严重院内感染，形式极其严峻。MRCNS除了含有MecA耐药基因，常常连锁携带对其他药物的耐药基因，造成对多种抗菌药物耐药，给临床治疗带来严重的压力

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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