透明质酸-氨基酸接枝物、其制备方法及含有其的免疫增强制剂

技术领域

本发明属于药品、保健品技术领域，具体涉及一种透明质酸-氨基酸接枝物、其制备方法及含有其的免疫增强制剂。

背景技术

免疫系统在人体内主要起着生理防御、自身稳定和免疫监视的作用，是人体抵御病原菌侵犯最重要的保卫系统。免疫功能一旦低下，就极易招致细菌、病毒、真菌的感染，最直接的表现就是容易生病。

目前市场上提高免疫力的产品五花八门，如免疫调节剂、提高免疫力的保健品等，但都存在一定的问题。免疫调节剂对人体具有副作用，而且长时间服用机体会产生抗药性；提高免疫力的保健品经国家食品药品监督管理局获批的就有一千多种，包括螺旋藻、复合维生素、蜂胶、维生素C、蛋白粉、大蒜素等，虽然种类繁多，但是见效慢、效果不明显等问题普遍存在。

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是机体内第一营养要素，具有养肝护肝、提高免疫力、增强记忆力等功效。然而氨基酸含有游离氨基，在空气中容易被氧化变色，大都需要密封保存，限制了氨基酸的应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种透明质酸-氨基酸接枝物及其制备方法，以及包含本发明所述的透明质酸-氨基酸接枝物的免疫增强制剂。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种透明质酸-氨基酸接枝物，其特征在于，所述接枝物由第一透明质酸和氨基酸结合得到。

2、根据项1所述的透明质酸-氨基酸接枝物，其特征在于，所述第一透明质酸的分子量为50万-100万Da。

3、根据项1或2所述的透明质酸-氨基酸接枝物，其特征在于，所述氨基酸选自精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上，优选为苏氨酸、组氨酸、谷氨酸中的一种或两种以上。

4、一种透明质酸-氨基酸接枝物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

将第一透明质酸溶于水，并与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和羟基苯并三唑反应得到羧基活化的透明质酸水溶液；将所述羧基活化的透明质酸水溶液与氨基酸进行反应得到反应液；

将所述反应液超声、透析、冷冻干燥得到透明质酸-氨基酸接枝物。

5、根据项4所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸与所述第一透明质酸的摩尔比为0.5-4:1，优选为2:1。

6、根据项4或5所述的制备方法，其特征在于，所述第一透明质酸的分子量为50万-100万Da。

7、根据项4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸选自精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上，优选为苏氨酸、组氨酸、谷氨酸中的一种或两种以上。

8、一种含透明质酸的免疫增强制剂，其特征在于，所述免疫增强制剂包含第二透明质酸和项1-3任一项所述的透明质酸-氨基酸接枝物。

9、根据项8所述的免疫增强制剂，其特征在于，所述透明质酸-氨基酸接枝物与所述第二透明质酸的质量比为1-5:1。

10、根据项8或9所述的免疫增强制剂，其特征在于，所述第二透明质酸由低分子透明质酸和高分子透明质酸组成，所述低分子透明质酸的分子量为5万-50万Da，优选为10万-25万Da，所述高分子透明质酸的分子量为70万-200万Da，优选为100万-170万Da，所述低分子透明质酸与高分子透明质酸的质量比为1-7:1。

本发明与现有技术相比，本发明的含透明质酸的免疫增强制剂具有以下有益效果：

1、本发明的免疫增强制剂包括透明质酸和透明质酸-氨基酸接枝物，将氨基酸与透明质酸进行接枝，保护了氨基酸的氨基，提高了氨基酸的稳定性，利于其在多种剂型中的添加；

2、本发明中透明质酸-氨基酸接枝物可以保证氨基酸到达小肠被消化吸收，促进功效成分的充分利用；

3、本发明高低分子量透明质酸与氨基酸协同复配，大大提高了氨基酸和透明质酸的免疫力增强功效。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

本发明提供一种透明质酸-氨基酸接枝物，所述接枝物由第一透明质酸和氨基酸结合得到。

其中，透明质酸是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺的双糖单位组成，本身带有负电荷，存在于大部分动物体的软结缔组织中，显示出润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等多种重要的生理功能，尤其是透明质酸特殊的保水作用，广泛应用于医药、化妆品领域。同时透明质酸分子在空间上呈刚性螺旋柱形，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强吸水性，另一方面由于羟基的连续定向排列，又在透明质酸分子链上形成憎水区，使得透明质酸能形成三维网状结构。而且，透明质酸根据其分子量的不同，也表现出不相同的理化性质。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述第一透明质酸的分子量为50万-100万Da，例如可以为50万Da、60万Da、70万Da、80万Da、90万Da、100万Da。

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，是机体内第一营养要素，具有养肝护肝、提高免疫力、增强记忆力等功效。然而氨基酸含有游离氨基，在空气中容易被氧化变色，大都需要密封保存，限制了氨基酸的应用。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述氨基酸选自精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上，优选为苏氨酸、组氨酸、谷氨酸中的一种或两种以上。

将氨基酸与透明质酸进行接枝，可以保护氨基酸的氨基，提高氨基酸的稳定性，利于其在多种剂型中的添加。同时，将氨基酸与透明质酸进行接枝，还可以保护透明质酸不被降解，保持透明质酸的生物活性。

本发明还提供一种透明质酸-氨基酸接枝物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将第一透明质酸溶于水，并与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基苯并三唑(HOBt)反应得到羧基活化的透明质酸水溶液；

将所述羧基活化的透明质酸水溶液与氨基酸进行反应得到反应液；

将所述反应液超声、透析、冷冻干燥得到透明质酸-氨基酸接枝物。

进一步的，第一透明质酸与EDC和HOBt的摩尔比为1:(1-2):(1-2)，例如可以为1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述氨基酸与所述第一透明质酸的摩尔比为0.5-4:1，例如可以为0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1，优选为2:1。

具体的，第一透明质酸溶于水之后得到的透明质酸水溶液的浓度为0.5-5％，例如可以为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％。然后将EDC和HOBt加入到透明质酸水溶液中进行反应。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述第一透明质酸的分子量为50万-100万Da，例如可以为50万Da、60万Da、70万Da、80万Da、90万Da、100万Da。所述氨基酸选自精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或两种以上，优选为苏氨酸、组氨酸、谷氨酸中的一种或两种以上。

其中，超声、透析、冷冻干燥可以采用现有技术中任何的设备或方法。在本发明的一个具体的实施方式中，于20～60℃、200～400W超声处理20～60min。透析操作为将所得的反应液装入透析袋(Mr＝8000～14000D)中，于去离子水中透析22～26h。羧基活化的透明质酸与过量的氨基酸反应，通过透析操作过滤掉未反应的氨基酸，得到透明质酸-氨基酸接枝物。

本发明还提供一种含透明质酸的免疫增强制剂，所述免疫增强制剂包含第二透明质酸和上述的透明质酸-氨基酸接枝物。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述免疫增强制剂中所述透明质酸-氨基酸接枝物与所述第二透明质酸的质量比为1-5:1，例如可以为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1。具体的，将冷冻干燥后得到的透明质酸-氨基酸接枝物粉末与第二透明质酸粉末按照上述质量比进行混合，然后可以根据需要制备成不同的剂型的免疫增强制剂。

在本发明的一个具体的实施方式中，所述第二透明质酸由低分子透明质酸和高分子透明质酸组成，所述低分子透明质酸的分子量为5万-50万Da，例如可以为为5万Da、10万Da、15万Da、20万Da、25万Da、30万Da、35万Da、40万Da、45万Da、50万Da，优选为10万-25万Da，所述高分子透明质酸的分子量为70万-200万Da，例如可以为，优选为100万-170万Da。所述低分子透明质酸与高分子透明质酸的质量比为1-7:1，例如可以为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1。

所述免疫增强制剂为粉剂、颗粒剂、片剂或溶液剂。具体的，粉剂的制备方法如下：将冷冻干燥后得到的透明质酸-氨基酸接枝物粉末与第二透明质酸粉末混合均匀后，过筛，灭菌，即得到粉剂。片剂的制备方法如下：将冷冻干燥后得到的透明质酸-氨基酸接枝物粉末与第二透明质酸粉末混合均匀，喷雾方式加入纯化水，进行湿法制粒，将湿法制粒后的物料进行干燥、灭菌、压片，即得片剂。颗粒剂的制备方法如下：将冷冻干燥后得到的透明质酸-氨基酸接枝物粉末与第二透明质酸粉末混合均匀后，加入辅料，喷雾方式加入纯度75％乙醇，进行湿法制粒，灭菌后即得颗粒剂。溶液剂的制备方法如下：将冷冻干燥后得到的透明质酸-氨基酸接枝物粉末与第二透明质酸粉末加入水中，搅拌使其混合均匀，灭菌后即得溶液剂。

所述免疫增强制剂还包括药学上可接受的辅料。所述辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂中的一种或多种；其中：

所述填充剂是指用来填充片剂的重量或体积的物质，从而便于压片。所述的填充剂选自淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素中的一种或两种以上的混合；

所述粘合剂是指某些药物粉末本身不具有黏性或黏性较小，需要加入淀粉浆等黏性物质，使其粘合。所述粘合剂选自纯水、乙醇、羟丙基甲基纤维素、淀粉浆、羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上的混合；

所述的崩解剂是指除了缓(控)释片以及某些特殊作用的片剂以外，一般的片剂中都应加入崩解剂。所述崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠中的一种或两种混合；

所述润滑剂是指助流剂、抗粘剂和润滑剂的总称。所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸镁、微粉硅胶中的一种或两种以上的混合。

本发明制备的免疫增强制剂具有很好的稳定性，尤其是实施例1-6，90天加速稳定性考察的氨基酸减少率均低于0.33％，相比于对比例1-2稳定性提高10倍左右，这说明透明质酸-氨基酸接枝物能显著提高氨基酸的稳定性；通过免疫力测试发现，本发明实施例制备的免疫增强制剂可以很好的提高小鼠巨噬细胞增殖能力、吞噬能力以及分泌炎性因子的能力，从而增强机体的免疫力；将本发明制备的样品施用于人体后，一个月后免疫力改善效果显著，达到80％，相比如对比例提高了4倍。说明本发明实施例制备的免疫增强制剂具有很好的增强免疫力的效果。

实施例

实施例1

(一)制备透明质酸-氨基酸接枝物

(1)将30g透明质酸(70万Da)(称为第一透明质酸)溶于1000mL去离子水中，再加入30g EDC、30g HOBt后磁力搅拌混合，从而活化透明质酸的羧基；

(2)将上述溶液中加入30g组氨酸，使得组氨酸与第一透明质酸的摩尔比为2:1。磁力搅拌反应2-3h，于40℃、300W超声处理40min，将所得的反应液装入透析袋(Mr＝8000-14000D)中，于去离子水中透析22-26h，将截留液进行冷冻干燥，得到透明质酸-氨基酸接枝物。

(二)制备免疫增强制剂

将5g高分子量透明质酸(150万Da)、20g低分子量透明质酸(15万Da)、75g步骤(一)中制备的透明质酸-氨基酸接枝物混合均匀，过60目泰勒标准筛获得均匀粉状的物料，将物料采用紫外线灭菌30min，得粉剂即为免疫增强制剂。

实施例2-9

实施例2-9与实施例1的不同之处在于氨基酸种类、第一透明质酸分子量、含量、第二透明质酸的分子量、含量不同，具体如表1所示。

对比例1-2

对比例1仅为透明质酸-氨基酸接枝物，不与第二透明质酸混合。即与实施例1中步骤(一)相同，具体如表1所示。

对比例2为普通未经透明质酸修饰的组氨酸与第二透明质酸混合得到的制剂。与实施例1的不同在于，不进行步骤(一)透明质酸-氨基酸接枝物的制备，直接进行步骤(二)，并使用普通组氨酸代替透明质酸-氨基酸接枝物，具体如表1所示。

表1各实施例和对比例中各组分的含量

验证例1稳定性试验

将本发明实施例和对比例制备得到的免疫增强制剂样品进行加速稳定性考察(40℃±2℃，RH75％±5％)，从感官指标性能和功效成分含量两个方面进行考察。

1感官性能评价

分别在第1天、第30天、第60天、第90天分别观察有无性状改变，具体结果如表2。

表2各实施例和对比例制备的样品的感官性能评价结果

本发明实施例和对比例制备的剂型呈白色粉末状态，若保存期间出现粉末变黄、结块等性状变化说明稳定性较差。本发明实施例制备的免疫增强制剂具有很好的稳定性，加速稳定性考察60天性状未发生改变，尤其是实施例1-6稳定性最佳，加速稳定性考察90天性状未见改变。对比例制备的免疫增强制剂加速稳定性考察60天出现明显性状改变，产品颜色变黄，吸湿结块。

2氨基酸含量变化测定

2.1样品制备

取实施例1-11、对比例1-2的粉剂各100mg，溶于10mL水中。

2.2实验方法

将上述样品液进行加速稳定性考察(40℃±2℃，RH75％±5％)，测定不同时间氨基酸的减少率。

分别在第1天、第30天、第60天、第90天各取样品液1mL，加入2mol/L的醋酸缓冲液(pH＝5.4)1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD

氨基酸减少率＝(第N天OD

表3各实施例和对比例制备的样品的氨基酸减少率结果

本发明实施例制备的免疫增强制剂具有很好的稳定性，加速稳定性考察90天氨基酸减少率均较低，说明氨基酸保存稳定，损耗少，尤其是实施例1-6，90天加速稳定性考察的氨基酸减少率均低于0.33％。对比例只含透明质酸-氨基酸接枝物或以未接枝状态的氨基酸代替接枝氨基酸，制剂的稳定性均下降明显，90天加速稳定性考察的氨基酸减少率达到2.26％和3.78％，相比于实施例1-6，稳定性降低10倍左右。

验证例2免疫力试验

巨噬细胞在免疫系统中通过吞噬病原体以及提呈抗原来释放细胞因子参与免疫反应的各个阶段，在机体免疫系统中占有非常重要的地位。RAW264.7小鼠巨噬细胞是应用于研究免疫增强作用较好的细胞模型。

1实验方法

1.1细胞增殖实验

1)铺板：取对数生长期小鼠巨噬细胞Raw，以2×10

2)样品溶液配制：实施例1-11、对比例1-2的样品以无血清培养液配成0.05％浓度的储备液，并用0.22μm滤膜过滤除菌。

3)加药：常规培养24h后，弃去旧培养液，实验组换成100μL样品，阴性对照组(control)加入等量无血清培养液。每个样品6个平行孔，继续培养24h。

4)细胞相对增值率测定：采用WST-1法检测细胞相对增殖率，弃去旧培养液，每孔加入100μL用PBS稀释了10倍的WST-1工作液，放入细胞培养箱中继续孵育2h，于450nm波长处用酶标仪测定吸光度，相对增殖率(RGR)为实验组吸光度与阴性对照组吸光度的比值。结果如表4。

1.2巨噬细胞吞噬能力

1)铺板：取对数生长期小鼠巨噬细胞Raw，以5×10

2)样品溶液配制：实施例1-11、对比例1-2的样品以无血清培养液配成0.05％浓度的储备液，并用0.22μm滤膜过滤除菌。

3)加药：常规培养24h后，弃去旧培养液，实验组换成100μL样品，阴性对照组(control)加入等量无血清培养液。每个样品6个平行孔，继续培养24h。

4)巨噬细胞吞噬能力(中性红摄取试验)：细胞染色前用PBS洗2次，加入1.0％的中性红染液(PBS配制)处理细胞30分钟。将中性红吸出，用PBS洗2次。显微镜下观察细胞状态，细胞内应看到暗红色膜泡，加入裂解液570nm波长处测定吸光度值，吸光度相对值为实验组吸光度与阴性对照组吸光度的比值。结果如表5。

1.3细胞因子分泌能力

1)铺板：取对数生长期小鼠巨噬细胞Raw，以5×10

2)样品溶液配制：实施例1-11、对比例1-2的样品以无血清培养液配成0.05％浓度的储备液，并用0.22μm滤膜过滤除菌。

3)加药：常规培养24h后，弃去旧培养液，实验组换成2mL样品，阴性对照组(control)加入等量无血清培养液。每个样品6个平行孔，继续培养24h。

4)细胞因子分泌：收集上清并离心，ELISA试剂盒检测细胞分泌因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，实验完成后立即测定450nm波长处的吸光度值，以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的各细胞分泌因子的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，各细胞分泌因子的相对值为实验组浓度与阴性对照组浓度的比值。结果如表6。

2实验结果

表4细胞增殖能力评价结果

表5巨噬细胞吞噬能力评价

表6-1不同样品对巨噬细胞产生TNF-α的影响

表6-2不同样品对巨噬细胞产生IL-6的影响

表6-3不同样品对巨噬细胞产生IL-1β的影响

通过对表4、5、6的数据结果进行比对分析，发现本发明实施例制备的免疫增强制剂可以很好的提高小鼠巨噬细胞的增殖能力、吞噬能力以及分泌炎性因子的能力，从而增强机体的免疫力，尤其以实施例1-6制备的免疫增强制剂对免疫力的提升能力最强。

实施例10、11分别只含有一种分子量的第二透明质酸，其他组分含量相同，但是对巨噬细胞的增殖能力、吞噬能力以及分泌炎性因子的能力表现出不同的效果：第二透明质酸的高、低分子量透明质酸对巨噬细胞吞噬能力和巨噬细胞分泌IL-6能力的作用效果类似，但是对于巨噬细胞增殖能力，高分子量透明质酸的效果却高于低分子量透明质酸，恰恰相反，低分子量透明质酸表现出对TNF-α、IL-1β更好的促分泌作用。

对比例1只含透明质酸-氨基酸接枝物、对比例2选择未经修饰的氨基酸均对制剂的免疫力增强性能产生了影响。

验证例3人体试用试验

公开招募并选择符合纳入标准的志愿者20人，所选取的实验对象既往体健，无其它影响实验研究的疾病。将20名受试者随机分为2组，每组10人，分别饮用实施例1和对比例2的样品。观察志愿者的免疫力改善情况。

饮用方法：每日睡前一小时饮用，10g实验样品温水冲饮，连续饮用一个月，饮用期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

其中，免疫力改善评价标准如表7-1所示，免疫力改善评价结果如表7-2所示。

表7-1免疫力改善评价标准

注：免疫力改善＝(有改善人数+显著改善人数)/总人数×100％

表7-2免疫力改善评价结果

通过上述人体试用试验可知，本发明实施例1制备的样品服用一个月后免疫力改善效果显著，达到80％，对比例2制备的样品服用一个月后的免疫力改善率只有20％。说明本发明实施例制备的免疫增强制剂具有很好的增强免疫力的效果。