检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组和试剂盒及它们的应用

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，具体涉及检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组和试剂盒及它们的应用。

背景技术

中国是全球糖尿病患者第一大国，根据2017年国际糖尿病联盟(IDF)发布的最新糖尿病地图，中国糖尿病人群已达1.14亿，居世界首位，其中糖尿病患者人群中2型糖尿病占到90％以上。糖尿病是一种以血液中的高血糖为基本特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物功能受损，人体若长时间的高血糖，将会导致各种组织特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。

造成糖尿病的原因主要有两个：一是胰岛细胞受损，导致分泌的胰岛素数量不够；二是分泌的胰岛素数量虽然够了，但其生理效果较差，出现了严重的胰岛素抵抗现象，降低了胰岛素对于葡萄糖的利用效率。

国内外指南均明确指出，降糖的同时，应关注心血管高风险因素和并发症。而研究表明，最有效方法就是控制血糖。而当前“千人一药”的治疗方式不能有效的降低血糖，还会加重不良反应。因此能够为高血糖患者提供个性化治疗十分重要。

发明内容

本发明的目的是为高血糖患者提供个性化治疗，从而提供了一种检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组和试剂盒及它们的应用，使用本发明提供的引物组能够为高血糖患者提供个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组，该引物组包括能够扩增下述至少一种高血糖药物代谢相关基因的引物；

CYP2C9基因、KCNJ11基因、PPARγ基因、SLCO1B1基因、SLC22A1基因、SLC22A2基因、APOE基因。

本发明第二面提供如上所述的引物组在制备用于检测高血糖药物代谢相关基因多态性的产品中的应用。

本发明第三面提供一种检测高血糖药物代谢相关基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的引物组。

本发明第四面提供如上所述的引物组和/或如上所述的试剂盒非诊断和治疗目的地在检测高血糖药物代谢相关基因多态性中的应用。

本发明第五面提供一种非诊断和治疗目的地检测高血糖药物代谢相关基因多态性的方法，该方法包括：

(1)使用如上所述的引物组扩增目标DNA样品中CYP2C9基因、KCNJ11基因、PPARγ基因、SLCO1B1基因、SLC22A1基因、SLC22A2基因和APOE基因中的至少一种；

(2)对步骤(1)所获得的扩增产物进行测序，检测以下突变位点中的至少一种，以获得高血糖药物代谢相关基因的多态性；

其中，CYP2C9基因的突变位点为rs1057910，KCNJ11基因的突变位点为rs5219，PPARγ基因的突变位点为rs1801282，SLCO1B1基因的突变位点为521T＞C，SLC22A1基因的突变位点为1222A>G，SLC22A2基因的突变位点为808G＞T，APOE基因的突变位点为rs429358和rs7412。

本发明能够获得如下的技术效果：

(1)通过使用能够扩增选自由CYP2C9基因、KCNJ11基因、PPARγ基因、SLCO1B1基因、SLC22A1基因、SLC22A2基因和APOE基因所组成的组中的高血糖药物代谢相关基因的引物对相应的基因进行扩增，并对扩增产物进行测序，从而检测相应基因，特别是相应基因在特定突变位点的多态性，能够对高血糖患者针对基因的个体差异制定不同的方案，选择合适的降糖药，实现精确分型和精准用药，从而增加降糖效果，降低药物不良反应。

(2)本发明优选的引物组具有较高的灵敏度和特异性，使用本发明优选的引物组对高血糖药物代谢相关基因进行基因分型时，具有定性准确，特异性强等优点。此外，本发明的试剂盒还具有样品处理简单、测序步骤简单、结果分析直观的优点。

(3)在优选使用Sanger测序法检测相应基因的突变位点时，结果分析直观。

附图说明

图1为CYP2C9基因的Sanger法测序图，具体为临床样品CYP2C9(rs1057910)基因野生型的Sanger法测序图。

图2为KCNJ11基因的Sanger法测序图，其中，图2-1、图2-2、图2-3分别为临床样品KCNJ11(rs5219)基因野生、杂合、纯合突变三种型别的Sanger法测序图。

图3为PPARγ基因的Sanger法测序图，其中，图3-1、图3-2分别为临床样品PPARγ(rs1801282)基因野生、杂合两种型别的Sanger法测序图。

图4为SLCO1B1基因的Sanger法测序图，具体为临床样品SLCO1B1(521T＞C)基因野生型的Sanger法测序图。

图5为SLC22A1基因的Sanger法测序图，其中，图5-1、图5-2分别为临床样品SLC22A1(1222A>G)基因野生、杂合两种型别的Sanger法测序图。

图6为SLC22A2基因的Sanger法测序图，图6-1、图6-2分别为临床样品SLC22A2(808G＞T)基因野生、杂合两种型别的Sanger法测序图。

图7为APOE基因的Sanger法测序图，其中，图7-1、图7-2分别为临床样品APOE(rs429358)基因野生、杂合型的Sanger法测序图。

图8为APOE基因的Sanger法测序图，其中，图8-1、图8-2分别为临床样品APOE(rs7412)基因野生、杂合两种型别的Sanger法测序图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组，该引物组包括能够扩增下述至少一种高血糖药物代谢相关基因的引物；

CYP2C9基因、KCNJ11基因、PPARγ基因、SLCO1B1基因、SLC22A1基因、SLC22A2基因、APOE基因。

上述基因与高血糖药物反应之间的具体关系如下：

CYP2C9基因：磺脲类药物是临床应用最早、品种最多、应用最广泛的口服降糖药。该类药物在人体主要经过肝脏的细胞色素P450代谢，而CYP2C9基因是该家族的重要基因之一，它的多态性位点导致磺脲类降糖药的体内代谢过程及引起的不良反应存在显著的个体差异。研究结果表明，CYP2C9*3基因可显著减少CYP2C9酶对格列吡嗪的代谢活性，并可能导致低血糖的发生。其中，CYP2C9*3是CYP2C9基因上的一种多态位点的命名体系，CYP2C9*3对应rs1057910位点。术语“rs1057910”是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。因此，优选的，本发明检测CYP2C9基因的多态性优选检测CYP2C9*3的rs1057910位点(CYP2C9(rs1057910位点))的多态性，以确定该基因在该位点是野生型、杂合型还是纯合突变型。

KCNJ11基因：该基因在胰腺β细胞中通过葡萄糖传感机制中的三磷酸腺苷(ATP)依赖的K

PPARγ基因：研究报道，PPARγ基因P12A(rs1801282)多态性能促进胰岛素抵抗和T2DM，其最小等位基因携带者经罗格列酮和吡格列酮治疗后FPG和Hb A1c值显著降低、疗效更好。PPARγ的效应基因ACDC编码脂联素，脂联素是脂肪细胞分泌的一种循环蛋白，具有胰岛素增敏剂作用。优选的，本发明检测PPARγ基因的多态性优选检测PPARγ基因对应rs1801282(PPARγ(rs1801282))位点的多态性，以确定该基因在该位点是野生型、杂合型还是纯合型。术语“rs1801282”是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。

SLCO1B1基因：他汀类药物是临床使用最广泛的降脂药，对抑制心血管疾病有显著作用。SLCO1B1基因具有遗传多态性，突变型SLCO1B1基因(521T>C，即在该基因521位点处存在单碱基突变，由T突变为C)转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起他汀类药物血药浓度上升，增加横纹肌溶解症或肌病的发生风险，临床药物基因组学实施联盟推荐应根据SLCO1B1基因型调整他汀类药物的剂量。因此，优选的，本发明检测SLCO1B1基因的多态性优选检测SLCO1B1基因在521位点(521T>C)的多态性，以确定该基因在该位点是野生型、杂合型还是纯合突变型。

SLC22A1基因和SLC22A2基因：作为胰岛素增敏剂的二甲双胍可抑制肝糖原的产生，降低肝脏对葡萄糖的吸收和肝糖原的分解，从而达到降糖效果。二甲双胍临床疗效个体差异大，肝脏和肾脏功能显著影响其代谢及排泄。有机阳离子转运体(OCT)属于溶质转运家族(SLC22)，OCT主要包括OCT1、OCT2和OCT3 3个异构体。研究表明，二甲双胍的代谢只与OCT1和OCT2有关。OCT1和OCT2的基因多态性影响二甲双胍的药效。OCT1及OCT2基因多态性改变是导致二甲双胍药动学及药效学个体差异的重要因素。

其中，OCT1对应有机阳离子转运体1(SLC22A1)与肉碱/有机阳离子转运体1(SLC22A4)分别主要位于肝脏和肾脏，而探究SLC22A1的位点1222A>G是二甲双胍药物疗效个体差异的突破点。因此，优选的，本发明检测SLC22A1基因的多态性优选检测SLC22A1基因在1222位点(1222A>G)(SLC22A1(1222A>G))的多态性，以确定该基因在该位点是野生型、杂合型还是纯合型。

OCT2对应有机阳离子转运体2(SLC22A2)，其位点808G＞T(A270S)的变异可降低二甲双胍的摄取。因此，优选的，本发明检测SLC22A2基因的多态性优选检测SLC22A2基因808位点(808G＞T)(SLC22A2(808G＞T))的多态性，以确定该基因在该位点是野生型、杂合型还是纯合型。

APOE基因：糖尿病肾病是糖尿病的主要慢性并发症之一，近年来，有相关研究显示载脂蛋白E(APOE)基因多态性与2型糖尿病肾病的发生发展存在密切关系。其中大多数研究显示APOE2等位基因是发生2型糖尿病肾病的危险因素，而APOE4等位基因是2型糖尿病肾病的保护因素。优选的，本发明检测APOE基因的多态性优选检测APOE对应rs429358位点(APOE(APOE)rs429358)和rs7412位点(APOE(rs7412))的多态性，以确定该基因在这两个位点是野生型、杂合型还是纯合型。术语“rs429358”和“rs7412”分别是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。

根据本发明，在优选检测如上各基因对应位点多态性的情况下，使用表1中的字母组合代表如上基因在对应位点多态性的情况。

表1

根据本发明，本发明的引物组所包括的引物序列能够利用本领域的常规技术，基于本发明的高血糖药物代谢相关基因的DNA序列进行设计，没有特别限定。作为具体的引物序列，优选为表2所示的引物组1～7所包含的引物序列。其中，各基因的DNA序列为本领域技术人员所公知，可在相关的文献以及相应的数据库中获得，例如，CYP2C9基因的登录号可以为NM_000771，具体位点为rs1057910；KCNJ11基因的登录号可以为NM_000525，具体位点为rs5219；PPARγ基因的登录号可以为NM_001330615，具体位点为rs1801282；SLCO1B1基因的登录号可以为NM_006446，具体位点为rs4149056；SLC22A1基因的登录号可以为NM_003057，具体位点为rs628031；SLC22A2基因的登录号可以为NM_003058，具体位点为rs316019；APOE基因的登录号可以为NM_000041，具体位点为rs429358和rs7412。

根据本发明，优选对如上基因中的至少2种基因的多态性进行检测，例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种。最优选的，对如上基因中的7种基因的多态性进行检测。应该清楚的是，在选择2种基因进行检测时，可以有21种组合情况；在选择3种基因进行检测时，可以有35种组合情况；在选择4种基因进行检测时，可以有35种组合情况；在选择5种基因进行检测时，可以有21种组合情况；在选择6种基因进行检测时，可以有7种组合情况。各种组合情况本领域技术人员可以根据简单的统计学知识很容易获得，本文在此不再详细赘述，但应该视为本文已经公开了各种具体的组合情况。

本发明提供的引物组能够扩增上述至少一种基因，扩增后通过测序的方法即可获得如上至少一种基因，优选如上至少一种基因在对应位点的多态性。所述测序的方法可以按照本领域技术人员公知的方法进行，例如，荧光定量PCR，但该方法缺点是引物体系优化时间较长，适用于少量位点且Taqman探针昂贵；基因芯片法，但该方法操作较繁琐，检测周期长；二代测序法，但该方法适合大量样本，需要专业的生物信息解读人员从庞大的数据库中提炼出有用信息；Sanger测序法，可以有效地检测基因突变，结果分析直观，容易发现相关基因中的突变。因此，本发明优选使用Sanger测序法对扩增后的产物(如上至少一种基因)进行测序，以确定如上至少一种基因，优选如上特定位点的多态性。

其中，用于Sanger测序法的测序引物能够利用本领域的常规技术，基于本发明的高血糖药物代谢相关基因的DNA序列进行设计，没有特别限定。优选的，使用表2种的测序引物对扩增后的产物进行测序。

在优选使用本发明特定的扩增引物和测序引物组合的情况下，所述引物组具有较高的灵敏度和特异性，对高血糖药物代谢相关基因进行基因分型时，具有定性准确，特异性强等优点。

表2

根据本发明，所述高血糖药物可以为本领域常规使用的各种用于高血糖患者进行治疗的药物，例如可以选自磺酰脲类、噻唑烷二酮类、氯茴苯酸类和双胍类药中的至少一种。

第二方面，本发明提供了如上所述的引物组在制备用于检测高血糖药物代谢相关基因多态性的产品中的应用。

根据本发明，所述产品可以为组合了各种检测用其它试剂的试剂盒。

第三方面，本发明提供了一种检测高血糖药物代谢相关基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包含阴性对照品和阳性质控品，所述阴性对照品为灭菌蒸馏水，在使用所述试剂盒时，阴性对照要求无扩增，或是扩增的产物不在检测限内，所述阳性质控品为人基因组DNA，所述阳性质控品要求在检测限范围内有效扩增。在阴性对照无扩增，阳性质控品有效扩增的情况下，判定PCR扩增为有效扩增，否则需要重新进行PCR扩增。

此外，所述试剂盒还可以包括用于对目标样本进行PCR扩增的各种试剂，例如，酶，dNTP，以及各种离子，例如镁离子，这些试剂均可以直接商购获得，还可以直接商购获得将各种试剂按照一定的比例混合在一起的mix，例如，Prime

另外，该试剂盒还可以包括用于配制PCR反应体系的灭菌的蒸馏水，所述蒸馏水也可以在进行PCR扩增时，由实验人员现场制备。

第四方面，本发明提供了如上所述的引物组和/或如上所述的试剂盒非诊断和治疗目的地在检测高血糖药物代谢相关基因多态性中的应用。

根据本发明，非诊断和治疗目的研究可以为生命科学领域的基础研究，例如，研究目的基因，优选目的基因的特定位点的多态性与高血糖药物之间的相互作用；药物是如何通过相关基因，特定是特定位点的多态性二发挥作用的；不用国家不同种族的人群在如上基因，特别是如上特点位点上的差异或特点，等等。

第五方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的检测高血糖药物代谢相关基因多态性的方法，该方法包括：

(1)使用如上所述的引物组扩增目标DNA样品中CYP2C9基因、KCNJ11基因、PPARγ基因、SLCO1B1基因、SLC22A1基因、SLC22A2基因和APOE基因中的至少一种；

(2)对步骤(1)所获得的扩增产物进行测序，检测以下突变位点中的至少一种，以获得高血糖药物代谢相关基因的多态性；

其中，CYP2C9基因的突变位点为rs1057910，KCNJ11基因的突变位点为rs5219，PPARγ基因的突变位点为rs1801282，SLCO1B1基因的突变位点为521T＞C，SLC22A1基因的突变位点为1222A>G，SLC22A2基因的突变位点为808G＞T，APOE基因的突变位点为rs429358和rs7412。

优选的，使用如上表2中的测序引物对步骤(1)所获得的扩增产物进行Sanger测序。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

受试者口腔黏膜细胞样本DNA提取试剂盒购自常州百带生物科技股份有限公司，货号51030。

Prime

其他试剂均商购可得。

实施例1

本实施例用于说明目的基因的选择

(1)参考《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南》和FDA明确的药物基因组学相关生物标志物，结合大量的临床研究报道的文献，总结出与口服降糖药物疗效紧密相关的基因及突变位点；

(2)在签署了知情同意书的情况下，采集高血糖患者样本(使用棉拭子蘸取口腔黏膜细胞)，使用试剂盒抽提棉拭子上蘸取的口腔黏膜细胞样本中的DNA；

(3)对步骤1涉及的基因的突变位点进行检测，以基因CYP2C9为例，以提取的人口腔细胞DNA为模板，用相应的上、下游引物(序列1、2)进行PCR上机扩增，对PCR产物进行纯化，之后用对应的测序引物(序列3)进行Sanger测序，并记录检测结果，其他基因按照同样的步骤进行检测；

(4)对步骤3所得的所有检测结果进行统计分析，确定各基因的突变位点的发生频率，去除突变频率过低的位点，初步筛选出与高血糖用药反应性相关的基因突变位点；

(5)对步骤4所筛选的突变位点，在“普瑞昇医学检验实验室”选择高血糖患者志愿者并进行基因型检测，根据各志愿者的检测结果精准制订用药方案，并进行临床跟踪，观察临床用药效果，进一步验证步骤4所筛选出的各基因突变位点对临床指导用药的有效性，去除在实际应用中无意义的突变位点；

(6)最终确定本发明所涉及的目标基因及突变位点。

在上述工作的基础上，本发明最终确定了7个高血糖药物代谢相关基因及其突变位点：CYP2C9基因(突变位点rs1057910)、KCNJ11基因(突变位点rs5219)、PPARγ基因(突变位点rs1801282)、SLCO1B1基因(突变位点521T＞C)、SLC22A1基因(突变位点1222A>G)、SLC22A2基因(突变位点808G＞T)、APOE基因(突变位点rs429358、rs7412)。

实施例2

本实施例用于说明本发明试剂盒组成和使用

1、试剂盒的组成

(1)高血糖药物代谢相关基因的引物：

委托苏州金唯智生物科技有限公司合成表2中的扩增引物和测序引物。

(2)对照品的选择：

以人基因组DNA作为阳性质控品；以灭菌蒸馏水为阴性对照。

(3)PCR反应液：

Prime

2、试剂盒的使用

(1)样本的获得

使用DNA提取试剂盒对取自受试者的棉拭子上蘸取的口腔黏膜细胞样本进行DNA的提取。

(2)样品检测

取出相关试剂，按照表3进行PCR体系的配制。

表3

该体系的PCR反应程序如表4所示。

表4

扩增完成之后，进行琼脂糖凝胶电泳检验PCR扩增产物，将PCR扩增产物使用胶纯化回收试剂盒纯化后进行下一步程序。

(3)Sanger测序

按照Sanger测序标准操作规程进行操作，主要步骤如下：

1)对已纯化的PCR扩增产物进行测序PCR，测序PCR体系如表5所示。

表5

反应参数设置为：96℃1min，(96℃10S、50℃5S、60℃4min)×25个循环；4℃保温。

2)测序产物纯化

具体纯化步骤按照

3)上机测序

使用ABI基因分析仪时，应用ABI公司Data

4)结果判断

质控品测序峰图正常，序列准确，质控品检测结果为阳性；阴性对照品无扩增。

根据表1所示的检测标准进行结果判定，所检测的高血糖患者覆盖到的基因型别对应的测序图如图1～8所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明的引物组和/或试剂盒对高血糖患者的用药指导效果

为了验证本发明的引物组和/或试剂盒对高血糖患者的用药指导效果，在“普瑞昇医学检验实验室”选择高血糖患者志愿者，并签署知情同意书，使用发明的引物组和/或试剂盒按照实施例2的体系和条件进行基因型检测，根据各志愿者的检测结果精准制订其用药方案，并进行临床跟踪，观察临床用药效果。

用药指导例1

检测者李某，检测前服用曲格列酮降糖效果不理想，使用本发明的引物组和/或试剂盒对李某进行高血糖相关基因的检测，检测结果如表6所示，风险评估结果如表7所示，结合报告预期磺酰脲类、氯茴苯酸类和双胍类疗效较好。李某根据医生建议选择二甲双胍3个月后，血糖得到平稳控制。

表6降糖疗效评估结果

表7风险评估结果

用药指导例2

检测者刘某，检测前服用瑞格列奈效果不佳，使用本发明的引物组和/或试剂盒对刘某进行高血糖相关基因的检测，检测结果如表8所示，风险评估如表9所示，经过药效分析预测磺酰脲类疗效较好。刘某服用格列本脲1个月后，血糖忽高忽低症状消失，趋于平稳。

表8降糖疗效评估结果

表9风险评估结果

由以上可以看出，应用本发明的引物组和和包含该引物组的试剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测高血糖药物代谢相关基因CYP2C9(rs1057910)、KCNJ11(rs5219)、PPARγ(rs1801282)、SLCO1B1(521T＞C)、SLC22A1(1222A>G)、SLC22A2(808G＞T)、APOE(rs429358、rs7412)的分型，从而能够对高血糖患者针对基因的个体差异制定不同的方案，选择合适的降糖药，实现精确分型和精准用药，增加降糖效果，降低药物不良反应。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司

<120> 检测高血糖药物代谢相关基因多态性的引物组和试剂盒及它们的应用

<130> HFI01067-ZKPR

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> CYP2C9上游引物

<400> 1

ctggtttatg gcagttacac atttgtg 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> CYP2C9下游引物

<400> 2

acactgccag acactaggac ctgt 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> CYP2C9测序引物

<400> 3

cacttctctc acccggtgat ggt 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> KCNJ11上游引物

<400> 4

tcgaactcct gacctagtga tctgc 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> KCNJ11下游引物

<400> 5

agccagctgc acaggaagga cat 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> KCNJ11测序引物

<400> 6

tgtgtgtggc cacttgaggt cca 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> PPARγ上游引物

<400> 7

caagacactg aacatgtggg tcac 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> PPARγ下游引物

<400> 8

cacgtcccca atagccgtat ctg 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> PPARγ测序引物

<400> 9

cagtgccagc caattcaagc ccagt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> SLCO1B1上游引物

<400> 10

cttgcctgcc accatgtaag acat 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> SLCO1B1下游引物

<400> 11

cagagatccc agggtaaagc caatg 25

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> SLCO1B1测序引物

<400> 12

actagatgcc aagaatgcat gg 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> slc22A1上游引物

<400> 13

cttggctcag gttcacggac tct 23

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> SLC22A1下游引物

<400> 14

tcacaacact ttccccacac ttcg 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> SLC22A1测序引物

<400> 15

tcatcctgca catgggcgcc ac 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> SLC22A2上游引物

<400> 16

gcttatgttg gcaggccttt catc 24

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> SLC22A2下游引物

<400> 17

cagtctcttc aaagggtcta ccgtc 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> SLC22A2测序引物

<400> 18

cagagagttg cgtagaatat tctag 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> APOE上游引物

<400> 19

cctcttgggt ctctctggct cat 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> APOE下游引物

<400> 20

tccgccacct gctccttcac 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> APOE测序引物

<400> 21

ccggctgccc atctcctcca t 21