使用人脐带组织来源的间充质基质细胞治疗脑性瘫痪和缺氧缺血性脑病的方法

本发明在国立卫生研究院国家转化科学促进中心(National Center forAdvancing Translational Sciences)(NCATS)的临床和转化科学奖(CTSA)项目(奖项号UL1TR002553)的政府支持下完成。美国政府对本发明享有某些权利。

本申请要求于2018年4月4日提交的美国临时申请序列号62/652,818的权益，其全部内容通过引用纳入本申请中。

发明背景

技术领域

本公开涉及治疗脑性瘫痪和缺氧缺血性脑病(HIE)的方法。更特别地，本公开涉及使用脐带血组织来源的间充质基质细胞治疗脑性瘫痪和HIE的方法。

背景技术

患有脑性瘫痪的儿童面临终身残疾，给受影响的患者、其父母和整个社会造成巨大的身体、情感和经济负担。脑性瘫痪通常由发育中大脑的宫内或围产期损伤引起，是儿童最常见，且代价最高的慢性运动障碍。脑性瘫痪治疗的基础依赖于无数小时的物理和职业治疗(其完全是支持性的)。没有可用于修复导致残疾的脑损伤的治疗方法。因此，一种能够促进受损脑组织的修复的新疗法有可能减轻社会负担并极大地改善脑性瘫痪患者的生存、功能和生活质量。

在分娩期中，氧和血流向胎儿脑的输送受到损害可能导致严重的脑损伤，其在出生后前几小时内临床上表现明显，描述为缺氧缺血性脑病(HIE)。中度至重度新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)可导致死亡或严重的神经发育障碍(Kurinczuk等，Early Hum Dev.2010,86(6):329-38；Lee等，Pediatr Res.2013,74(Suppl 1):50-72)。全身冷却的临床试验证明了安全性和功效，且治疗性低温(TH)已变成新生儿HIE的标准(NICHD试验：Shankaran等，NEJM2005，353(15):1574-1584；TOBY试验：Azzopardi等，NEJM 2009，361(14):1349-1358；nEURO试验：Simbruner等Pediatrics 2010，126(4):e771-778；ICE试验：Jacobs等，Archives ofPediatrics&Adolescent Medicine 2011,165(8):692-700；NICHD研讨会总结陈述：Higgins等，J Pediatr.2011，159(5):851-858)。尽管存在低温疗法，但接受中度至重度脑病低温治疗的婴儿中，有四分之一至一半死亡或伴有神经损伤存活(Higgins等，JPediatr.2011，159(5):851-858；Shankaran等，JAMA 2014，312(24):2629-2639)。全身低温研究的综合结果表明，当在出生后前6小时开始低温并持续72小时时，死亡或损伤的风险降低；然而，这种效应不是完全神经保护性的。在这些研究中，44-51％的婴儿死亡或带有残疾地生存，24-38％的患有HIE的婴儿被降温且死亡，而13-28％的幸存者后来被诊断为脑性瘫痪(Shankaran等，NEJM 2005，353(15):1574-1584；Azzopardi等，NEJM 2009，361(14):1349-1358；Simbruner等Pediatrics 2010，126(4):e771-778；Jacobs等，Archives ofPediatrics&Adolescent Medicine 2011,165(8):692-700)。尽管降温有所帮助，但这些试验的结果为辅助治疗的发展提供了强大的动力。

间充质基质细胞(mesencymal stromal cell)(MSC)是一组异质的未分化的多能细胞，其可从包括骨髓、脂肪组织和出生组织(脐带组织、胎盘)的几种不同组织分离。尽管MSC可产生中胚层组织类型，包括骨、软骨和脂肪，但其主要作用机制被认为是免疫调节和其他旁分泌作用的结果。MSC已证明对体液和细胞介导的免疫反应均具有多种免疫调节作用。这些包括但不限于抑制B-、T-、NK、树突状细胞和小胶质细胞的增殖、减少促炎细胞因子的产生和阻止中性粒细胞的募集。另外，大量使用MSC移植治疗中枢神经系统疾病的临床前研究表明，MSC可以通过释放不同的神经营养因子、抗炎因子和抗凋亡因子发挥作用来促进受损区域的恢复并防止进一步的损害(Dori等，Histol Histopathol.2017，32(10):1041-1055；Mueller等，Stem Cells Dev.2017，26(4):239-248；Pishiutta等，Crit CareMed.2016，44(11):e1118-e1131；Xie等，Med Sci Monit.2016，22:3552-3561；Cameron等，Mol Cell Neurosci.2015，68:56-72)。尽管MSC具有调节免疫反应的能力，但其自身具有低免疫原性。MSC在其表面上表达低水平的MHC I类分子且缺乏MHC II类分子和几种共刺激分子的表达。这使得MSC可用于跨HLA屏障的同种异体环境中，而无需供体-受体HLA匹配。事实上，在对13项静脉内同种异体MSC施用的人体研究(包括1,012名主要成人患者)的综述中，没有输注毒性的报告(Lalu等，PLoS One.2012,7(10):e47559)，从而支持MSC是“免疫豁免的”并可避免免疫同种识别的观点。当用作治疗细胞时，MSC通过营养信号传导发挥作用。据估计，在输注后，MSC在接受者体内最多存活4个月。MSC不会植入接收者中。

本发明人和其他人先前已经证明，在动物模型中，脐带血(CB)和间充质基质细胞(MSC)减轻了缺氧性脑损伤和中风的临床和影像学影响。在动物模型及接受同种异体的、无关供体CB移植的先天性代谢异常的人类患者中，CB也在脑中植入和分化，从而促进神经细胞修复。发明人认为，主要通过旁分泌机制发挥作用的CB细胞或人脐带组织来源的MSC(hCT-MSC)可用作脑损伤患者中新兴细胞疗法的媒介。

在先前的研究中，发明人对脑性瘫痪儿童进行了自体CB的安全性研究和II期、随机、双盲、安慰剂对照的试验。在该研究中，输注≥2x10

在HIE的新生动物模型中，输注人容积和红细胞减少的有核脐带血细胞(人脐带血(CB)细胞)导致解剖学和功能的改善。新生儿缺氧缺血性损伤的动物模型表明，其机制似乎是旁分泌，伴随脑中神经营养因子和抗炎因子的增加(Rosenkranz K和Meier C.,Annalsof Anat 2011,193:371-379；Tsuji等,Neuroscience 2014,263:148-158；Drobyshevsky等,Dev Neurosci.2015,37(4-5):349-62)。在先前的研究中，发明人报告了参与CTSI支持的自体细胞I期试验的婴儿的结果。在该研究中及在II期研究中，采集了脐带血，红细胞和容积减少的。在II期研究中，在出生后前48小时内输注两个剂量的细胞或安慰剂。在I期试验中，51名婴儿接受细胞。两名婴儿死亡(在出院后)。39名具有已知结果的婴儿中，有25名(64％)存活，一年发育评分>85，这与约50％的降温婴儿存活而无中度或重度障碍的低温试验(Higgins等,J Pediatr.2011,159(5):851-858)相比是有利的。然而，对临床试验的推广和具有HIE的新生儿的自体脐带血细胞的潜在未来使用的挑战已变得明显：在难产时收集脐带血细胞。在大多数机构，采集脐带血不是常规的。具有“现货供应”的基于同种异体细胞的产品允许为未采集脐带血的中度至重度HIE新生儿提供容易获得的细胞干预。

发明内容

本发明提供了通过施用同种异体人脐带组织来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)治疗脑性瘫痪或HIE患者的方法。本发明提供了消除拥有自身CB单位的限制的益处。

在一个方面，本发明包括一种治疗脑性瘫痪患者的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的人同种异体脐带来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)。在本发明这一方面的某些实施方案中，hCT-MSC系统性地施用。在某些实施方案中，它们静脉内施用。在本发明这一方面的一些实施方案中，患者在六个月的时间内施用hCT-MSC三次。在某些实施方案中，在基线、三个月和六个月时施用。在本发明这一方面的其他实施方案中，患者以至少约2x10

在进一步的方面，本发明包括一种治疗HIE患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的人同种异体脐带来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)。在本发明这一方面的某些实施方案中，hCT-MSC系统性地施用。在某些实施方案中，它们静脉内施用。在本发明这一方面的一些实施方案中，患者在六个月的时间内施用hCT-MSC三次。在某些实施方案中，在基线、三个月和六个月时施用。在本发明这一方面的其他实施方案中，患者以至少约2x10

在再进一步的方面，本发明包括一种治疗HIE患者的方法，该方法包括对该患者施用治疗有效量的人同种异体脐带来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)。在本发明这一方面的某些实施方案中，HIE患者为妊娠36周或更晚的新生儿，其患有中度至重度的缺氧缺血性新生儿脑病。在本发明这一方面的某些实施方案中，hCT-MSC系统性地施用。在某些实施方案中，它们静脉内施用。在本发明这一方面的一些实施方案中，患者在出生后的前48小时内以单剂量施用hCT-MSC。在本发明这一方面的一些实施方案中，患者施用两个剂量的hCT-MSC。在其中患者施用两个剂量的某些实施方案中，第一剂量在出生后的前48小时内施用，和第二剂量在第一剂量后约两个月给予。在本发明这一方面的其他实施方案中，患者以至少约2x10

附图说明

图1是总结确定hCT-MSC治疗的受试者中与同种异体CB相比GMFM-66评分变化的效应大小的I/II期试验的流程图。

图2是总结hCT-MSC(一种脐带来源的间充质基质细胞产品)在患有中度或重度缺氧缺血性新生儿脑病的新生婴儿中的I期研究的流程图。

具体实施方式

在描述所公开的过程和材料之前，应当理解本文描述的方面不限于具体的实施方案、器具或配置，且因此其当然是可以变化的。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定方面的目的，且除非本文中有明确定义，否则无意是限制的。

还应当理解，除非上下文另有明确指示，对于本发明的一个方面或实施方案公开的实施方式也可以用于本发明的其他方面或实施方案，和/或与本发明的相同或其他方面中公开的实施方案相结合。因此，本公开旨在包括且本发明包括这类组合，即使这类组合未被明确描述。

定义

为了促进对本公开的原理的理解，现在将参考特定实施方案，并且使用特定语言来描述该特定实施方案。然而，应当理解，本公开的范围并不意图由此受到限制，如本文阐明的本公开的此类改变和进一步修改是本公开所涉及的领域的技术人员通常会想到的。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”和“包含”及变化形式(例如，“包含”、“含有”、“包括”、“包括有”)应理解为意味着包括所述组分、特征、元件或步骤或者组分、特征、元件或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。

如说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。

“约”用于通过规定在不影响预期结果的情况下给定值可以“略高于”或“略低于”数值范围端点而为数值范围端点提供灵活性。

除非本文中另有说明，本文中对值的范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每一单独值的简写方法，且每一单独值均被并入本说明书中，如同其在本说明书中被单独列举一样。列举还旨在单独提及落入列举的更宽范围内的每个子范围，并且每个单独的子范围被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举。例如，如果范围被规定为1％至50％，则意图是如2％至40％、10％至30％或1％至3％等的值，以及如2％、10％、30％、40％和50％等的值明确地在本说明书中列举。这些仅是具体意指的那些的示例，并且所有可能的数字以及所列举的最低值和最高值之间的值的组合且包括列举的最低值和最高值应被视为在本公开中明确陈述。

如本文所用，“治疗”、“疗法”和/或“治疗方案”指针对患者表现出的或患者可能易患的疾病、障碍或生理状况而进行的临床干预。治疗的目的包括减轻或预防症状、减缓或停止疾病、障碍或状况的进展或恶化和/或疾病、障碍或状况的缓解。在一些实施方案中，疾病包括脑性瘫痪。在其他实施方案中，疾病包括缺氧缺血性脑病。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，且是指人和非人类动物。本公开的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。优选地，受试者是患有或正在遭受脑性瘫痪或缺氧缺血性脑损伤的人类患者。

如本文所用，术语“疾病”指任何异常的状况，例如影响受试者的部分或全部的障碍或者结构或功能。在一些实施方案中，疾病包括神经障碍。在某些实施方案中，神经障碍包括脑性瘫痪；在其他实施方案中，神经障碍包括缺氧缺血性脑损伤。

如本文所用，术语“脑性瘫痪”(CP)指婴儿或幼儿时期出现的且永久地影响身体运动和肌肉协调但不会随时间恶化的多种神经障碍中的任何一种。虽然脑性瘫痪影响肌肉运动，但它不是由肌肉或神经的问题引起的，而是由控制肌肉运动的大脑部分中的异常引起的。大多数脑性瘫痪儿童出生时就患有脑性瘫痪，或因与出生过程相关或在新生儿期中的脑损伤(例如新生儿缺氧缺血性脑病)发展为脑性瘫痪，尽管其可能在数月或数年后才被检测到。脑性瘫痪的早期征兆通常出现在儿童达到3岁之前。最常见的是在进行自主运动时缺乏肌肉协调(共济失调)；肌肉僵硬或紧张和过度反射(痉挛)；拖着一只脚或一条腿行走；踮着脚行走、蹲着行走或“剪短”行走；以及过于僵硬或过于松软的肌肉紧张性。

如本文所用，术语“缺氧缺血性脑病”(HIE)指产期期间氧和血流向胎儿脑的输送受损导致的脑损伤。中度至重度新生儿HIE可导致死亡或严重的神经发育障碍。

除非另有定义，本申请中使用的所有技术术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

脑性瘫痪或缺氧缺血性脑病的治疗

鉴于本公开，本领域普通技术人员可以配置本文所述的方法以满足期望的需求。一般地，所公开的材料、方法和器具提供了治疗患有脑性瘫痪或HIE的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的hCT-MSC和/或其组分或组分的混合物、由其组成或基本上由其组成，从而治疗脑性瘫痪或HIE。

应当理解，除非另有说明，如本文中使用的术语“hCT-MSC”指包含其任何形式和/或其组分或组分的混合物，无论是否有明确说明。

患者可以是任何人类或非人类动物。在一个实施方案中，患者是人。在另一个实施方案中，患者是18岁以下的，或落入该较宽年龄范围内的任何年龄范围中的人类儿童。在非限制性的实例中，患者可以是新生儿、1-12个月大的婴儿、1个月-2岁、1-18岁、1-17岁、1-16岁、1-15岁、1-14岁、1-13岁、1-12岁、1-11岁、1-10岁、1-9岁、1-8岁、1-7岁、1-6岁、1-5岁、1-4岁、1-3岁、1-2岁、2-18岁、2-17岁、2-16岁、2-15岁、2-14岁、2-13岁、2-12岁、2-11岁、2-10岁、2-9岁、2-8岁、2-7岁、2-6岁、2-5岁、2-4岁、2-3岁、3-18岁、3-17岁、3-16岁、3-15岁、3-14岁、3-13岁、3-12岁、3-11岁、3-10岁、3-9岁、3-8岁、3-7岁、3-6岁、3-5岁、3-4岁、4-18岁、4-17岁、4-16岁、4-15岁、4-14岁、4-13岁、4-12岁、4-11岁、4-10岁、4-9岁、4-8岁、4-7岁、4-6岁、4-5岁、5-18岁、5-17岁、5-16岁、5-15岁、5-14岁、5-13岁、5-12岁、5-11岁、5-10岁、5-9岁、5-8岁、5-7岁、5-6岁、6-18岁、6-17岁、6-16岁、6-15岁、6-14岁、6-13岁、6-12岁、6-11岁、6-10岁、6-9岁、6-8岁、6-7岁、7-18岁、7-17岁、7-16岁、7-15岁、7-14岁、7-13岁、7-12岁、7-11岁、7-10岁、7-9岁或7-8岁。

在一些实施方案中，患者为最高约45岁的人，或在落入从约1岁至约45岁的较宽年龄范围内的任何年龄范围中。例如，约18至约45岁、约20至约45岁、约25至约45岁、约30至约45岁、约35至约45岁或约40至约45岁。在某些实施方案中，患者是1至45岁之间的任何年龄的人。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45岁。

在一些实施方案中，患者为最高约90岁的人，或落入约1岁至约90岁的较宽年龄范围内的任何年龄范围中。例如，约18岁至约90岁、约20岁至约90岁、约45岁至约90岁或约60岁至约90岁。在某些实施方案中，患者是具有45至90之间的值的任何年龄的人，即使本文中未具体列举，例如45、50、55、60、65、70、75、80、85或90。

在某些实施方案中，患者是妊娠36周或更晚、妊娠37周或更晚、妊娠38周或更晚、妊娠39周或更晚或者妊娠40周或更晚的新生儿。

hCT-MSC可通过本领域已知的任何技术(包括局部或全身施用)施用于受试者。施用途径包括但不限于皮下、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、鞘内、脑内、心室内或硬膜外注射或植入；局部施用；气管内；和鼻内施用。hCT-MSC可通过输注技术施用。通常，输注指的是静脉内或皮下施用hCT-MSC。在一些实施方案中，hCT-MSC系统性施用。在进一步的实施方案中，hCT-MSC通过静脉内注射施用。

hCT-MSC的制备

人同种异体脐带来源间充质基质细胞可通过本领域已知的任何方法制备、保存和准备用于施用。在一些情况下，hCT-MSC可在清洁室中通过将脐带组织切割成块并切碎和用透明质酸酶、DNase、胶原酶和木瓜蛋白酶消化来制备。所得细胞悬液然后可在培养物中接种，生长至汇合以建立P0培养物，并冷冻保存。P1和P2培养物可以在类似的条件下生长，并从培养器皿移除。最终产物可来源于P2培养物，其收获到具有5％的人血清白蛋白的plasmalyte中，洗涤并冷冻保存在含有5000万-1亿细胞的隔室冷冻袋中，终浓度10％DMSO和葡聚糖中。在施用当天，可将一个隔室解冻，在10-40mL的plasmalyte IV溶液中稀释，置于注射器或袋中，并运送至床侧施用。

hCT-MSC的施用

脐带血的施用途径可由本领域技术人员基于治疗的疾病和期望的结果选择。因此，在某些实施方案中，hCT-MSC通过外周静脉内(IV)输注施用。

在一些实施方案中，hCT-MSC可以作为单剂量施用。在某些实施方案中，hCT-MSC可以在一段时间(例如，数天或数月)内以多个剂量(例如，每次治疗两个、三个或者四个或更多个单剂量)施用。在一些情况下，患者可以施用hCT-MSC三次，且在一些情况下，在六个月时间内施用三次。在某些情况下，施用可以在基线、三个月和六个月时。在某些情况下，施用可以在基线、两个月和四个月时。本领域技术人员能够得出本文所提供的给药方案的变化，并理解这类变化包含在本发明中。

在一些情况下，对于患有HIE的新生儿患者，患者可施用hCT-MSC一次，或患者可施用hCT-MSC两次。在一些情况下，新生儿可施用hCT-MSC三次或更多次。在某些情况下，在出生后的前48小时内施用第一剂量。在其中施用第二剂量的某些情况下，第一剂量在出生后前48小时内给予，和第二剂量在第一剂量后约两个月给予。本领域技术人员能够得出本发明所提供的给药方案的变化，并理解这类变化包含在本发明中。

在施用hCT-MSC之前，患者可在适当情况下用例如抗组织胺和/或类固醇进行预用药。

当静脉内施用时，hCT-MSC可以在20分钟至约75分钟范围的时间段内施用，例如，在约20分钟至约60分钟、或在约20分钟至约50分钟、或在约20分钟至约40分钟、或在约20分钟至约30分钟、或在约25分钟至约70分钟、或在约25分钟至约60分钟、或约25分钟至约50分钟、或约25分钟至约40分钟、或约30分钟至约70分钟、或约30分钟至约60分钟、或约30分钟至约50分钟、或约30分钟至约40分钟。在一些实施方案中，剂量在30分钟内施用。

本领域技术人员能够为本发明得出合适的给药方案。在一些实施方案中，hCT-MSC的治疗有效剂量包括约1×10

本领域技术人员将认识到，可以基于所需的施用途径选择剂量的合适体积。例如，静脉内给药可使用约5mL至约50mL范围内的剂量体积；例如约5mL-约40mL，或约5mL-约30mL，或约5mL-约20mL，或约5mL-约15mL，或约10mL-约40mL，或约10mL-约30mL，或约10mL-约20mL，或约10mL-约15mL，或约20mL-约50mL，或约20mL-约40mL，或约20mL-约30mL，或约30mL-约50mL，或约30mL-约40mL，或约40mL-约50mL。

在某些实施方案中，hCT-MSC通过输注3个剂量的2x10

在使用外周IV施用的情况下，IV液体可以约1.0至约2.0倍的维持施用。例如，IV液体可在输注后以约1.0至约1.5倍的维持或约1.5至约2.0倍的维持施用。维持IV液体可在输注hCT-MSC后施用约30分钟至约60分钟。例如，维持IV液体可在输注后施用例如约30分钟至约60分钟，或约30分钟至约45分钟，或约45分钟至约60分钟。

任何合适的静脉内液体可用于hCT-MSC输注后的维持。在某些实施方案中，维持IV液体是盐水溶液或林格氏乳酸盐溶液。在某些实施方案中，维持IV液体为0.25％生理盐水溶液。在某些实施方案中，维持IV液体是0.5％生理盐水溶液。

在某些实施方案中，当hCT-MSC施用是在HIE患者中时，hCT-MSC可与治疗性低温结合施用。“与…结合”指在治疗性低温之前、同时/期间或之后。在某些实施方案中，hCT-MSC在治疗性低温的同时/期间施用。

现在通过以下非限制性实施例进一步解释本公开的某些方面。

实施例1：I/II期试验以确定与同种异体CB相比，hCT-MSC治疗的受试者的GMFM-66评分变化的效应大小

概述

本研究为I/II期前瞻性、随机、开放标签试验，其设计为确定hCT-MSC或同种异体CB治疗的受试者中GMFM-66评分变化的效应大小，并评估脑性瘫痪儿童中重复hCT-MSC剂量的安全性。具有因缺氧缺血性脑病、中风或室周白质软化而导致的脑性瘫痪的2-5岁儿童可能有资格参与。所有参与者最终在研究期间的某个时间点用同种异体细胞产品治疗。参与者被随机分组到以下三组之一：(1)“AlloCB”组在基线访问时接受一次同种异体CB输注；(2)“MSC”组接受三次hCT-MSC输注，在基线、三个月和六个月时各一次；(3)“自然病史(natural history)”组在基线时不接受输注，但在12个月时接受同种异体CB输注。运动结果测量在基线、六个月和一年时间点时进行评估。安全性在每次输注访问时进行评估，并在最后一次访问后另外12个月内进行远程评估。参与研究的持续时间为从基线访问起的24个月。治疗组的随机分组在研究进入时根据年龄和GMFCS水平进行分层。

主要终点是初始研究输入后12个月参与者的观察和预期的GMFM-66评分变化之间的差异。对于hCT-MSC、AlloCB和自然病史组分别报告区间估计值。12个月时的预期GMFM-66评分基于参与者的基线年龄、GMFCS水平和研究进入时的GMFM-66评分使用公布的参考百分位数进行计算(Hanna等，Phys Ther.2008，88(5):596-607)。

目的

本研究的主要目的是估计脑性瘫痪儿童接受单剂量同种异体脐带血(AlloCB)或重复剂量的脐带组织来源间充质干细胞(hCT-MSC)治疗后12个月的运动功能变化。另外，本研究将为临床试验界提供与开展临床试验相关的短期(不到1年)时间内CP中运动功能的自然病史方面的急需数据，并评估AlloCB和hCT-MSC输注在脑性瘫痪儿童中的安全性。

本试验中不相关CB单位的来源

Carolinas脐带血库(CCBB)是全国最大的公共脐带血库之一。CCBB于1998年在国立卫生研究院国家心脏和血液研究所的支持下成立，CCBB库存超过30,000个CB单位，且迄今已分发超过2,500个CB单位用于移植。在2012年，FDA批准CCBB销售DUCORD(一种源自脐带血的干细胞产品)用于无关供体和受体之间的移植的BLA申请。DUCORD被批准用于患有遗传的、获得性的或因清髓治疗导致的影响造血系统的障碍的患者的造血干细胞重建。CCBB目前从10家医院场所(北卡罗莱纳州8家、佐治亚州亚特兰大市1家和马萨诸塞州波士顿市1家)收集。它还接受来自在北卡罗莱纳州和亚特兰大的任何医院分娩的母亲通过设备捐赠计划(kit donation program)的CB捐赠。

合格CB单位的规格

基于利用同种异体CB进行造血干细胞移植的确立标准以及我们用自体CB对600多名患有神经系统病症的儿童进行治疗的经验，我们制定了以下标准以限定库存的CB单位用于细胞治疗研究的资格。本次研究中使用的所有CB单位从Carolinas脐带血库获得。CB单位必须具有：

1.有记录的且至少12x10

2.低温保存前存活力≥85％的总细胞和≥70％的CD34+细胞

3.进行低温保存前无菌培养且是阴性的

4.母体传染病筛查如下：检验必须包括乙肝、丙肝、HIV、HTLV和梅毒的阴性结果。根据当地和国家的法规，可能会进行额外的筛查(取决于CB的收集时间)。可使用来自CMV抗体筛查阳性的母亲的单位。

5.可用于身份确认和效能测试的测试样品

6.进行HLA分型并符合研究特定的参数

7.解冻的测试样品的CD45+存活力≥40％和CD34+存活力≥70％

本研究的MSC的来源：hCT-MSC

hCT-MSC是由同种异体捐赠的消化脐带组织制成的第三方MSC产品，其在培养中扩增两代，冷冻保存，储存在液态氮的气相中，并库存。脐带组织由书面知情同意的在正常怀孕后产下健康的足月婴儿的健康母亲捐赠。细胞在Robertson CT2 GMP实验室(DukeUniversity,Durham,NC)制备、冷冻保存和储存。

脐带组织是MSC的有吸引力的来源，因为其轻易可得的且可在对供体无影响的情况下容易地获得，不会引起争议，并且比其他出生后来源的MSC具有更高的增殖潜力(Drela等，Cytotherapy.2016，18(4):497-509)。大量临床前研究未显示脐带组织来源的MSC的致瘤性或毒性的任何证据(Park等，Toxicol Res.2016，32(3):251-258)。在使用脐带组织来源的MSC的英文公布的早期临床试验中，在这36项研究中(包括695名患者和至少1,416个剂量的脐带组织来源的MSC，随访时间范围为3个月至6年)，未报告任何严重不良事件。在各种疾病状况下，更多的几项脐带组织来源MSC的临床试验正在进行中(clinicaltrials.gov)。

研究基本原理和假设

先前的研究表明，充分给药的自体CB输注可改善脑性瘫痪儿童的运动功能。由于每个脑性瘫痪儿童均可获得其自身的CB是不现实的，本研究评估所有需要的患者均可得的两种同种异体细胞源的功效。本研究的主要目的是调查两种同种异体细胞源(同种异体CB和hCT-MSC)治疗12个月后运动功能的变化。

本研究将生成有关这两个细胞源和自然病史群组的运动功能变化的效应大小的重要数据，以帮助规划将来的试验。本研究和脑性瘫痪的细胞治疗的潜在益处的基本原理是基于以下假设：

●我们已经证明了在脑性瘫痪儿童中自体CB输注的安全性和剂量依赖性功效。

●可能的是不同的细胞类型(例如，脐带血单核细胞与脐带组织MSC)可通过不同的机制影响大脑连接性。

●多个剂量的细胞可能优于单剂量的细胞。

●发育的大脑表现出显著的可塑性，从而使幼儿成为从恢复性治疗(包括CB)获得最大治疗益处的理想候选。

●通过旁分泌机制发挥作用的CB细胞可促进内源性修复机制并促进运动皮质新神经连接的形成，从而导致显著的临床改善。

●大脑连接性在脑性瘫痪儿童中脑损伤的病理生理和潜在的修复机制中发挥重要作用。具体而言，我们假设(1)大脑连接性的受损造成脑性瘫痪儿童的运动缺陷；(2)大脑连接性的提高对功能改善有直接影响；(3)接受CB输注的脑性瘫痪儿童显示出比接受安慰剂输注的儿童更大的大脑连接性提高；和(4)基线脑连接性异常的严重程度预测CB治疗益处的潜能。

研究设计

本研究为I/II期前瞻性、随机、开放标签试验，设计为评估hCT-MSC或同种异体CB治疗的受试者中GMFM-66评分变化的效应大小，和评估重复剂量的hCT-MSC在脑性瘫痪幼儿中的安全性。具有因缺氧缺血性脑病、中风或室周白质软化导致的脑性瘫痪的2-5岁儿童可能有资格参与。所有参与者最终在研究期间的某个时间点用同种异体细胞产品治疗。参与者被随机分为以下三组之一：(1)“AlloCB”组在基线访问时接受一次同种异体CB输注；(2)“MSC”组接受三次hCT-MSC输注，在基线、三个月和六个月时各一次；(3)“自然病史”组在基线时不接受输注，但在12个月时接受同种异体CB输注。所有参与者进行初始临床评估以验证和分类脑性瘫痪的诊断并确定适格性。他们另外返回两次(AlloCB和自然病史组)或三次(MSC组)进行研究访问。结果测量在基线、六个月和一年的时间点进行评估。额外的安全性终点在最后一次亲自访问后的12个月内进行远程评估。

研究目标

主要目标：确定单剂量的10×10

次要目标：评估重复剂量的hCT-MSC在脑性瘫痪儿童中的安全性。

探索性目标：(1)确定同种异体CB或hCT-MSC治疗的儿童中6个月和12个月时Peabody运动发育量表-2(PDMS-2)评分的变化。(2)分析从基线到12个月的正常化总大脑连接性的变化(如用DTI通过脑MRI测量的)。(3)评估6个月和12个月时功能和生活质量量度的变化。

研究设计—总体设计

本研究为I/II期前瞻性、随机、开放标签试验，其设计为确定hCT-MSC或同种异体CB治疗的受试者中GMFM-66评分变化的效应大小，和评估重复剂量的hCT-MSC在脑瘫儿童中的安全性。具有因缺氧缺血性脑病、中风或室周白质软化而导致的脑性瘫痪的2-5岁儿童可能有资格参与。

所有受试者最终在研究期间的某个时间点用同种异体细胞产品治疗。参与者被随机分组到以下三组之一：(1)“AlloCB”组在基线访问时接受一次同种异体CB输注；(2)“MSC”组接受三次hCT-MSC输注，在基线、三个月和六个月时各一次；(3)“自然病史”组不在基线时接受输注，但在12个月时接受同种异体CB输注。运动结果测量在基线、六个月和一年时间点进行评估。安全性在每次输注访问时进行评估，并在最后访问后另外12个月内进行远程评估。研究参与的持续时间为基线访问的时间起的24个月。治疗组的随机化在研究进入时根据年龄和GMFCS水平进行分层。

研究流程图在图1中提供。

研究设计-研究终点

主要终点：主要终点是初始研究输注后12个月参与者的观察和预期的GMFM-66评分变化之间的差异。hCT-MSC、AlloCB和自然病史组的区间估计值单独报告。12个月时的预期GMFM-66评分基于参与者的基线年龄、GMFCS水平和研究进入时的GMFM-66评分使用公布的参考百分位数进行计算(Hanna等Phys Ther.2008，88(5):596-607)。

次要终点：次要终点是在hCT-MSC或AlloCB输注后12个月内发生的不良事件的数量。

探索性分析：

●基线、6个月和12个月时观察的GMFM 66评分。

●在6和12个月时的Peabody运动发育量表-2(PDMS-2)评分的变化。

●从基线到12个月正常化的总大脑连接性的变化，如通过使用DTI的脑MRI测量的。

●6个月和12个月时功能和生活质量量度的变化。

研究参与者的选择和退出—研究群体

90名痉挛型脑性瘫痪的2-5岁儿童。

研究参与者的选择和退出—入组标准

1.入组时年龄≥24个月且调整的年龄≤60个月。如果患者在孕期<37周出生，患者年龄对于早产情况进行调整。

2.诊断：继发于宫内或围生期中风/出血、缺氧缺血性脑病(包括但不限于出生窒息)和/或室周白质软化的单侧或双侧痉挛型脑性瘫痪。

3.性能状态：粗大运动功能分级评分I-IV级

4.脑成像(在进入研究前作为护理标准获得的)的审查不提示遗传病症或脑畸形。

5.法定授权代表人同意。

研究参与者的选择和退出–排除标准

1.可得的合格自身脐带血单位。

2.无痉挛的低张性或共济失调性脑性瘫痪。

3.无运动障碍的自闭症和自闭谱系障碍。

4.高度节律失调。

5.导致癫痫性脑病的难治性癫痫发作。

6.进行性神经疾病的证据。

7.具有活跃的、不受控制的系统性感染或HIV+状态的记录。

8.体检中已知遗传疾病或遗传疾病的表型证据。

9.可能需要未来的同种异体干细胞移植的并发遗传性或获得性疾病或共病。

10.需要呼吸支持，包括家用呼吸机、CPAP、BiPAP或补充氧。

11.通过血清肌酸酐>1.5mg/dL和/或总胆红素>1.3mg/dL确定的肾或肝功能受损，除患有已知吉尔伯特氏病的患者外。

12.可能的免疫抑制，定义为WBC<3,000细胞/mL或绝对淋巴细胞计数(ALC)<1500，及异常T细胞亚群。

13.病人的医学状况不允许安全旅行。

14.之前接受任何形式的细胞治疗。

研究参与者的选择和退出–研究参与者的招募和筛选

患者可通过IRB批准的研究广告在CB库的网站、家长赞助网站、NMDP网站、选定的脑性瘫痪协会、当地医疗机构和通过先前研究的问询记录(脑损伤数据库)进行招募。任何广告获得IRB的单独批准。

本研究的筛查是根据独立的、IRB批准的筛查方案(Pro00063563)进行的。根据本方案，在获得父母/监护人的书面知情同意后，获取并审查患者的医疗记录、视频和脑成像结果。医疗审查由儿科护士、执业护士和医生的小组进行以确定任何排除标准的存在。如果未确认排除标准，则进行实验室筛查，并可能进行检索以确定适当匹配的CB单位。

研究产品-同种异体脐带血

本试验中使用的同种异体不相关供体CB单位从Carolinas脐带血库获得，这是FDA许可的杜克大学医疗中心的公共脐带血库。CB供体必须有资格捐献至公共脐带血库供同种异体使用。根据CFR 1271.75进行通过问卷的供体资格筛查，并根据CFR 1271.80和1271.85进行传染病测试。该单位还必须具有适当程度的HLA匹配，并符合下文详述的产品规格。

所有潜在的研究参与者通过血液或口腔拭子进行高分辨率的HLA-A、B和HLA-DRB1的HLA分型。接受同种异体CB的患者具有对供确认的两个单独的样品进行的HLA分型。潜在匹配的同种异体单位初始从Carolinas脐带血库的检索进行识别。最佳的选择可获得的HLA匹配(≥4/6)的(使用在HLA I A和B类的中等水平匹配及HLA II类、DRB1的高分辨率等位基因水平匹配)冷冻保存前有核细胞剂量≥12×10

获得接受者的ABO/Rh血型。CB单位不基于ABO分型选择。但是，为Rh阴性女性参与者选择Rh阴性CB单位以避免年轻女性的Rh致敏。

脐带血库的初始测试结果必须包括冷冻保存前TNCC、存活力和无菌培养。冷冻保存前TNCC必须≥12x10

每个CB单位必须可获得测试小瓶或段用于效力测试和验证的HLA分型。该段从候选单位脱离，并根据Duke的CCBB的标准操作程序进行效力和身份的测试(HLA-验证性分型)。如果CD45细胞群体的存活力≥40％且CD34细胞群体的存活力≥70％，则单位被视为可接受的。描述CFU生长、醛固氢酶(aldehydehydrogenase)的表达和CD34，但不作为研究入组的规范。

在患者到达之前，其指定的CB单位从Carolinas脐带血库转移到位于同一建筑内Duke STCL，在那里它将被储存在液氮冷冻箱中直至输注日。在输注当天，根据SOP STCL-PROC-036，CB解冻和在葡聚糖/白蛋白中洗涤，并基于接受者的体重重悬浮在适当的体积中用于以标准方式施用于患者(Rubinstein等，Proc Natl Acad Sci U S A.1995，92(22):10119-10122)。解冻时，进行列出的标准研究(见表1)。仅TNCC用于发布。制备10×10

表1：解冻后脐带血单位测试

*解冻后CD34+细胞的存活力先前在段上测试，并要求满足≥70％的规格。因此，对于临床产品，我们报告但不使用解冻后存活力作为交付标准。

**如果在产品施用后获得了阳性培养物，则实施通知临床和研究团队并治疗患者(如有指示)的计划。

研究产品-人脐带组织来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)

hCT-MSC在清洁室ISO 7设施中按照cGMP制造，并且是由消化的脐带组织制造的同种异体细胞的产品，其在培养中扩增、冷冻保存和库存。hCT-MSC在Duke CT2 GMP细胞制造实验室中由从正常足月分娩的胎盘中收获的脐带组织制造，其中婴儿的脐带血在供体婴儿的母亲书面知情同意后捐赠给Carolinas脐带血库，其是杜克大学医学中心的FDA许可的、FACT认证的公共脐带血库。脐带组织从正常足月妊娠后通过选择性剖腹产分娩的男性婴儿的胎盘收获。供体筛查问卷由母体供体填写，且母体血液由Charlotte,NC的美国红十字会的CLIA认证的供体筛查实验室进行传染病测试。供体必须有资格向公共脐带血库捐献供同种异体使用。在胎盘和脐带交付后，脐带血从胎盘中无菌排出。然后，将脐带干燥，用chloropreps清洗，从胎盘底部分离，放入含有Plasmalyte A的无菌瓶内，并在室温下在经过验证的容器中运输至Robertson Clinical and Translational Cell Therapy CT2 GMP细胞处理实验室。

在洁净室生产间中，将脐带组织在生物安全柜中从介质中取出，放入无菌盘中，切成小块，和然后切碎和在Miltenyi Biotec GentleMacs Octo Dissociator中用GMP级酶(透明质酸酶、DNase、胶原酶、木瓜蛋白酶)消化。将所得细胞悬液置于含有1％血小板裂解物的Prime XV MSC Expansion XSFM(Irvine Scientific)培养基中培养，并生长至汇合(约7-14天)以建立P0培养物。为了建立主细胞库，收获P0和将其在具有Cryostor 10培养基(BioLife)的冷冻瓶中冷冻保存，并储存在液态氮的蒸气相中。P1和P2培养物在类似条件下生长，按照需要分别在无血小板裂解物的HYPERFlasks或HYPERStacks中生长以建立工作细胞库和用于施用的产品。使用TrypLE(Gibco)从塑料培养器皿移取来自P1和P2的细胞。最终产品源自于P2培养物，其收获到具有5％的人血清白蛋白的plasmalyte中，洗涤并冷冻保存在含有5000万-1亿细胞的隔室冷冻袋中，最终浓度10％DMSO与葡聚糖(AkronScientific)。在施用当天，一个隔室解冻，在10-40mL的plasmalyte IV溶液中稀释，置于注射器或袋中，并运送至床侧用于在30-60分钟内施用。

在每一次传代中，细胞产物通过流式细胞术和经由T细胞增殖和小胶质细胞激活的器官型模型的功能分析评估细胞表面表型来表征。在P2的冷冻保存之前，还对每一批次进行无菌性、内毒素和支原体测试，且这些测试必须符合规范。对于给药，解冻和稀释后的交付测试包括通过细胞计进行的TNCC和存活力。根据解冻后计数，患者被给予2x10

过程和最终制剂

hCT-MSC由单个脐带组织经一系列的三个步骤制造：形成主细胞库、工作细胞库和研究产品。每一步骤的产物在受控速率冷冻箱中冷冻保存，并储存在液氮的蒸气相中。在P2时，代表性的冷冻袋在使用该批次产品治疗任何患者之前解冻和证明合格。产品交付测试包括总有核细胞计数、存活力、表型、功能性分析、内毒素、支原体、革兰氏染色和无菌性。每批细胞在冷冻保存前还测试外膜病毒。

在治疗当天，按照SOP STCLAOP-028 JA2对细胞进行解冻，然后在10-40mL的plasmalyte A+5％人血清白蛋白(HSA)中稀释。取出等分试样进行细胞计数、存活力和无菌培养。如果细胞存活率≥70％，则调整最终产品体积以向研究受试者递送2x10

在测试解冻后细胞计数和存活力后，hCT-MSC最终产品有条件地交付用于施用于患者。最终交付在研究产品的14天无菌培养期后进行。如果在产品施用后无菌培养物转为阳性，对生物体进行鉴定并进行抗生素敏感性测试。联系患者的家人以确定其是否有症状(即发热或其他感染迹象)。对无症状患者进行观察，但不使用抗生素治疗。对有症状的患者进行评估和相应地，在适当的情况下用血液培养物和抗生素治疗。所有接受随后无菌测试阳性的产品的患者在注意到无菌检查阳性后14天内接受研究护士的每日接触进行追踪。

进一步的制造和测试详情可见于2018年4月4日提交的美国临时申请S/N 62/652,722，其内容通过引用全文并入本文中。

研究产品-CB和hCT-MSC的供体筛查

根据Carolinas脐带血库标准操作程序进行供体筛查和测试以满足21CFR Part1271的所有要求。筛查和测试符合最新建议，并基于生物许可1870号获得FDA的批准。对脐带血的母体供体进行HIV-1、HIV-2、HIV-O、乙型肝炎病毒(HBV，表面抗原和核心抗体)、丙型肝炎病毒(HCV)抗体、梅毒密螺旋体(梅毒)、克雅氏病(CJD，仅筛查)、查加斯病、人嗜T-淋巴细胞病毒1型和2型(HTLV-1、HTLV-2)以及针对CMV的总抗体的筛查和测试。还对母体血液进行了HIV-1/2/O、HBV、西尼罗河病毒和HCV的核酸测试。也可进行寨卡病毒的筛查。

由于本研究使用的脐带组织将从同意向Carolinas脐带血库捐赠脐带血的供体获得，因此他们将按照Carolinas脐带血库标准操作程序接受供体筛查和传染病测试。脐带血相关的母体样品和脐带组织MSC样品作为参考样品保留以供作为本研究部分的将来测试。

研究产品-研究产品的包装

所有细胞产品接受唯一的识别号(ISBT Demand 128条形码)以确保产品完整性并维持监管链。临床场所或脐带血库为CB单位或hCT-MSC产品分配ISBT Demand 128条形码标签，其直接或通过系挂标签放置在产品袋/注射器上。产品由训练的信使在经过验证的冷却器中从STCL运输至输注现场。

研究产品-研究产品的施用

患者在安排输注的早上到达诊所。麻醉师、临床工作人员或研究人员放置外周IV，并施用苯那君(Benadryl)0.5mg/kg/剂IV和索洛美特罗0.5-1mg/kg IV的术前用药。同种异体CB产品在医生直接监督下5至25分钟内静脉内施用。hCT-MSC产品在直接监督下30-60分钟内静脉注射施用。生命体征(心率、血压、体温、呼吸率)在到达诊所时和临床指示时进行检查。在整个输注过程中以及输注后至少5分钟内，持续监测脉搏血氧仪。患者用标准静脉液体补水(如耐受的)，并观察输注后至少一小时。

研究计划-概述

先前联系过我们项目并有符合本研究的合格标准的儿童的父母/监护人被告知本研究可用。初步接触后，潜在研究参与者的父母/监护人与研究人员进行初步电话访谈以描述本研究、验证基本合格标准并确认其参与兴趣。参与者的适格性随后将通过审查医疗记录、视频、实验室检验和影像在单独的筛查方案下进行筛查。

一旦所有筛查完成且患者可能符合研究标准，在Carolinas脐带血库确定合适的不相关供体CB单位。CB单位如第6节所述进行筛查。参与者然后前往Duke进行第一次访问。第1天，获得书面知情同意。通过身体观察及对脑性瘫痪诊断的验证和GMFCS水平确认患者的适格性。如果未达到排除标准，参与者被随机分配到治疗组。在第一次访问期间，所有参与者接受物理治疗评估，且部分患者接受脑MRI。参与者接受其指定治疗组确定的研究输注(对于AlloCB仅在基线时；对于自然病史仅在12个月时；对于MSC在基线、3个月和6个月时)。

每次输注后的一天对受试者进行评估，且每次输注后约2周联系家长进行电话随访。所有参与者在基线访问后6个月(运动评估)和12个月(运动评估和脑MRI)返回Duke。MSC组的参与者也在三个月时返回进行hCT-MSC输注。输注后24个月通过电话或电子邮件进行远程安全性评价。

研究计划-患者筛选

初始患者筛查在知情同意的情况下根据单独的方案进行，并包括对医疗记录的审查、视频和初始实验室测试。如果未确认排除标准，通过电话获得知情同意，患者随机分配至治疗组。如有指示(AlloCB和自然病史组)，Carolinas脐带血库确定不相关供体CB单位。参与者前往Duke进行初始评估。评估和治疗在门诊环境进行。进行体检和基线GMFCS评估以确认适格性，且参与者接受剩余的研究评估。

研究计划-CB单位选择

对于随机分配至AlloCB和自然病史组的参与者，在Carolinas脐带血库确定同种异体的不相关供体CB单位。对患者获得HLA分型，并选择最佳可得的HLA匹配的CB单位，其具有≥12x10

一旦合适的同种异体CB单位被视为可接受的匹配，在Duke STCL对CB单位的样品进行效力测试。如果这些测试的结果令人满意，CB单位在冷冻状态下输送给Duke STCL。

研究计划-研究产品输注

在输注当天，由STCL制备CB细胞或hCT-MSC产品，并在研究小组和儿童血液和骨髓移植项目工作人员的监督下在门诊提供给患者输注。外周IV由临床工作人员、麻醉人员或研究小组的成员放置。在研究输注前，施用术前用药(苯那君和索洛美特罗)。解冻后，CB单位在室温下的有效期为四小时。

使用标准实施方式，Allo CB输注在约5-25分钟内给予，且hCT-MSC输注在30-60分钟内给予。儿童如下所述接受1-1.5x的维持IV液体，并在门诊观察至少输注后一小时。如果所有生命体征处于基线，且患者清醒和无症状及无毒性迹象，则患者在至少一小时后离开诊所。研究人员在输注后的一天对患者进行评估以评价任何输注相关的不良反应或并发症。研究人员在输注后两周打电话给父母/监护人以评估输注的安全性。

体重 每天mL/kg

前10公斤 100 除以24小时/天

第二个10公斤 50 除以24小时/天

每增加1公斤 20 除以24小时/天

如果患者在计划输注当日有疾病迹象，包括但不限于发热>38.5℃、呕吐、腹泻或呼吸困难，则输注被推迟。

研究计划-意外事件期间的护理

如果患者在CB输注期间出现过敏反应的迹象或症状，包括荨麻疹、呼吸困难、咳嗽、喘息或呕吐，则终止输注并开始适当的药物治疗。

研究计划-运动评估

粗大运动功能测量-66(GMFM-66)：GMFM-66是一种标准化的观察仪器，其设计和验证用于测量脑性瘫痪儿童的粗大运动功能随时间的变化。已公布了2-12岁儿童的预期进展的发育曲线(Hanna等Phys Ther.2008，88(5):596-607；Rosenbaum等Jama.2002，288(11):1357-1363)，从而允许基于基线年龄、GMFCS水平和GMFM-66评分计算未来预期评分。GMFM-66由66个项目组成，分为五类：平躺和滚动、坐、爬和跪、站立及行走、奔跑和跳跃。

每一项目均按四点李克特量表评分。GMFM-66是包含额外的22个项目(主要在平躺和滚动类别中)的GMFM-88的一个子集。这两个量度已在5个月至16岁的脑性瘫痪儿童中进行验证。无运动残疾的5岁儿童能够达到最高评分(Russell等，Gross Motor FunctionMeasure(GMFM-66&GMFM-88)User's Manual.London:Mac Keith Press；2013)。计算机程序，Gross Motor Ability Estimator，用于计算GMFM-66总评分。本研究的主要终点是在初始研究输注后12个月儿童的实际和预期的GMFM-66评分变化之间的差异。对照(安慰剂)和治疗的患者进行比较。

在可能时，执行整个GMFM-88，并且可以子集作为探索性终点进行分析。

Peabody运动发育量表(PDMS-2)：PDMS-II是儿童早期运动发育的标准化评估，其评估粗大和精细运动技能两者。它是为从出生到5岁的儿童设计的。评估由测量生命早期发育的相互关联的运动能力(即反射、静态、活动、物体操纵、抓取和视觉-运动整合)的六个子测试组成。获得粗大运动商、精细运动商和总运动商综合评分。对于本研究，获得粗大运动商并作为次要终点进行分析。

研究计划-功能和生活质量评估

儿童残疾评估量表-计算机适应测试(PEDI-CAT)：PEDI-CAT测量三个功能领域的能力：日常活动、行动力和社交/认知。计算机化的自适应版本旨在通过利用项目反应理论统计模型基于对先前项目的反应来确定在每个领域内评估哪些项目，从而提供对儿童能力的准确和准确的评估，同时提高效率并减轻被调查者的负担。

儿童生活质量量表4.0，通用核心量表和脑性瘫痪模块(PedsQL)(Varni等，Developmental medicine and child neurology.2006,48(6):442-449)。PedsQL通用核心量表和脑性瘫痪模块由平行的儿童自我报告和父母代理报告格式组成。35个项目的PedsQL脑性瘫痪模块包含7个量表并生成标准评分：(1)日常活动(9个项目)、(2)学校活动(4个项目)、(3)运动与平衡(5个项目)、(4)疼痛与伤害(4个项目)、(5)疲劳(4个项目)、(6)饮食活动(5个项目)和(7)语言与交流(4个项目)。

研究计划-影像评估

先前作为标准护理获得的参与者脑成像由脑成像分析中心(BIAC)小组的成员进行审查以确定是否可能在脑MRI上进行准确的解剖图像分割。有可能获得可用数据的那些参与者(估计占合格参与者的约三分之二)接受具有扩散张量成像(DTI)的脑MRI。扩散加权图像在3特斯拉GE扫描仪(Waukesha,WI)上采集。T1加权图像利用反向制备的3D快速扰相梯度回波(FSPGR)脉冲序列获得。这些图像被分析以获得全脑连接性的测量。

统计学考虑因素-研究设计

本研究为I/II期前瞻性、随机、开放标签试验，设计为提供AlloCB和hCT-MSC治疗后运动功能的12个月变化的区间估计，向临床试验界提供与进行临床试验相关的短期(不到1年)时间段内CP中运动功能的自然病史的额外数据，并评估重复剂量的hCTMSC和单剂量的AlloCB在脑性瘫痪儿童中的安全性。

具有因缺氧缺血性脑病、中风或室周白质软化而导致的脑性瘫痪的2-5岁儿童有资格参与。所有参与者最终在研究期间的一些时间点用同种异体细胞产品治疗。参与者被随机(1:1:1)分为三组之一：(1)“AlloCB”组在基线访问时接受一次同种异体CB输注；(2)“MSC”组接受三次hCT-MSC输注，分别在基线、三个月和六个月时各一次；“自然病史”组在基线时不接受输注，但在12个月时接受同种异体CB输注。不良事件的发生在所有参与者中随机分组后3、6、12和24个月进行评估。所有参与者的运动功能结果测量在基线、六个月和一年时间点进行评估。研究参与的持续时间为基线访问时起24个月。随机分组按年龄(2-3岁与4-5岁)和GMFCS水平(I/II或III/IV)进行分层。

统计学考虑因素-增长(Accrual)

据估计，每个月最多8-12名研究参与者被招募，且约需12-15个月的增长以招募90名参与者。

统计学考虑因素-研究持续时间

每名受试者参与研究为24个月，前12个月期间进行门诊访问且在24个月时进行远程安全性评估。鉴于增长需要长达15个月的时间，据估计在研究开放后39个月(3.25年)时对最后患者进行远程安全性评估。

统计学考虑因素-主要和次要终点

本研究的主要终点是在初始研究输注后12个月儿童的观察的和预期的GMFM-66评分变化之间的差异。本研究提供12个月时分配到hC-MSC、AlloCB和自然病史组的患者中该结果测量的平均值的单独区间估计。本研究的次要终点是hCT-MSC或AlloCB治疗后12个月期间发生的不良事件数量。

统计学考虑因素-样本量和能力计算(power calculation)

选择本研究的样本量以提供估算各研究组中观察的减去预期的12个月GMFM-66变化的平均值的高精度，并提供在输注AlloCB或hCT-MSC后检测常发生的不良事件的高概率。

如下表2所示，每组30名患者的样本量提供了95.8％的检测到10％的输注(hCT-MSC或AlloCB)中发生的常见不良事件的概率。该样本量还提供了78.5％的观察到5％的输注中发生的事件的概率，以及26.0％的观察到1％的输注中发生的罕见事件的概率。

表2：各种不同样本量观察一个或多个事件的概率*

*一个或多个独立事件的二项式概率。

本研究的样本量还必须支持对MSC、AUCB干预后和自然病史组中12个月平均观察的减预期的GMFM-66变化评分的估计。因此，如下使用t分布构建三个区间估计。

误差容限E是置信区间半宽度：

本研究的误差容限选择为2点，置信水平为95％。以下公式迭代求解以获得每个治疗组的样本量。

使用符合本研究的年龄和GMFCS入组标准的36名CP-AC试验中的参与者估算标准偏差s：5.16(95％CI：4.18，6.13)。从20的样本量开始且假设标准偏差为5.16，需要总共3次迭代以达到28的最终组样本量，如下表3所示。

表3:

因此，28名患者的组大小允许对研究组之一(自然病史、MSC或AUCB)的12个月观察的减预期的平均GMFM-66变化评分的估计中的95％置信水平，误差容限不超过2。如上所述，该样本量也符合检测常发生不良事件的合理概率所要求的(N＝30)。最后，如果次要结果测量的标准偏差与来自CP-AC研究的95％置信区间的上限(6.13点)所示的一样高，则126名患者的样本允许三个区间估计值中每一个的误差容限不超过约2.5点。

因此，本研究的总样本量设定为90名患者(每组30名)。

统计学考虑因素-分析方案

分析群体：定义以下群体以支持对主要和次要终点的分析。

意向治疗群体

该群体包括所有入组和根据其指定治疗随机化的参与者。主要终点在该群体中进行评估。

安全性群体

安全性群体定义了进行次要终点评估的患者，并包括接受至少一次输注的所有受试者。安全性群体的分析采用按治疗(as-treated)的途径进行，其根据实际接受的治疗而非他们指定的治疗来考虑每位患者。

分析时机

当最后患者达到其12个月访问时，进行主要和次要结果测量的分析。当最后患者达到其24个月访问时，对安全性分析进行更新。

人口统计学、基线特征和处置

人口统计学数据和基线特征对于所有研究参与者且按照随机化分配单独地进行总结。待检查的特征包括年龄、性别、种族/民族、基线GMFM-66评分、GMFCS水平和CP的病因学。进入和完成研究的参与者人数使用CONSORT指南进行图表说明。

主要和次要终点分析

安全性群体中不良事件的发生率对于所有受试者在表格和图形中描述性地并按照所接受的治疗单独地总结。12个月时平均的观察减预期的GMFM-66变化评分的估计值以及如上所述的95％置信区间在意向治疗群体中报告。

实施例2：hCT-MSC(一种脐带来源的间充质基质细胞产品)在中度或重度缺氧-缺血性新生儿脑病的新生婴儿中的I期研究

目的

该I期研究的目的是评估中度至重度新生儿缺氧-缺血性脑病(HIE)的足月和近足月婴儿中一次和两次人脐带组织来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)静脉内输注(第一次在出生后前48小时内施用，和第二次在出生后两个月龄时施用)的安全性。前三名入组的婴儿仅获取第一早期剂量。次三名入组的婴儿获取两个剂量。

研究基本原理和假设

这一系列研究的机制原理和首要理论是，hCT-MSC可以通过旁分泌和多分泌机制发挥作用以调节脑中正在发生的炎症和/或免疫病理，并可能保护神经元免受进一步损害。该I期临床试验的假设是，在怀孕36周或更晚出生的新生儿中以一个或两个剂量的细胞施用hCT-MSC是安全的(这些新生儿患有中度至重度的缺氧-缺血性新生儿脑病)。

在许多情况下，MSC抑制而非增强免疫和炎性反应。已证明的机制包括效应T细胞的变化，例如调节性T细胞群体的产生和导致抗炎细胞因子的单核细胞/树状细胞细胞因子产生的变化。因此，将MSC群体视为免疫和/或抗炎剂是合理的。新生儿HIE的动物模型显示小胶质细胞激活增加的证据。另外，中性粒细胞在中枢神经系统血管系统中积累。骨髓细胞、T细胞和自然杀伤细胞在恢复期中浸润大脑的受损区域，表明免疫和/或炎性介导的脑损害在上述ASD的病因学中发挥作用(Hagberg，2015年)。因此，hCT-MSC由于MSC的免疫调节活性可能是HIE的候选疗法。此外，多重给药方案可提高整体反应率和持续时间。

研究目的

确定HIE新生儿中单次和重复静脉内剂量的hCT-MSC的安全性。

风险和利益

与hCT-MSC输注相关的潜在风险包括对产品的反应(皮疹、气短、喘息、呼吸困难、低血压、口、喉或眼周围肿胀、心动过速、发汗)、感染的传播和HLA致敏。必须考虑但不与人体中MSC施用相关的理论风险包括免疫抑制和异位组织形成的可能性。从用于制造hCT-MSC的供体脐带组织收集的脐带血进行感染筛查，且产品必须符合输注前的交付标准(如下所述)。除在出生后第一天hCT-MSC剂量之前单剂量的氢化可松或在第二次hCT-MSC输注前的甲泼尼龙和苯海拉明外，参与者在hCT-MSC细胞输注之前或之后不接受免疫抑制治疗。

这种干预的潜在益处包括hCT-MSC可通过直接或间接机制诱导降低参与者的HIE相关病理并改善受缺氧-缺血性损伤影响的能力(特别是运动和/或认知功能)的改变的可能性。

研究设计—总体设计

本研究为I期前瞻性、开放标签试验，其设计为评估接受治疗性低温的具有中度至重度HIE的新生儿中一个或两个静脉内剂量的hCT-MSC的安全性。患有中度至重度缺氧缺血性脑病且正在接受治疗性低温的在36 0/7周妊娠或更晚出生的儿童有资格参与。所有参与者接受hCT-MSC的静脉输注。第一群组的三名患者在出生后前48小时内接受单一剂量。如果不存在安全性问题，第二群组的三名患者接受两个剂量，第一剂量在出生后前48小时内给予和第二剂量在第一剂后约两个月给予。所有参与者接受用于治疗中度至严重的新生儿脑病的低温，如通过基于Eunice Kennedy Shriver NICHD Neonatal Research Network'sOptimizing Hypothermia多位点临床试验中使用的标准(Shankaran等，JAMA 2014，312(24):2629-2639)的长期使用的Duke Intensive Care Nursery标准指示的。主要终点是安全性，为此评估急性输注反应和感染发生率。在基线和基线起六个月和一年评估HIE特异性结果测量(如下所述)，并描述结果。

研究流程图见图2。

研究设计-研究终点

本研究的主要终点是安全性，其包括评估急性输注反应和感染的发生率。

此外，评估HIE-和HIE相关的并发症以描述产品施用后的任何状况变化。死亡或中度-重度损害作为次要结果收集。这用Bayley III评分在所有三个领域中确定。我们报告所有入组婴儿的所有分数，且也报告多少个具有所有三个Bayley III领域评分大于或等于85的婴儿存活。NICU结果也视为次要结果，包括死亡率、癫痫发作、肺动脉高血压、需要一氧化氮和需要ECMO、需要出院时G管喂养以及出院时抗癫痫药物治疗。

主要安全性终点：将通过以下评估：

1.输注反应的发生率：对于本研究，输注反应被定义为具有临床症状的过敏或过敏样反应，包括皮疹、支气管痉挛、血管性水肿、心肌梗塞、心律失常和急性肺损伤。

2.感染的发生率：对于本研究，记录为安全性终点的感染被定义为在hCT-MSC施用后两周内通过培养或分子方法确认的细菌、病毒或真菌感染。

次要/探索性终点：

除了安全性量度，评估以下HIE特异性的终点：

1.首次住院的出院前死亡

2.出院回家时需要抗癫痫药物治疗

3.出院回家时需要g管或其他非口腔饲喂

4.肺动脉高血压(定义为临床医生在hCT-MSC输注后开始使用吸入型一氧化氮)

5.hCT-MSC输注后，出于任何原因需要体外膜氧合(ECMO)。

6. 1年(出生后12-16个月)的认知、语言和运动发育的Bayley III评估。

研究参与者的选择和退出—研究群体

患有中度至严重HIE的6名新生儿，接受HIE的治疗性低温治疗。

研究参与者的选择和退出—入组标准

1.分娩时妊娠第36 0/7周或以上。

2.能够在出生后前48小时内接受一剂hCT-MSC，且对于第二群组的3名婴儿，在第一次输注后两个月可进行第二次细胞输注(此时一些婴儿可能是门诊病人)。

3.愿意返回进行一年评估。

4.使用Network's Optimizing Cooling研究中使用的两步骤(A和B)方法在6小时龄内脑病的迹象，临床医生决定对中度或重度缺氧缺血性脑病开始治疗性低温治疗，如通过临床用于确定治疗性低温适合性的检查确定的(Shankaran等，JAMA 2014，312(24):2629-2639)。用于确定低温使用的在Duke进行的检查由在Network's Optimizing Cooling试验中接受过培训和认证的NNP或MD进行，或由训练的检查人员讨论和审查。检查在DukeElectronic Health Record使用“智能短语(smart phrase)”进行记录。

治疗性低温的适合性标准详细为：

■婴儿分两步进行评估；根据临床和生化标准进行评估(步骤A，其为A1或A2，取决于可用信息和血气异常的严重程度)，然后进行神经学检查(步骤B)

■一旦婴儿符合A1或A2，进行神经学检查。(参见部分B)

○定义为癫痫发作的中度/重度脑病(“2”或“3”)的存在或者下表中6个类别的3个中的征兆的存在。对于具有超过一个项目的类别，如PRIMITIVE REFLEXES，最高评分的项目(SUCK,MORO)决定分配到该类别的脑病水平。

○神经学检查由医生检查者或非医生检查者进行，其与决定使用治疗性低温的临床医生审查资格检查。

步骤A1和A2。所有婴儿进行以下评估：

婴儿是否妊娠≥36周？

是否有急性围产期事件(胎盘早剥、脐带脱垂、严重FHR异常：可变或晚期减速)的历史？

在10分钟时Apgar评分<5或者持续需要在出生时开始和持续至少10分钟的通风？

脐带pH或小于1小时时出生后第一血气的pH值是多少？

脐带气或小于1小时时出生后第一血气的碱缺失是什么？

如果婴儿符合标准A1或A2(见下文表4和表5)和标准B且不符合排除标准，则婴儿有资格且因此适合于参加研究。

表4：

表5：B部分：神经系统评估

研究参与者的选择和退出–排除标准

1.主要先天性或染色体异常

2.严重生长受限(出生体重<1800克)

3.主治新生儿专家认为该研究可能干扰受试者的临床治疗或安全性的意见

4.无进一步治疗计划的濒死新生儿

5.母亲有未知的乙型肝炎或艾滋病血清的婴儿

6.已知为HIV、乙型肝炎、丙型肝炎的母亲或在怀孕期间具有活性的梅毒或CMV感染的母亲所生婴儿

7.疑似严重败血的婴儿

8.在生命的前48小时内开始或可能开始的ECMO

9.在前60分钟内完成的所有血气(脐带血和出生后)的pH大于7.15，且碱缺失<10mEq/L(来源可以是动脉、静脉或毛细血管)

10.母亲在本次怀孕期间明确的寨卡病毒感染

11.收集的自体脐带血可得且可用于自体容积和红细胞减少的脐带血细胞的随机化试验(clinicaltrials.gov识别号NCT02612155)

已知可能发生其他状况，并且在第二次输注前先天性病症(遗传性或获得性)可能变得明显，以下排除标准添加到上述11项标准中并应用于第二次输注。

1.感染的：

a.已知的活性CNS感染

b.基于记录或临床评估的不受控感染的证据

c.已知的HIV阳性

2.医学的：

a.已知的代谢障碍

b.已知的异常甲状腺功能(可能包括具有治疗的甲状腺功能低下及TSH正常的患者)

c.已知的线粒体功能障碍

d.不稳定型癫痫症或不受控的癫痫发作障碍、婴儿痉挛、Lennox Gastaut综合征、Dravet综合征或其他类似的慢性癫痫发作障碍的病史

e.化学疗法治疗的活动性恶性肿瘤或先前的恶性肿瘤

f.原发性免疫缺陷障碍史

g.自身免疫性细胞减少症史(即，ITP、AIHA)

h.将使儿童面临研究程序的并发症的更高风险的并存医学状况

i.可能需要未来干细胞移植的并发遗传性或获得性疾病或共病

j.已知的严重感觉障碍(例如，失明、耳聋、未矫正的听力障碍)或运动障碍

k.根据血清肌酸酐>1.5mg/dL或总胆红素>1.3mg/dL确定的肾功能或肝功能受损，已知患有吉尔伯特病的患者除外

l.严重血液异常，定义为：血红蛋白<10.0g/dL，WBC<3,000细胞/mL，ALC<1000/uL，血小板<150x 10e9/uL

m.如通过PI或其他调查人员(包括在识别与神经发育状况相关的畸形特征方面经过培训的医学遗传学家和精神病学家)评估的表明遗传综合征的临床相关身体形态异常的证据。

3.当前/先前治疗：

a.先前细胞治疗史

b.目前或之前使用IVIG或其他抗炎药物治疗(NSAID除外)

c.当前或先前的免疫抑制治疗

d.无持续超过2周的系统性类固醇治疗；允许局部和吸入性类固醇。

研究参与者的选择和退出–研究参与者的招募和筛选

我们对所有接受到Duke重症监护病房的妊娠超过35 6/7周的婴儿进行筛查，临床小组决定为这些婴儿提供用于中度至重度新生儿缺氧-缺血性脑病的治疗性低温治疗，并且在出生后前6小时中开始或将开始降温。

如果目前登记的新生儿HIE自体脐带血细胞的随机试验未收集到脐带血(见上文排除标准)，临床护理小组向合格的新生儿家庭介绍本次同种异体hCT-MSC的I期研究的基本概念。如果家人有兴趣了解更多，临床小组的成员联系研究小组。研究小组的成员随后与潜在合格婴儿的家庭联系以详细讨论该研究，并讨论婴儿参与研究的同意。

研究参与者的选择和退出—研究参与者的提前退出

从实验方案治疗中移除的标准：

1.在进行评估或研究的同时遗传性或传染性疾病的诊断。

2.排除参与研究的医学状况的变化。

脱离实验方案治疗的患者应追踪直至其符合脱离研究标准(见下文)。除非撤回同意，否则对脱离实验方案的参与者获得随访数据。在第一次或(如果在第二群组中)第二次hCT-MSC输注之前脱离研究的受试者被视为不可评估，且可由另一受试者替代。

脱离研究标准：

1.死亡。

2.失访。

3.撤回对任何进一步数据收集的同意。

4.完成最终研究访问。

研究产品-人脐带组织来源的间充质基质细胞(hCT-MSC)

hCT-MSC是从经消化的脐带组织制备的同种异体细胞的产物，其在培养中扩增、冷冻保存和库存。hCT-MSC由捐赠给Carolinas脐带血库(杜克大学医学中心的FDA许可的、FACT认证的公共脐带血库)的脐带组织在婴儿母亲书面知情同意后制备。脐带组织从正常足月妊娠后通过选择性剖腹产分娩的男性婴儿的胎盘获取。供体筛查问卷由母体捐献者完成，且母体血液由位于Charlotte,NC的美国红十字会的CLIA认证的供体筛查实验室进行传染病测试。供体必须有资格捐献给公共脐带血库供同种异体使用。在胎盘和脐带交付后，脐带血从胎盘无菌地排出。然后将脐带干燥和用chloropreps清洗，从胎盘底部分离，置于含Plasmalyte A的无菌瓶中，并在室温下在验证的容器中运输至Marcus Center forCellular Cures(MC3)GMP细胞处理实验室。

在洁净室生产间中，脐带组织在生物安全柜中从培养基中取出，放入无菌盘中，切成小块，且然后切碎和在Miltenyi Biotec GentleMacs Octo Dissociator中用GMP级酶(透明质酸酶、DNase、胶原酶、木瓜蛋白酶)消化。将所得细胞悬液置于含有1％血小板裂解物的Prime XV MSC Expansion XSFM(Irvine Scientific)培养基的培养物中，并生长至汇合(约7-14天)以建立P0培养物。为了建立主细胞库，收获P0和在具有Cryostor 10介质(BioLife)的冷冻瓶中冷冻保存，并储存在液氮的蒸气相中。P1和P2培养物在类似条件下，在无血小板裂解物的hyperflasks或hyperstacks中生长，分别如建立工作细胞库和用于施用的产品所需要的。使用TrypLE(Gibco)从塑料培养器皿取出来自P1和P2的细胞。最终产物源自于P2培养物，其收获到具有5％人血清白蛋白的plasmalyte中，洗涤并在5mL中含有5,000-1亿细胞的5隔室冷冻袋(Syngen)中冷冻保存，最终浓度的10％DSMO和葡聚糖(AkronScientific)。施用当天，将一个隔室解冻，在6-9ml的plasmalyte-A+5％HSA IV溶液中稀释，放入注射器或袋中，并运送至床侧用于在30-60分钟内施用。

在每一次传代中，细胞产物通过用流式细胞术评估细胞表面表型及通过经由T细胞增殖和小胶质细胞激活的器官型模型进行的功能分析来表征。在P2冷冻保存之前，还对每一批次进行无菌性、内毒素和支原体测试，且这些测试必须符合规范。对于给药，解冻和稀释后的交付测试包括TNCC、通过细胞计的存活力、革兰氏染色和内毒素。根据解冻后计数，参与者给予2x10

本临床试验选择一个批次的hCT-MSC。根据下表6，该批次对每一剂量水平在1-2名患者中进行测试。共6名参与者用2个给药方案治疗。对于计划接受两个剂量的三名参与者，每个剂量由2x10

表6

研究产品-供体筛选和测试

由于本研究使用的脐带组织从同意向Carolinas脐带血库捐赠脐带血的供体获得，他们按照Carolinas脐带血库标准操作程序接受供体筛查和传染病测试。脐带血相关的母体样品和脐带组织MSC样品作为参考样品保留以供作为本研究部分的将来测试。

根据Carolinas脐带血库标准操作程序进行供体筛查和测试以满足21CFR Part1271的所有要求。筛查和测试符合最新推荐，并获得FDA第1870号生物许可的批准。脐带血的母体供体进行HIV-1、HIV-2、乙型肝炎病毒(HBV，表面和核心抗原)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒密螺旋体(梅毒)、CJD(仅筛查)、查加斯病、人类嗜T淋巴细胞病毒1型和2型(HTLV-1、HTLV-2)和CMV的筛查和测试。还对母体血液进行HIV-1/2/O、HBV、WNV和HCV的核酸检测。还对母体供体进行了寨卡病毒筛查和测试。

研究产品-处理和最终制剂

hCT-MSC由单一脐带组织经一系列的三个步骤制造，其产生主细胞库、工作细胞库和研究产品。用于每一步骤的产品被冷冻并储存在液氮冷冻器中的蒸气相中。在P2时，代表性的冷冻袋进行解冻和在研究参与者输注该批次产品之前鉴定。测试包括细胞计数、存活力、表型、功能测定、内毒素、支原体、革兰氏染色和无菌性。

在输注当天，细胞根据SOP CT2-MSC-006解冻，在10-40ml的plasmalyte-A+5％HSA溶液中稀释，并取出等份试样用于细胞计数、存活力和无菌培养。如果细胞≥70％存活，则调整最终产品体积以向研究受试者递送2x10

在测试解冻后细胞计数和存活力后，hCT-MSC最终产品有条件地交付用于施用于患者。最终交付在研究产品的14天无菌培养期后进行。在产品施用后无菌培养物转为阳性的情况中，对生物体进行鉴定并进行抗生素敏感性测试。研究人员将告知在研究中照顾婴儿的临床医生培养结果。对于第二次输注(其对某些婴儿可能发生在门诊环境中)，将联系患者的家人以确定其是否有症状(例如，发热)。为受试者提供初级保健的临床医生评估对临床评估和治疗的需求。所有接受后续无菌检查阳性的产品的患者在观察到阳性无菌检查后的14天内由研究小组成员进行每日接触。

研究产品-研究产品的包装

所有脐带组织分配ISBT Demand 128条形码标签或唯一标识符，其用于所有处理中和最终的hCT-MSC产品。另外，MC3 GMP设施为每个hCT-MSC产品提供最终产品标签。产品标签包括粘贴条形码标签的空间以及用于受试者编号、产品到期日期和时间以及任何其他相关信息的空间。在受试者入组时，分配受试者编号，其与分配给脐带血组织的12位ISBT数字条形码编号相关联。最终产品分配一个批号(生产操作编号)及失效日期和时间，其在分析证书和产品标签上注明。受试者编号和产品的ISBT条形码编号也列在分析证书上。所有产品通过信使在验证的冷却器中从Marcus细胞治疗中心的GMP实验室运送至重症监护病房(第一剂量)或Valvano Day医院(第二剂量，如果婴儿作为门诊病人给药)。

研究产品-接受者的母体的筛查

由于加入研究的婴儿接受细胞产品，法规要求细胞受体婴儿的母亲如同其子女向脐带血库捐献一样接受筛查。对于入组婴儿的母亲也需要进行针对脐带组织供体母亲描述的所有测试(HIV-1、HIV-2、乙型肝炎病毒(HBV，表面和核心抗原)、丙型肝炎病毒(HCV)、梅毒密螺旋体(梅毒)、CJD(仅筛查)、查加斯病、人嗜T淋巴细胞病毒1型和2型(HTLV-1型、HTLV-2型)和CMV)。对HIV-1/2/O、HBV、WNV和HCV和寨卡病毒进行核酸检测。入组婴儿的母亲还必须响应和完成由母亲填写的健康问卷，以允许收集、处理、储存和/或同种异体使用其婴儿的脐带血或脐带组织。作为本研究的部分，获得的样品作为参考样品保留以供将来测试。

研究产品-研究产品的施用

对于符合入组标准的婴儿，第一剂量的细胞在治疗性低温期间尽快静脉输注，目标是出生后的前48小时内。对于第一次输注，如果受试者未因为临床目的使用氢化可的松，则婴儿在每次输注前用氢化可的松1mg/kg IV预处理30-60分钟。生命体征(心率、血压、温度、呼吸率)如临床指示的在重症监护病房进行监测。在整个输注过程中以及输注后至少60分钟内，持续监测脉搏血氧仪。在第一小时内，每15分钟观察受试者并记录生命体征，然后在接下来的四个小时内按照护理标准进行记录。

对于第二次输注，一些研究受试者可能已出院回家。这些患者在计划的输注当日入住输液中心。如果患者无法保持静止或配合，则在IV放置前可能需要一些镇静。外周IV由临床或研究人员放置。根据新生儿期后细胞输注的标准程序，患者使用0.5mg/kg/剂IV的苯海拉明和0.5-1mg/kg IV的甲泼尼龙预先用药。hCT-MSC在30-60分钟内静脉内施用。生命体征(心率、血压、温度、呼吸率)在到达诊所时监测，并根据临床指示进行监测。在整个输注过程中以及输注后至少5分钟，持续监测脉搏血氧仪。患者观察输注后至少一小时。

研究产品-安全性随访

在每次输注后的第1天，研究人员观察参与者以评估任何与输注相关的不良反应或并发症。对于接受第二次输注的受试者，研究人员在输注后1天通过电话或电子邮件与父母或监护人进行随访。在每次施用hCT-MSC后14天，研究小组的成员通过电话或电子邮件联系临床工作人员(如果患者仍在重症监护病房)以及父母或监护人，以评估患者状态和任何不良事件。在初始剂量后2周、2个月、6个月和12个月进行问卷调查以评估严重不良事件。

研究计划-概述

具有符合入组标准的新生婴儿的父母/监护人由其婴儿的临床护理人员告知该研究可用。初步接触后，潜在研究参与者的父母/监护人与研究人员进行初步电话或面谈以描述该研究、验证基本资格标准并确认其参与兴趣。

一旦所有筛查完成且患者可能符合研究标准，临床小组向其家庭介绍该研究。如果父母向临床小组表达了对研究的兴趣，研究小组尝试通过研究人员获得知情同意。如果儿童被视为合格且父母同意，则其被入组到研究中并安排接受hCT-MSC输注。参与者在每次输注后的一天现场或通过电话评估，并在每次输注后14天联系床侧护理人员和/或父母进行后续安全性评估。第二批的三名参与者，如果从医院出院，在出生后的前48小时内的细胞输注后2个月返回Duke进行计划的hCT-MSC输注和监测。所有参与者在初始剂量后六个月和一年时返回Duke's Special Infant Care Clinic进行后续评估用于进行重复的神经发育评估和安全性随访。

研究计划-参与者筛选

要求豁免HIPAA授权和知情同意以允许研究人员对符合入组标准且不符合排除标准的婴儿进行入住Duke重症监护病房的筛查。如果未确认排除标准，研究人员联系潜在受试者的临床医生讨论临床试验适格性。患者必须获得研究小组和临床小组两者的批准以继续进行研究登记。如果在筛查过程中出现对先前未诊断的病症或遗传发现的担忧，这一问题与患者的父母/监护人进行讨论，并转介至适当的医疗或精神病学提供者进行评估和治疗(如有指示)。

研究计划-hCT-MSC输注

所有受试者接受至少一次同种异体hCT-MSC细胞输注。在输注当天，hCT-MSC细胞解冻和由MC3 GMP实验室按照标准操作程序进行制备，并在Duke重症监护病房或受研究小组和儿童血液和骨髓移植项目工作人员监督的诊所提供用于患者的输注。获得基线生命体征(心率、血压、温度、呼吸率)。如果无法获得用于hCT-MSC的输注的IV，则由临床工作人员、麻醉人员或研究小组的成员放置外周IV。

在细胞输注前，施用预先用药(用于出生后前48小时输注的氢化可的松，和用于两个月输注的苯海拉明和甲泼尼龙)。hCT-MSC在30-60分钟内输注。儿童在重症监护病房或诊所观察输注后至少1小时。提供1.5倍维持的IV液体(D51/2NS)。

接受两个月剂量的患者在至少1小时后出院，前提是所有生命体征处于基线且他们无症状及无毒性的证据。研究人员在输注后第二天对患者进行评估以评价任何输注相关的不良反应或并发症。研究人员与父母/监护人打电话评估输注安全性在输注后14天进行。

对于两个月输注，如果患者在计划输注当日有疾病迹象，包括但不限于发热>38.5℃、呕吐、腹泻或呼吸窘迫，则输注被推迟。

研究计划-意外事件期间的护理

如果患者在他/她的hCT-MSC输注过程中出现过敏反应的迹象或症状，包括荨麻疹、呼吸困难或呼吸状况恶化(呼吸支持增加，在输注过程中fiO2的绝对增加超过10％；输注过程中需要开始吸入一氧化氮)、咳嗽、喘息或呕吐时，终止输注并开始适当的药物治疗。

研究计划-基线实验室测试

进行以下基线实验室评估：

母体基线

●母体血液的ARC供体组测试

●母体ARC供体医疗史问卷

所有参与者在出生后前48小时内施用的剂量前的基线

●参与者的HLA分型(通过口腔拭子)

●具有差分的CBC(SOC的部分)

●化学组，包括胆红素(SOC的部分)

●类型和筛选(SOC的部分)

参与者群组2—第二次输注；2个月龄的第二次输注前得出的实验室。

●具有差分的CBC

●完全代谢组

●反应性抗体组

输注期间和之后的监测—生命体征

生命体征在输注前、输注后60分钟及此后按照医院常规进行评估。

输注期间和之后的监测—代谢状态

中度至重度HIE的婴儿在低温治疗时常规获得每日化学检查。血清电解质、CBC、BUN和肌酸酐以及通常肝功能测试在基线时和然后每天进行监测。我们在病例报告表中记录在降温期间和重新升温后的前24小时为临床目的收集的代谢实验室结果。

输液期间和之后的监测—呼吸状态

中度至重度HIE的婴儿中每日血气是标准的。病例报告表中收集在降温期间和重新升温后前24小时内为临床目的获得的每日血气的结果。

输液期间和之后的监测—神经系统状态

在基线时、每天降温期间和出院时进行神经系统评估。这由经过训练的检查人员进行。

输注期间和之后的监测—血液学状态

对于患有HIE的婴儿，凝血研究的监测被视为常规的。在降温期间和重新升温后的前24小时内为临床目的获得的PT/PTT结果记录在病例报告表中。

输注期间和之后的监测—神经影像

HIE新生儿常规获得MRI。本研究记录护理标准MRI的结果，且我们记录和报告关于从图像的临床解释中提取由NICHD Neonatal Research Network(NRN)开发的损伤评分的结果(Shankaran等，Archives of Disease in Childhood,Fetal and Neonatal Edition2012,97(6):F398-404)。

输注期间和之后的监测–输注后评估

输注后评估：

●输注后24小时评估

●每次输注后14天：(电话或现场)问卷。

●2个月龄：(电话或现场)问卷。

●6个月龄：现场评估，包括从所有参与者获得的样品的实验室研究(CBC w/diff、CMP、直接和间接Coombs、PRA)和问卷。

●12-16个月龄：现场评估，包括Bayley III检验、及实验室(CBC w/diff、CMP、直接和间接Coombs、PRA)和问卷。

统计学考虑因素-研究设计

本研究为I期前瞻性、开放标签试验，其设计为评估在中度至重度HIE新生儿中一个和两个静脉内剂量的hCT-MSC的安全性。治疗性低温治疗的中度至重度新生儿HIE的新生婴儿可能有资格参与。所有参与者接受hCT-MSC的静脉内输注。第一群组的三名患者接受单剂量。如果不存在安全性问题，第二群组的三名患者接受在大约两个月龄时给予的第二剂量。主要终点是安全性，对于此从住院期间收集的数据以及从电话和现场调查评估急性输注反应和感染发生率。评估上述生命体征、代谢、呼吸、神经和血液结果。初始hCT-MSC输注后十二(12-16)个月的神经发育后果及结果进行描述。

统计学考虑因素-增长

据估计，每月约有一名研究参与者被纳入，且招募6名受试者需要约6-8个月的增长期。为确保参与者的潜在研究治疗相关风险最小化，在后续群组中的第一受试者给予最终剂量之前，在一个群组的最终剂量后观察至少一个月的间隔时间。例如，受试者#3(群组1中的最后一名受试者)接受hCT-MSC输注的时间至受试者#4(群组2中的第一名受试者)接受第二次hCT-MSC输注之间有至少一个月。

统计学考虑因素-研究持续时间

研究参与者在施用其最终剂量的hCT-MSC后，跟踪安全性10-12个月。如果任何常规访问被遗漏或重新安排，在每次输注后14天和2个月时进行随访问卷调查以评估安全性结果和整体进展。在6个月和12个月(12-16个月)进行现场评估，这是特殊婴儿护理诊所的通常临床访问以评估进展的时间。

统计学考虑因素–人口统计学和基线特征

总结所有研究参与者的人口统计学数据和基线特征。记录母体特征，包括母亲年龄、种族、孕次/胎次状况。记录的妊娠并发症包括慢性高血压、1型或2型糖尿病、甲状腺功能亢进/减退、先兆子痫和产前出血)。记录母体药物治疗(慢性和产时)。记录母体分娩并发症(胎儿心率减速、脐带脱垂、子宫破裂、胎盘早剥、母体发热、肩难产、母体出血)。待检查的研究受试者的特征包括孕龄、性别、种族/民族和脑病的基线水平(根据NICHD研究标准，中度或重度)、出生时与出生后状态、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟和20分钟Apgar评分、合格的血气和神经系统评估详情。还记录复苏的详情(需要正压和机械通气、复苏期间需要药物治疗、降温和细胞输注)。记录降温期间的药物治疗和通气需求，以及首次输注时的特定呼吸支持和药物使用。

统计学考虑因素-主要终点

主要安全性测量是输液反应和输注后感染的发生率。这在输注时、每次输注后24小时、每次输注后14天、临床小组的任何返回评估时以及6名受试者每个的最终输注后6个月(前3名受试者仅接受一次输注，因此在这一单次输注后12个月收集并报告感染和输注反应，第二次记录在12-16个月神经发育评估访问时)进行评估。对于在2个月时接受第二次输注的后三名婴儿，收集并报告感染和输注反应直至参与者12-16个月大。主要和次要后果的结果描述性地报告。

统计学考虑因素-样本量和能力计算

考虑到研究设计，选择的样本量基于临床判断，而非统计学考虑因素。

统计学考虑因素-次要终点

次要功效终点包括第一/最终剂量后12个月(12-16个月龄)的存活率和神经发育评估、出院时的年龄、出院时的神经系统检查、出院时抗癫痫药的需要、出院时的非口服进食、经超声心动图确认并根据吸入一氧化氮的需要确定的肺动脉高血压以及对ECMO的需要。

对于神经发育评估，婴儿在运动、认知和语言发展三个领域获得Bayley III神经发育评估结果。

探索性终点使用汇总表、图形和数据清单进行报告。使用描述性统计和统计学检验(视情况而定)对结果进行总结。连续性次要终点使用平均值、标准偏差、CV％、中值、最小值和最大值进行总结。还提供距基线的变化的总结以包括95％置信区间和与配对t检验相关的p值。如果数据不是正态分布，我们使用转换来近似正态分布或使用非参数检验。在细胞输注之前、期间和之后，将评估生命体征的从基线的变化。

分类探索性终点通过显示每一类别中的数量(频率)和百分比进行总结。分类数据以频率和百分比表示。在适当的情况下，可产生分类结果的从基线变化的变动表。待评估的特征随时间的变化包括：在细胞之前未进行机械通气的婴儿是否需要机械通气、未接受一氧化氮的婴儿是否接受一氧化氮、未接受抗癫痫药物治疗的婴儿是否随后被诊断为癫痫发作并接受抗癫痫药物治疗。

所有统计学检验使用0.05的α水平来表明显著性。对于次要功效后果，不存在预先规定的分级评估顺序，也不进行多次测试的显著性水平的调整。