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一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用

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本发明属于基因工程领域，提供了一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用。本发明为了获得一种可用于新冠病毒致病机理、药物及疫苗研发的动物模型，以mT/mG小鼠作为实验动物，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过将3’端带有polyA序列的人的血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列插入到小鼠内源血管紧张素转换酶mACE2起始密码子之前的方法，获得了一种可红‑绿荧光转换的新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型，该模型解决了hACE2随机插入及小鼠内源ACE2蛋白表达的问题，并且能够实现对病毒感染过程的跟踪、定位和检测，可极大方便后续的研究和应用。

著录项

公开/公告号CN112226464A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-15

原文格式PDF
申请/专利权人哈尔滨工业大学;
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申请/专利号CN202010974969.4
发明设计人韩正滨;李佳琪;于浩然;汪梦芸;何佳;吴琼;
展开▼

申请日2020-09-16
分类号C12N15/89(20060101);C12N15/877(20100101);A01K67/027(20060101);
代理机构23211 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司;
代理人邓宇
地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大直街92号
入库时间 2023-06-19 09:33:52

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

动物模型是新冠病毒药物、疫苗研发的关键一环，也是深入开展病毒致病机理等研究必不可少的工具。非人灵长类动物(如猴子)虽然更接近人类，但由于价格高、周期长、操作不便等问题，不适合普遍推广和应用。小鼠作为最常用的实验动物，仍然是动物模型的首选，但由于病毒受体(ACE2)结构与人的存在较大差异，导致小鼠对于新冠病毒不易感，不能直接应用于实验。

与SARS病毒类似，新冠病毒(COVID-19)也是通过人类细胞表面受体蛋白ACE2介导入侵细胞。之前在研究SARS的过程中，国内外已建立了几个表达人源ACE2的小鼠模型，如McCray等(2007)、Tseng等(2007)以及我国协和医科大学(2007)、军事医学科学院(2008)等单位均建立了hACE2小鼠。这些小鼠模型的共同缺陷就是hACE2的随机插入导致整合位点和拷贝数都无法控制，一方面，随机插入可能对小鼠造成潜在的负面影响；另一方面，人源ACE2表达的同时小鼠內源ACE2也同样表达，很可能造成小鼠模型不能很好地再现人类的疾病特征。更为重要的是，这些传统的小鼠模型无法快速、直观反映病毒感染情况，也无法实时研究病毒感染过程。

发明内容

为了解决现有的新冠病毒人源化受体小鼠模型hACE2随机插入及小鼠内源ACE2蛋白表达的问题，本发明提供了一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法，构建策略如图1所示，具体方法如下：

1)gRNA的设计：在小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子起始密码子ATG附近设计2个gRNA位点；

2)Donor DNA的设计：将人源血管紧张素转换酶hACE2的上游同源臂、人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列、polyA序列和人源血管紧张素转换酶hACE2的下游同源臂连接作为Donor DNA片段；

3)显微注射：将步骤1)获得的2个gRNA、步骤2)获得的Donor DNA、Cas9蛋白及Microinjection buffer混合，注射到mT/mG小鼠受精卵的原核中，得到胚胎；

4)胚胎移植：将步骤3)获得的胚胎继续培养至2-细胞后，进行输卵管移植，再将2-细胞胚胎移植到假孕母鼠的输卵管中，由母鼠继续饲养，直至仔鼠出生；

5)基因型鉴定：对步骤4获得仔鼠的基因型进行鉴定，带有人源血管紧张素转换酶hACE2基因序列的仔鼠即为新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型。

在本发明的一个实施例中，所述小鼠血管紧张素转换酶mACE2基因第二外显子的序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地限定，步骤1)中的两个gRNA分别为gRNA-1和gRNA-2，所述gRNA-1序列如SEQ ID No.1所示，所述gRNA-2序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地限定，步骤2)中人源血管紧张素转换酶hACE2的CDS序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地限定，步骤2)中所述上游同源臂序列如SEQ ID No.11所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.12所示。

进一步地限定，上游同源臂引物-F如SEQ ID No.13所示，上游同源臂引物-R如SEQID No.14所示，下游同源臂的引物-F如SEQ ID No.15所示，下游同源臂的引物-R如SEQ IDNo.16所示。

进一步地限定，所述Donor DNA的序列如SEQ ID No.17所示。

在本发明的一个实施例中，步骤3)是将gRNA-1、gRNA-2、Donor DNA和Cas蛋白按照5:5:2:25的终浓度比混合。

在本发明的一个实施例中，步骤3)中所述的小鼠受精卵在显微注射前经37℃孵育15分钟。

本发明还提供了由上述构建方法获得的新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型在新冠病毒致病机理研究、药物或疫苗研发中的应用。

有益效果

本发明提供的一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法是采用基因编辑技术，用人源血管紧张素转换酶hACE2编码区替换小鼠自身的血管紧张素转换酶mACE2基因的表达，不但解决了现有新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型存在的hACE2随机插入导致整合位点和拷贝数都无法控制以及人源ACE2表达的同时小鼠內源ACE2也同样表达，很可能造成小鼠模型不能很好地再现人类的疾病特征的问题，而且通过以带有荧光转换元件的小鼠为实验动物，已感染细胞(绿色)和未感染细胞(红色)能够被区分，使得获得的小鼠模型能够实现对病毒感染过程的跟踪、定位和检测，可极大方便后续的研究和应用。

附图说明

图1.hACE2基因敲入策略；

图2.Donor DNA的获得过程；

图3.mT/mG荧光转换原理及胚胎细胞荧光转换实例；

图4.仔鼠的基因型鉴定结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。

实施例1：

1.gRNA的设计

通过多工具预测和综合分析，可知小鼠mACE2有3个转录本，本发明在mACE2基因的第二外显子起始密码子ATG附近筛选出潜在高靶向性、低脱靶风险的2个gRNA位点，这样可以将包括ATG在内的22bp序列完全敲除，进一步确保了小鼠內源性ACE2不能表达。gRNA-1的种子序列如SEQ ID NO.1所示，即为GGATGGGATCTTGGCGCACG；gRNA-2的种子序列如SEQ IDNO.2所示，即为GAAAGATGTCCAGCTCCTCC；敲出掉的22bp序列如SEQ ID NO.3所示，即为ACGGGGAAAGATGTCCAGCTCC；包含起始密码子的第二外显子序列如SEQ ID NO.4所示。

2.Donor DNA的设计

我们首先从购买的hACE2质粒中，克隆了hACE2的CDS及polyA序列，经测序验证序列完全正确，所述hACE2质粒购自维真生物科技有限公司，产品名称为ACE2，产品编码为NM-021804，hACE2的CDS序列如SEQ ID NO.5所示，polyA序列如SEQ ID NO.6所示，所用引物hACE2-F和hACE2-R的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，此外，在设计hACE2的引物时，在hACE2的下游加入了Flag标签和6×His标签，以便后期检测，Flag标签的序列如SEQID NO.9所示，6×His标签的序列如SEQ ID NO.10所示；根据gRNA切割位点，分别设计了pCE-zero载体的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂的长度为980bp，序列如SEQ IDNO.11所示，下游同源臂的长度为978bp，序列如SEQ ID NO.12所示；利用同源重组法，将上游同源臂序列、hACE2序列、polyA序列和下游同源臂序列按顺序连接在一起，并克隆到pCE-zero载体，所用到的上游同源臂引物-F序列如SEQ ID NO.13所示，上游同源臂引物-R序列如SEQ ID NO.14所示，下游同源臂引物-F序列如SEQ ID NO.15所示,下游同源臂引物-R序列如SEQ ID NO.16所示。经转化大肠杆菌并对菌落单克隆进行PCR检测和测序鉴定，最终获得序列完全正确的重组质粒。以此质粒为模板，扩增出包含上游同源臂、hACE2+polyA和下游同源臂的DNA片段，纯化后作为Donor DNA，所述Donor DNA的序列如SEQ ID NO.17所示，PCR扩增的实验结果如图2所示。本实验过程中用到的试剂盒为Vazyme公司ClonExpressUltra One Step Cloning Kit试剂盒(C115)。

3.显微注射及胚胎移植

本发明以mT/mG小鼠为实验动物，此小鼠在基因组Rosa26安全位点已预置有荧光转换元件。如图3所示，其荧光转换原理简而言之，是利用Cre/loxP重组酶系统，在红色荧光蛋白基因tdTomato的两侧加入loxP位点，并在绿色荧光蛋白基因EGFP上游加入STOP转录中止序列。正常情况下，启动子CAG启动tdTomato的转录而表达红色荧光蛋白，而由于STOP序列的存在，绿色荧光蛋白不表达，因此细胞呈现红色荧光。而当引入Cre重组酶后，其会特异性作用于loxP位点，从而切除tdTomato和STOP元件，从而表达绿色荧光蛋白，使细胞荧光由红色转换为绿色。

我们通过前期显微注射实验已验证荧光转换的有效性。通过对受精卵或2-细胞单卵裂球的Cre mRNA显微注射，可以成功使细胞完成红→绿的荧光转换，并发育为囊胚。将囊胚移植代孕母鼠，可获得各种类型的荧光转换小鼠。因此，如果对新冠病毒稍加改造，加入Cre基因序列，则在新冠病毒感染小鼠细胞后，就可发生红→绿的荧光转换，从而直观地区分感染细胞和未感染细胞。

对mT/mG母鼠进行超数排卵处理后，使其与公鼠合笼获得受精卵。显微注射当天，先将2个gRNA、Donor DNA和Cas9蛋白混合均匀，各组分配比和终浓度见表1，再将混合物注射到经37℃孵育15分钟的mT/mG小鼠受精卵的原核中。注射完毕后，将胚胎继续培养至2-细胞，进行输卵管移植。将10枚左右的2-细胞胚胎移植到假孕母鼠每侧的输卵管中，母鼠继续饲养约19天，直至仔鼠出生。

表1.显微注射体系各组分用量及终浓度

4.基因型鉴定

仔鼠出生后第6天，取其剪取趾或尾尖用于基因型鉴定。其中1只代孕母鼠出生仔鼠21只，经hACE2检测引物初步鉴定，5、13、15、16和21号仔鼠扩增出目的条带(如图4中的A所示)。进一步，通过2对上、下同源臂与hACE2连接的引物进行检测，进一步证实hACE2确实发生基因敲入。通过小鼠ACE2特异性引物检测也扩增出目的WT条带，说明发生的是单等位敲入(图4中的B所示)。将插入片段进行全长测序，5、15、16和21号小鼠插入序列完全正确，因此这4只仔鼠为Founder小鼠，即新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型，后续通过交配繁殖获得双等位hACE2基因敲入的纯合小鼠模型。施例中所用野生型ACE2序列的引物如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19所示。

SEQ ID NO.6

名称：polyA序列

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA

SEQ ID NO.7

名称：hACE2-F

CAACCCAAGTTCAAAGGCTGATG

SEQ ID NO.8

名称：hACE2-R

GTCGTCCATTGTCACCTT

SEQ ID NO.9

名称：Flag标签

GATTATAAGGATGACGACGATAAA

SEQ ID NO.10

名称：6×His标签

CACCACCACCACCACCA CACCACCACCACCACCAC C

SEQ ID No.13

名称：上游同源臂引物-F

ggatcttccagagatCAAAGCCACACAGGAAGCATC

SEQ ID NO.14

名称：上游同源臂引物-R

taccggatcctAGATCCCATCCACTGAGCAACT

SEQ ID NO.15

名称：下游同源臂引物-F

atgggatctAGGATCCGGTACCGAGGAGA

SEQ ID NO.16

名称：下游同源臂引物-R

ctgagaaggagTCAAACGAGTTGGTGCTCATGG

SEQ ID NO.18

名称：野生型序列-F

CAACCCAAGTTCAAAGGCTGATG

SEQ ID NO.19

名称：野生型序列-R

cctcaagaacttacCATCTTTTGGG

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨工业大学

<120> 一种新冠病毒人源化受体hACE2小鼠模型的构建方法及应用

<130>

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA-1

<400> 1

ggatgggatc ttggcgcacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> gRNA-2

<400> 2

gaaagatgtc cagctcctcc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 切掉的22bp序列

<400> 3

acggggaaag atgtccagct cc 22

<210> 4

<211> 2712

<212> DNA

<213> 小鼠mACE2基因第二外显子的序列

<400> 4

ataatcaagc aggcccatga gccctgccat ttaaagtggc tcctctctta cactctggga 60

atgaggacac ggagccagct gctgaacttc accaggataa ccattaaaat tgctttggag 120

ttcatatttc cacgatccca tgcctatgga tgccaaggac ttgtcatgga tgcgctttgg 180

atttcataat gcagagtcat tattacttcc ttgagttctc agctgagttg taagcaggta 240

agtgaaaggg aaagaggcac ctgataaagt cagctgtagg actagagttt agcatgtctc 300

ctgagaaata gaaaatgact gcttgaaact ttaccaaagc cacacaggaa gcatcaaact 360

ccctatggag tggagaagag tcttataatt ttttaaatgg gcagagaaat gaatttattt 420

ttaattttta gagacagggt ttctttgtat agctctagct gtctttgatt ggtagacaaa 480

gctgtcctca aactcagaga tcttccttcc tttgtctcct gagtgctggg attaaaggca 540

tggaccacca ctgccctgcc ccattctctc cattaatttt aagtgaatgc ttgcaaaagc 600

tcacttcttt ggtgaacagc ttcctttaca aataagtacc tttgccttcg tttttatagg 660

attcttaaaa agaaaaaaaa gattcagcca ggtggttgtg gtgcacacct ttaatcccag 720

cagtcaggag gcagaggaaa gcagatctct tgagtttgag gctagcctag tctacagagg 780

gagttccagg acagccaagg ctacagagag gaactgtcta aaaacaccaa gaaagagaga 840

aaggagagag ggagaggatg gatagcttat tgatagaatt gtcagaaaag gctataagtt 900

ccaatatgtg tcccatgatt tctaagtcta gccctttctg ttatagtaaa atcatagtac 960

accctcctcc tccagtgtat ctttaacagc ttttaaggaa catattaact aaatgtccag 1020

gttttgattt ggccataaaa tgttagcaaa gctaaggttt tctaggatta atgaataaca 1080

tgtctttatt tagtttactt aaaaaaatca ttctaaaata tctgtttaca tatctgtcct 1140

ctccaggatt aacttcatat tggtccagca gcttgtttac tgttctcttc tgtttcttct 1200

tctgcttttt ttttcttctc ttctcagtgc ccaacccaag ttcaaaggct gatgagagag 1260

aaaaactcat gaagagattt tactctaggg aaagttgctc agtggatggg atcttggcgc 1320

acggggaaag atgtccagct cctcctggct ccttctcagc cttgttgctg ttactactgc 1380

tcagtccctc accgaggaaa atgccaagac atttttaaac aactttaatc aggaagctga 1440

agacctgtct tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aatactaaca ttactgaaga 1500

aaatgcccaa aagatggtaa gttcttgagg ctacccaggg ggttattgat tgcttcttaa 1560

agatcagaat tactgcctat aaaactggat aaggaaatca tagagatctc tcaagtgtga 1620

ggatgagtga ctgcctctgt agctctgatc ctagtctccc agatggctaa attcaattga 1680

ccttagagtt catctggaaa attgttatga atgaattatt tgcccagatt ccaaagatga 1740

gtgaaaatgt ttaataaagt tgccatcact attctcatta tatttggtat gtaaagcatt 1800

catggaaatg ttctaagtcg ttattgagcc aataattttc tttagcttat aatgccaaca 1860

ggtctatccg agaactacaa atgacatatt aactgaaaaa tgcaactggg gtttactgaa 1920

ggcagcagct tagtaattaa ggtaaccatg gcttaggtga aactggacct gggaattcct 1980

tctttcattg acacagagct ctgaggaatt tccaaaggtc acagaagaaa agctataatt 2040

aaactagtcc caaaaaatct cagcctactc tgggaaagca gcatattttg tttgacaagt 2100

gcaaggactt agaacttttt tttttctcac tgatcctgaa gtgcctttta agtatagtta 2160

agtggtggaa aattgagcaa ctatttaaga aaagactctt ttttttcttc ttccagcaat 2220

gctttccttc aaaacggtag cttcaaaact tcctgtcttt taaatgatca gggggctgtg 2280

tgtttaaatt attgccattc atagaacaga gtgggtctga ggatgcctgt ttcctttgaa 2340

attctatgcc ccctcccagt tttctaaaat ttaagaaacc acagagactt tgacaatgta 2400

gttgccaaat gagttgcttt taactgctct aatagtttgg tcttaccggt gttgttttta 2460

gtgtaacttt ttttcccctc agtttttatt ttatttctgt tggagatcac caacgtgtac 2520

tgtagatttt ctgagctgaa tggttcaagg tgagactaat attatacttg aaagcctagc 2580

ctggagctga catccagatc ctggctgtac cactttttag ctgggtaaac ttgaattcat 2640

taaatggaca gtctgggtct tagttacttt ttgttttaag atgtatttta attttaaaac 2700

tatgtgtatg tg 2712

<210> 5

<211> 2415

<212> DNA

<213> hACE2的CDS序列

<400> 5

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380

tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620

aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680

ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740

gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800

aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860

aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920

tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980

cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040

tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100

gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160

agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220

atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280

atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340

tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400

gttcagacct ccttt 2415

<210> 6

<211> 122

<212> DNA

<213> polyA序列

<400> 6

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> hACE2-F

<400> 7

caacccaagt tcaaaggctg atg 23

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> hACE2-R

<400> 8

gtcgtccatt gtcacctt 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Flag标签

<400> 9

gattataagg atgacgacga taaa 24

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 6×His标签

<400> 10

caccaccacc accaccacac caccaccacc accacc 36

<210> 11

<211> 980

<212> DNA

<213> 上游同源臂

<400> 11

caaagccaca caggaagcat caaactccct atggagtgga gaagagtctt ataatttttt 60

aaatgggcag agaaatgaat ttatttttaa tttttagaga cagggtttct ttgtatagct 120

ctagctgtct ttgattggta gacaaagctg tcctcaaact cagagatctt ccttcctttg 180

tctcctgagt gctgggatta aaggcatgga ccaccactgc cctgccccat tctctccatt 240

aattttaagt gaatgcttgc aaaagctcac ttctttggtg aacagcttcc tttacaaata 300

agtacctttg ccttcgtttt tataggattc ttaaaaagaa aaaaaagatt cagccaggtg 360

gttgtggtgc acacctttaa tcccagcagt caggaggcag aggaaagcag atctcttgag 420

tttgaggcta gcctagtcta cagagggagt tccaggacag ccaaggctac agagaggaac 480

tgtctaaaaa caccaagaaa gagagaaagg agagagggag aggatggata gcttattgat 540

agaattgtca gaaaaggcta taagttccaa tatgtgtccc atgatttcta agtctagccc 600

tttctgttat agtaaaatca tagtacaccc tcctcctcca gtgtatcttt aacagctttt 660

aaggaacata ttaactaaat gtccaggttt tgatttggcc ataaaatgtt agcaaagcta 720

aggttttcta ggattaatga ataacatgtc tttatttagt ttacttaaaa aaatcattct 780

aaaatatctg tttacatatc tgtcctctcc aggattaact tcatattggt ccagcagctt 840

gtttactgtt ctcttctgtt tcttcttctg cttttttttt cttctcttct cagtgcccaa 900

cccaagttca aaggctgatg agagagaaaa actcatgaag agattttact ctagggaaag 960

ttgctcagtg gatgggatct 980

<210> 12

<211> 978

<212> DNA

<213> 下游同源臂

<400> 12

ctccttctca gccttgttgc tgttactact gctcagtccc tcaccgagga aaatgccaag 60

acatttttaa acaactttaa tcaggaagct gaagacctgt cttatcaaag ttcacttgct 120

tcttggaatt ataatactaa cattactgaa gaaaatgccc aaaagatggt aagttcttga 180

ggctacccag ggggttattg attgcttctt aaagatcaga attactgcct ataaaactgg 240

ataaggaaat catagagatc tctcaagtgt gaggatgagt gactgcctct gtagctctga 300

tcctagtctc ccagatggct aaattcaatt gaccttagag ttcatctgga aaattgttat 360

gaatgaatta tttgcccaga ttccaaagat gagtgaaaat gtttaataaa gttgccatca 420

ctattctcat tatatttggt atgtaaagca ttcatggaaa tgttctaagt cgttattgag 480

ccaataattt tctttagctt ataatgccaa caggtctatc cgagaactac aaatgacata 540

ttaactgaaa aatgcaactg gggtttactg aaggcagcag cttagtaatt aaggtaacca 600

tggcttaggt gaaactggac ctgggaattc cttctttcat tgacacagag ctctgaggaa 660

tttccaaagg tcacagaaga aaagctataa ttaaactagt cccaaaaaat ctcagcctac 720

tctgggaaag cagcatattt tgtttgacaa gtgcaaggac ttagaacttt tttttttctc 780

actgatcctg aagtgccttt taagtatagt taagtggtgg aaaattgagc aactatttaa 840

gaaaagactc ttttttttct tcttccagca atgctttcct tcaaaacggt agcttcaaaa 900

cttcctgtct tttaaatgat cagggggctg tgtgtttaaa ttattgccat tcatagaaca 960

gagtgggtct gaggatgc 978

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 上游同源臂引物-F

<400> 13

ggatcttcca gagatcaaag ccacacagga agcatc 36

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 上游同源臂引物-R

<400> 14

taccggatcc tagatcccat ccactgagca act 33

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 下游同源臂引物-F

<400> 15

atgggatcta ggatccggta ccgaggaga 29

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 下游同源臂引物-R

<400> 16

ctgagaagga gtcaaacgag ttggtgctca tgg 33

<210> 17

<211> 4887

<212> DNA

<213> Donor DNA

<400> 17