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应用iTRAQ技术研究家蚕响应球孢白僵菌感染蛋白质组变化的方法

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本发明公开了应用iTRAQ技术研究家蚕响应球孢白僵菌感染蛋白质组变化的方法，所述方法包括：家蚕试验材料的获取及总蛋白的提取；总蛋白酶解、肽段标记、肽段分离、LC‑MS质谱分析；质谱鉴定结果数据查库、定量分析，获取家蚕响应球孢白僵菌感染过程中所有蛋白质组的变化情况。本发明采用iTRAQ技术，通过比较球孢白僵菌侵染前后家蚕自身蛋白组的变化，直接鉴定参与宿主应答反应的蛋白质，研究结果为快速寻找宿主与病原真菌互作的关键因子提供实验数据，进而解析家蚕对球孢白僵菌的免疫应答机制。预期研究结果有助于解析家蚕抵御真菌感染的调控机理，为开发家蚕真菌病的防治措施提供重要理论依据，同时也为阐明其他类型昆虫真菌致病的分子机制提供有益的参考。

著录项

公开/公告号CN112229922A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-15

原文格式PDF
申请/专利权人镇江市高等专科学校;
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申请/专利号CN202011055945.5
发明设计人吕丁丁;郭锡杰;杨军;万爱军;卢兵;
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申请日2020-09-30
分类号G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101);G01N30/72(20060101);C12Q1/6851(20180101);
代理机构32200 南京经纬专利商标代理有限公司;
代理人余俊杰
地址 212003 江苏省镇江市京口区学府路61号
入库时间 2023-06-19 09:33:52

说明书

技术领域

本发明属于家蚕分子生物学领域，涉及一种研究家蚕响应真菌感染的方法，具体为应用iTRAQ技术研究家蚕响应球孢白僵菌感染蛋白质组变化的方法。

背景技术

家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式动物。在养蚕生产过程中，因病原真菌感染引起的家蚕真菌病(通常称为僵病)时常发生，是家蚕的一类重要的传染病，球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一类寄主范围广、致病性强、适应性强的昆虫病原真菌，且其具有易培养、寄主范围广、致病力强、易随风扩散等特点，因此也逐渐成为农林害虫生物防治中应用最多的昆虫病原真菌。尽管球孢白僵菌在农、林害虫的生物防治中具有广泛运用，常被用做生物杀虫剂，但一些球孢白僵菌菌种严重威胁了包括家蚕在内的部分经济昆虫的生存，其感染家蚕引起的白僵病常给养蚕业造成严重损失。目前包括白僵病在内的家蚕疾病都缺乏有效的治疗手段，所以疾病的预防显得至关重要。

白僵菌一般是通过幼虫表皮主动入侵进入家蚕体内，并最终杀死家蚕。其侵染幼虫的复杂过程主要分为：体表附着阶段、体壁穿透阶段、体内定殖及致死阶段。这个复杂过程涉及体表识别和破坏、竞争营养和干扰代谢、分泌毒素等作用最终导致寄主死亡。真菌穿透体壁进入昆虫体内后，需要应对昆虫免疫攻击和高渗透压胁迫。真菌在昆虫血腔内增殖的过程中，昆虫自身也会发生免疫应答作用。因此，昆虫与球孢白僵菌之间的互作，特别是宿主对病原微生物的免疫应答分子机制受到了越来越高的重视，而家蚕作为遗传背景相对清晰，分子操作手段相对成熟的昆虫，也成为了相关研究最常用的模式昆虫。

然而，迄今为止，人们对家蚕响应球孢白僵菌侵染的分子机制仍然知之甚少。目前，对于家蚕抵御球孢白僵菌侵染的研究多停留在基因组和比较转录组学分析在内的基因层面，但仍未深入到调控网络的解析以及蛋白在通路中的调控机理研究。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明采用定量蛋白质组学同位素标记相对定量和绝对定量技术，通过比较球孢白僵菌侵染前后家蚕自身蛋白组的变化，直接鉴定参与宿主应答反应的蛋白质，研究结果为快速寻找宿主与病原真菌互作的关键因子提供实验数据，进而解析家蚕对球孢白僵菌的免疫应答机制。预期研究结果有助于解析家蚕抵御真菌感染的调控机理，为开发家蚕真菌病的防治措施提供重要理论依据，同时也为阐明其他类型昆虫真菌致病的分子机制提供有益的参考。

技术方案：应用iTRAQ技术研究家蚕响应球孢白僵菌感染蛋白质组变化的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、家蚕试验材料的获取及总蛋白的提取；

S2、对步骤S1所得的总蛋白样品依次进行酶解、肽段标记、肽段分离、LC-MS质谱分析；

S3、对步骤S2所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，获取家蚕响应球孢白僵菌感染过程中的所有蛋白质组的变化情况。

本发明采用的试验材料来源如下：家蚕p50是由江苏科技大学生物技术学院家蚕病理室保存并饲养。球孢白僵菌菌株HN6是由中国农业科学院蚕业研究所家蚕病理研究室从白僵蚕体(p50)上分离纯化，并继代保存。

优选的，S1中家蚕试验材料的获取及总蛋白的提取步骤为：

(1)制备球孢白僵菌孢悬液，并将孢悬液稀释至分生孢子终浓度为4×10

(2)取健康3龄起蚕浸没于步骤(1)的孢悬液中15s，对照组用含0.05％(v/v)Tween-20的ddH

(3)取步骤(2)中不同时间点的染病组和对照组的混合家蚕100μg，提取染病组和对照组家蚕总蛋白。

优选的，S1中家蚕试验材料的获取及总蛋白的提取步骤具体为：

(1)制备球孢白僵菌孢悬液：将球孢白僵菌分生孢子接种于PDA平板上，25±1℃培养后将孢子及菌丝混合物从平板上刮出，移至无菌的0.05％Tween-20溶液中，反复漩涡震荡，直至孢子分散，再用装有无菌棉的针筒过滤，除去菌丝，即得球孢白僵菌孢悬液；取10μL孢悬液到血细胞计数板上，在光学显微镜下计数，添加0.01％Tween-20溶液，稀释孢悬液至分生孢子终浓度为4×10

(2)球孢白僵菌感染家蚕及取材：取健康3龄起蚕浸没于步骤(1)的孢悬液中15s，然后将幼虫和孢悬液同时倒入铁砂网中，去除孢悬液，然后正常饲养处理后的幼虫，分别取正常饲养18h、24h、36h、48h的不同时间点的15头染病家蚕，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存；对照组用含0.05％(v/v)Tween-20的ddH

(3)提取家蚕总蛋白：称取不同时间点的混合家蚕样品各100μg，加入LysisBuffer 3及终浓度为1mM的PMSF、2mM的EDTA，涡旋振荡后静置5分钟，添加终浓度10mM的DTT；冰浴超声5分钟、2sec/3sec，25,000g×4℃离心20分钟，取上清；上清在56℃水浴条件下加入终浓度10mM DTT处理1小时，恢复至室温后加入终浓度55mM IAM暗室静置45分钟。

优选的，S2的具体步骤为：

A、蛋白酶解：取家蚕总蛋白100μg蛋白溶液，按蛋白:酶＝40:1的比例加入Trypsin酶2.5μg，37℃酶解4小时，并按以上比例补加一次Trypsin酶，37℃继续酶解8小时，酶解后肽段采用Strata X柱进行除盐，真空抽干；

B、肽段标记：将步骤A的肽段依次采用定量iTRAQ标签进行标记；

C、肽段分离：采用液相系统分离步骤B标记后的肽段，分离柱为5μm 4.6×250mmGemini C18柱，用2mL流动相A复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/分钟的流速梯度洗脱：5％流动相B10分钟，5％至35％流动相B 40分钟，35％至95％流动相B1分钟，流动相B持续3分钟，5％流动相B平衡10分钟；在214nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集1个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到20个组分，然后冷冻抽干；

D、LC-MS质谱分析：将抽干的肽段样品用流动相A复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样，通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离，样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以300nL/分钟流速通过如下有效梯度进行分离：0-8分钟，5％流动相B；8-43分钟，流动相B从8％线性升至35％；43-48分钟，流动相B从35％升至60％；48-50分钟，流动相B从60％升至80％；50-55分钟，80％流动相B；55-65分钟，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪，经过液相分离的肽段进入到ESI串联质谱仪：TripleTOF 5600，离子源为Nanospray III source，放射器为石英材料拉制的喷针；数据采集时，质谱仪的参数设置如下：离子源喷雾电压2,300V，氮气压力为30psi，喷雾气为15，喷雾接口处温度150℃；采用高灵敏度模式进行扫描，一级质谱扫描累积时间为250ms，扫描质量范围为350-1,500Da；基于一级扫描信息，按照一级谱图中的离子强度从高到低，选择强度超过150cp的前30个进行碎裂并扫描二级信息，筛选标准如下：1)m/z范围为350-1250Da；2)电荷数目为2-5个电荷；3)母离子动态排除设置为：在一半的出峰时间内，相同母离子的碎裂不超过2次；二级质谱的扫描累积时间为100ms；针对iTRAQ类型的数据采集，碎裂能量选择根据iTRAQ试剂调整，第二个四级杆Q2在100Da时的离子传输效率为100％。

优选的，步骤C中流动相A为5％ACN，pH9.8，流动相B为95％ACN，pH9.8。

优选的，步骤D中流动相A为2％ACN，0.1％FA；流动相B为98％ACN，0.1％FA。

优选的，步骤D中C18柱的规格为75微米内径，3.6微米柱料粒径，15厘米柱长。

优选的，S3的具体步骤为：

a、数据查库：应用Mascot软件在NCBI的家蚕数据库中进行蛋白质的鉴定和定量，选择表达水平差异倍数＞1.2、上调或＜0.83、下调，且P＜0.05的蛋白质为显著差异表达蛋白；选择QuickGO注释工具对差异蛋白质进行基因功能聚类GO分析，把所有差异表达蛋白质向Gene Ontology数据库的各个条目映射，计算分布在每个条目的蛋白质数目，然后应用超几何检验，找出与所有蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著富集的GO条目；Pathway通路显著性富集分析方法与GO功能富集分析方法相同，以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到的蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著性富集的Pathway；

b、定量分析：为了验证iTRAQ标记结果，在表达水平差异倍数＞2、上调或＜0.5、下调，且P＜0.05的显著差异表达蛋白中，随机选择43个差异表达蛋白质进行基因mRNA转录水平的验证，设计荧光定量PCR引物，引物序列及相关信息见表1；实时荧光定量PCR反应体系20.0μL：10.0μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4μL 50×ROX Reference Dye，0.5μL正、反向引物(10μmol/L)，1.0μL稀释100倍的cDNA模板，ddH

表1差异表达蛋白质编码基因的qRT-PCR引物序列

有益效果：本发明采用定量蛋白质组学同位素标记相对定量和绝对定量技术，通过比较球孢白僵菌侵染前后家蚕自身蛋白组的变化，直接鉴定参与宿主应答反应的蛋白质，研究结果为快速寻找宿主与病原真菌互作的关键因子提供实验数据，进而解析家蚕对球孢白僵菌的免疫应答机制。预期研究结果有助于解析家蚕抵御真菌感染的调控机理，为开发家蚕真菌病的防治措施提供重要理论依据，同时也为阐明其他类型昆虫真菌致病的分子机制提供有益的参考。

附图说明

图1是家蚕接种球孢白僵菌后的症状图；其中，A为对照组家蚕幼虫正常生长，B为实验组僵蚕上长出菌丝和孢子；

图2是质谱鉴定感染球孢白僵菌的3龄家蚕的蛋白质分子质量分布；

图3是差异蛋白柱图；其中，黑色柱为显著上调蛋白，斜纹柱为显著下调蛋白；

图4是家蚕感染白僵菌的不同阶段的差异表达蛋白质的共调控情况；

图5是NP_001037448.1蛋白基因的qRT-PCR与iTRAQ分析比较。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例采用的试验方法如下：

1.1、材料

实验所用家蚕p50是由江苏科技大学生物技术学院家蚕病理室保存并饲养。球孢白僵菌菌株HN6是由中国农业科学院蚕业研究所家蚕病理研究室从白僵蚕体(p50)上分离纯化，并继代保存。

1.2、制备球孢白僵菌孢悬液

将BbHN6白僵菌分生孢子接种于PDA平板上，在25±1℃培养箱中培养15天左右，将孢子及菌丝混合物从平板上刮出，移至无菌的0.05％Tween-20溶液里，反复漩涡震荡，直至孢子分散，再用装有无菌棉的20mL针筒过滤，除去菌丝，即得HN6分生孢子悬液。取10μL孢悬液到血细胞计数板上，在光学显微镜下计数，添加适量的0.01％Tween-20溶液，稀释孢悬液至分生孢子终浓度为4×10

1.3、球孢白僵菌感染家蚕及取材

取健康的三龄起蚕，分组。将每组幼虫同时浸没到4×10

1.4、家蚕总蛋白的提取

(1)称取不同时间点的混合家蚕样品各100μg；

(2)加入适量Lysis Buffer 3，分别添加终浓度为1mM的PMSF，2mM的EDTA，涡旋振荡后静置5分钟，添加终浓度10mM的DTT；

(3)冰浴超声5分钟(2sec/3sec)，25,000g×4℃离心20分钟，取上清；

(4)上清在56℃水浴条件下加入终浓度10mM DTT处理1小时；

(5)恢复至室温后加入终浓度55mM IAM暗室静置45分钟。

1.5、蛋白酶解

(1)上述每个样品取100μg蛋白溶液；

(2)按蛋白:酶＝40:1的比例加入Trypsin酶2.5μg，37℃酶解4小时；

(3)按上述比例再补加Trypsin一次，37℃继续酶解8小时；

(4)酶解的肽段利用Strata X柱进行除盐，真空抽干。

1.6、肽段标记

(1)18h、24h、36h、48h的4个对照组和4个实验组，预定对应标签依次为113、114、115、116、117、118、119、121的定量iTRAQ标签试剂；

(2)取出8个标签试剂，待试剂恢复至室温后，每管试剂加入50μL异丙醇，涡旋震荡后低速离心；

(3)用0.5M TEAB溶解肽段样品，并加入到对应iTRAQ标签试剂中。不同样品肽段选用不同的iTRAQ标签；

(4)室温静止2小时。

1.7、肽段分离

采用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为5μm 4.6×250mm Gemini C18柱对样品进行液相分离。用2mL流动相A(5％ACN pH9.8)复溶抽干的肽段样品并进样，以1mL/分钟的流速梯度洗脱：5％流动相B(95％ACN，pH9.8)10分钟，5％至35％流动相B 40分钟，35％至95％流动相B1分钟，流动相B持续3分钟，5％流动相B平衡10分钟。在214nm波长下监测洗脱峰并每分钟收集1个组分，结合色谱洗脱峰图合并样品得到20个组分，然后冷冻抽干。

1.8、高效液相

将抽干的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(75微米内径，3.6微米柱料粒径，15厘米柱长)串联，以300nL/分钟流速通过如下有效梯度进行分离：0-8分钟，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；8-43分钟，流动相B从8％线性升至35％；43-48分钟，流动相B从35％升至60％；48-50分钟，流动相B从60％升至80％；50-55分钟，80％流动相B；55-65分钟，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

1.9、质谱检测

经过液相分离的肽段进入到ESI串联质谱仪：TripleTOF 5600(SCIEX,Framingham,MA,USA)，离子源为Nanospray III source(SCIEX,Framingham,MA,USA)，放射器为石英材料拉制的喷针(New Objectives,Woburn,MA，USA)。数据采集时，质谱仪的参数设置如下：离子源喷雾电压2,300V，氮气压力为30psi，喷雾气为15，喷雾接口处温度150℃。采用高灵敏度模式进行扫描，一级质谱扫描累积时间为250ms，扫描质量范围为350-1,500Da。基于一级扫描信息，按照一级谱图中的离子强度从高到低，选择强度超过150cp的前30个进行碎裂并扫描二级信息，筛选标准如下：1)m/z范围为350-1250Da；2)电荷数目为2-5个电荷；3)母离子动态排除设置为：在一半的出峰时间内(约12s)，相同母离子的碎裂不超过2次。二级质谱的扫描累积时间为100ms。针对TRAQ类型的数据采集，碎裂能量选择根据iTRAQ试剂调整，第二个四级杆Q2在00Da时的离子传输效率为100％。

1.10、蛋白质定量分析

应用Mascot 2.3.02软件，在NCBI的家蚕数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bombyx_mori/)中进行蛋白质的鉴定和定量。选择表达水平差异倍数＞1.2(上调)或＜0.83(下调)，且P＜0.05的蛋白质为显著差异表达蛋白。选择欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)维护的QuickGO(http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/)注释工具对差异蛋白质进行基因功能聚类GO分析，把所有差异表达蛋白质向Gene Ontology数据库(http://www.geneontology.org/)的各个条目映射，计算分布在每个条目的蛋白质数目，然后应用超几何检验，找出与所有蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著富集的GO条目。Pathway通路显著性富集分析方法与GO功能富集分析方法相同，以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与所有鉴定到的蛋白质背景相比，在差异蛋白质中显著性富集的Pathway。

1.11、qRT-PCR分析

为了验证iTRAQ标记结果，在表达水平差异倍数＞2(上调)或＜0.5(下调)，且P＜0.05的显著差异表达蛋白中，随机选择43个差异表达蛋白质进行基因mRNA转录水平的验证。利用Primer Premier 6.0软件设计了荧光定量PCR引物，引物序列及相关信息见表1。实时荧光定量PCR反应体系20.0μL：10.0μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4μL 50×ROXReference Dye，0.5μL正、反向引物(10μmol/L)，1.0μL稀释100倍的cDNA模板，ddH

本实施例试验结果如下：

2.1、家蚕接种球孢白僵菌的发病症状

本研究中，家蚕三龄幼虫在接种球孢白僵菌66h后，实验组开始有个别蚕体表面出现小的油斑。接种87h后实验组幼虫开始死亡，蚕体上开始出现白僵病典型症状油状斑；在接种110h后家蚕全部死亡，刚死的蚕常伴有口部吐水现象，一部分蚕尸在头部下面和关节处多处出现油状斑，一部分蚕体上已经出现大面积油状斑，大部分蚕尸体僵硬。在接种7天后，实验组蚕尸上全部长满白色菌丝和孢子，而对照组家蚕幼虫在整个实验过程中均正常进食桑叶，最终吐丝、结茧(图1)。

2.2、感染球孢白僵菌的家蚕蛋白质组的质谱鉴定结果

iTRAQ定量分析8组蛋白样品(18hC、24hC、36hC、48hC、18hT、24hT、36hT、48hT)，共有407313张二级谱图生成下机。在"1％FDR"过滤标准下，一共有30092条肽段和5040个蛋白被鉴定到。质谱数据用Mascot软件在NCBI数据库中比对，共鉴定到置信度≥95％的蛋白质5040个，如图2所示，鉴定的蛋白质分子质量主要分布于10～100kD之间，另有15％左右的蛋白质分子质量＞100kD。

经相对表达丰度分析发现共有937个差异表达的蛋白质，其中18hpi有23个差异蛋白、24hpi有15个差异蛋白、36hpi有250个差异蛋白、48hpi有649个差异蛋白，上调表达的蛋白质共有488个、下调表达的蛋白质共有449个，在48hpi上调表达蛋白高达388个(图3)。

差异倍数大于2倍的表达蛋白质的基本信息见表2，上调蛋白共有58个，其中增幅排前6位的蛋白质为cecropin CBM2 precursor、ATP synthase F0 subunit 8(mitochondrion)、uncharacterized protein LOC101743244、uncharacterized proteinLOC101737221、cleft lip and palate transmembrane protein 1-like protein、lysozyme precursor；而39S ribosomal protein L22、DSCAML Dscam2 isoform X2、zincfinger protein Gfi-1b等41个蛋白质的表达量显著下调。

表2家蚕在不同时间点接种白僵菌后的差异表达蛋白质(差异倍数大于2倍)

KEGG分析表明在18hpi、24hpi、36hpi、48hpi分别有18、12、210、548个差异表达蛋白质参与63、35、201、264个信号转导通路，其中参与差异蛋白质最高的通路为Metabolicpathways(表4)。Oxidative phosphorylation、Ribosome、Parkinson's disease等13条信号转导通路在36hpi和48hpi都能显著检测到。Pathogenic Escherichia coli infection信号通路不仅在36hpi被差异表达蛋白参与，同时在24hpi也显著检测到被差异表达蛋白参与(表4)。而Toll and Imd signaling pathway仅在家蚕被感染白僵菌48h后才被差异表达蛋白质参与，推测Toll and Imd信号通路在家蚕感染白僵菌2天后才开始发挥重要作用。

表4感染球孢白僵菌18h、24h、36h、48h后的家蚕差异表达蛋白质的KEGG通路分析

2.4 qRT-PCR检验差异蛋白质编码基因mRNA

为了验证鉴定的差异表达蛋白质在基因水平上的转录变化是否和蛋白质表达变化趋势一致，随机选择了43个差异倍数大于2倍的蛋白质的编码基因比较其mRNA转录水平的变化，结果如表2所示，43个基因中有9个基因的mRNA转录水平变化趋势与蛋白质的表达变化相反，其他基因表达变化和蛋白表达变化均一致。

另外，将家蚕感染白僵菌后24h相对于感染18h的差异表达蛋白(表达水平差异倍数＞1.2或＜0.83，且P＜0.05)、感染白僵菌后36h相对于感染24h的差异表达蛋白、感染白僵菌后48h相对于感染36h的差异表达蛋白进行比对分析，发现1个共同上调表达的蛋白lysozyme precursor(NP_001037448.1)(图4)。经qRT-PCR检测，发现该蛋白的基因在转录水平上在不同的时间点也是呈上调表达趋势，和iTRAQ分析的蛋白表达趋势一致(图5)。

序列表

<110> 镇江市高等专科学校

<120> 应用iTRAQ技术研究家蚕响应球孢白僵菌感染蛋白质组变化的方法

<160> 84

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA