奶牛子宫内膜炎的检测标志物及其获得方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及奶牛子宫内膜炎的检测标志物及其获得方法和应用。

背景技术

子宫内膜炎(endometritis)是奶牛围产期发生的一种严重影响奶牛业发展的疾病之一，多发生于产后，是病原菌感染子宫内膜引起的炎症，发病率高，常导致奶牛屡配不孕，给我国奶牛养殖业带来巨大的经济损失。根据其发病特点进一步将该病划分为：产褥期子宫内膜炎(puerperal endometritis)，主要发生在产后早期；临床型子宫内膜炎(clinical endometritis)，主要发生在子宫复旧的过渡期；子宫积脓(pyometra)和隐性子宫内膜炎(subclinical endometritis)主要发生在配种期。临床型子宫内膜炎常发生于产后第3周，产后子宫腔内黏脓性或脓性内容物经阴道排出。与临床型子宫内膜炎的患病牛不同，患有隐性子宫内膜炎奶牛的子宫内没有或仅有少量病理性黏液渗出，子宫颈没有明显的病理学特征，且发情时子宫分泌物较多、韧性差、吊线短而易断，其分泌物透明度下降并略显混浊。隐性子宫内膜炎的最新定义为发生在子宫复旧过程中的任意时间(例如在产后第8周)，以子宫内膜被嗜中性粒细胞广泛浸润为主要特征，而这些嗜中性粒细胞(PMN)只有在对子宫内膜进行细胞学检查时才能被发现。而没有直观的临床症状，经常导致奶牛屡配不孕。在中国，由子宫内膜炎引起的奶牛不孕的比例达50.62％，且由隐性子宫内膜炎引起的奶牛不孕占其中的90％。由于隐性子宫内膜炎在发病初期不易被观察到，容易错过最佳治疗时间，造成巨大的经济损失，故如何对其做出正确、及时的诊断，为治疗奶牛隐性子宫内膜炎提供有效的依据。

目前，国内外奶牛隐性子宫内膜炎的诊断方法主要有(1)阴道内窥镜法：该方法在诊断临床型子宫内膜炎时具有较好的实用性，但对于诊断隐性子宫内膜炎有一定的局限性；(2)细胞学诊断方法，包括细胞刷法和子宫灌注液法：但目前该法对隐性子宫内膜炎的诊断没有统一的判断标准，该技术主要是通过细胞刷或子宫灌注液收集子宫样品，HE染色后显微镜下对PMN进行计数，根据PMN的数量来判断奶牛是否患有隐性子宫内膜炎；(3)细胞刷法活体组织诊断法：活体组织检查能提供关于子宫组织详细且有价值的炎症信息，用来评估子宫内膜全层的组织学状况和炎症细胞浸润的情况，而细胞学检测方法只能检测子宫上皮表面的一层炎症细胞的分布情况。此外，活体组织检查对采样技术的要求较高，采样时会对子宫组织造成一定的损伤，且损伤程度要大于细胞刷采样的损伤；(4)超声诊断法：超声波诊断方法同样会受到奶牛不同发情期子宫生理性改变的影响，易造成结果的假阳性且要求特殊的实验室设备；(5)白血球酯酶法：该法诊断隐性子宫内膜炎的特异性较低，而且当试剂板撤出子宫颈的过程中诊断结果易受到阴道分泌物的影响，造成诊断的不准确性。

因此，如何对奶牛隐性子宫内膜炎进行快速、有效对奶牛机体损伤性小的早期诊断，寻找有效的预防和治疗措施已经成为国内外专家和学者研究的热点。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提供了一种可以快速检测奶牛子宫内膜炎，尤其是隐性子宫内膜炎的早期阶段的检测标志物。

本发明提供了一种获得用于奶牛子宫内膜炎的检测标志物的方法，包括：a、提取外泌体；b、提取所述外泌体中的RNA；c、根据所述RNA构建miRNA库；d、对所述miRNA库进行深度测序和数据分析，以筛选出具有差异表达的miRNA，即目标差异基因，作为检测标志物。

在上述方法中，所述外泌体为奶牛外周血外泌体或奶牛子宫腔液外泌体。

在上述方法中，所述提取所述外泌体中的RNA包括采用抽提试剂盒从所述外泌体中提取RNA。

在上述方法中，所述根据所述RNA构建miRNA库包括：按照

在上述方法中，所述对所述miRNA库进行数据分析包括：采用TPM(transcript permillion，每一百万一个转录本)计算度量指标，采用Audic_Claverie公式计算p值。

在上述方法中，P

一种根据上述制备方法制备的用于奶牛子宫内膜炎的检测标志物。

上述检测标志物在对奶牛子宫内膜炎进行检测中的应用。

在上述应用中，采用荧光定量PCR方法检测目标差异基因在患子宫内膜炎的奶牛的外泌体中的表达变化。

在上述应用中，所述奶牛子宫内膜炎为隐性奶牛子宫内膜炎的早期阶段。

本发明提供一种用于检测奶牛子宫内膜炎的检测标志物及其制备方法，以外泌体中具有差异表达的miRNA为检测标志物，并且还提供了该检测标志物在检测奶牛子宫内膜炎中的应用，通过采集奶牛的外周血液来制备检测标志物，病料容易获取，对奶牛自身的损伤少，并且采用该检测标志物的检测方法简单，快速有效。并且通过采用该检测标志物的检测方法可以在隐性子宫内膜炎临床症状尚不明显的早期，抗体水平未达到检测标准时就可进行早期检测，通过早期的有效检测一方面可以进行早期的治疗，从而避免更大的经济损失，另一方面可以减少后期治疗过程中抗生素的使用，减少抗生素的残留，从而保证奶品的健康。此外，该检测方法还可用于分离筛选奶牛乳房炎等一些疾病。

附图说明

图1A是健康奶牛血浆内的外泌体。

图1B是子宫内膜炎奶牛血浆内的外泌体。

图1C是健康奶牛血浆内的外泌体和子宫内膜炎奶牛血浆内的外泌体。

图2A是子宫内膜上皮细胞培养液中的外泌体。

图2B是细胞全浆的外泌体。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、外泌体的提取与鉴定

(1)患隐性子宫内膜炎的奶牛外周血中外泌体的提取与鉴定

以健康奶牛作为对照，用采血针和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取奶牛外周血全血各6头份，轻柔混匀后4℃保存并于1h以内送回实验室；吊桶式转头离心机4℃，1900×g离心10min，小心吸取上清即为血浆，最后500μL丢弃；得到血清在4℃，3000×g条件下再次离心15min，小心吸出血浆，经0.45μm过滤器过滤；利用天根(QIAGEN)外泌体提取试剂盒对过滤后的血清液体进行外泌体的提取；分离出的外泌体微粒溶液分装后置于-80℃冰箱内保存备用。

将提取的外泌体进行电子显微镜形态检测、纳米(NanoSlight)粒径检测和免疫印迹试验方法(Western Blot)检测溶酶体相关膜蛋白3(CD63)，具体操作如下：

电子显微镜形态检测：将外泌体微粒溶液重悬于30μL的PBS(磷酸缓冲盐溶液)中；吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；醋酸双氧铀(磷钨酸)10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；常温干燥数分钟；80kV进行电镜检测成像，如图1A和图1B所示，图1A为健康奶牛血浆内的外泌体，图1B为子宫内膜炎奶牛血浆内的外泌体，从奶牛的血液里能够分离并鉴定出相关的外泌体成分，可以作为后续研究。

NanoSlight粒径检测：将外泌体微粒溶液重悬于30μL的PBS中，通过ZETASIZERNano series-Nano-ZS(仪器)进行粒径检测：外泌体粒径均在100纳米大小。

Western Blot操作如下：将外泌体微粒溶液重悬于200μL的PBS中，加入蛋白裂解液，室温5min；裂解完毕，将外泌体碎片及裂解缓冲液使用超声波处理法，超声时间5秒，间隙时间10s，工作次数5次，至样品完全溶解为透明澄清，整个过程在冰上操作；将超声波处理后的溶液在隔水式电热恒温箱加热，95℃，5min；将加热变性后的外泌体蛋白分装于新的1.5mL EP管中并置于-80℃冰箱保存备用。以胎牛血清(BSA)为标准，用布拉德福德(Bradford)法对上清进行蛋白定量。取20μg蛋白样品，10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，100V转移1h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1h；一抗4℃过夜。同时，另一张用不含抗体TBS-T液孵育，作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶(AP)标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1h，洗膜后，化学发光(ECL)底物发光，用图像分析测定各带吸光度(A)值做定量分析，如图1C所示，外泌体囊泡溶酶体相关膜蛋白3((CD63))出现了表达，表明外泌体提取正确。

上述电子显微镜形态检测、NanoSlight粒径检测和Western Blot CD63蛋白检测的结果表明，从奶牛外周血中提取出的外泌体经过鉴定合格，可以用于后续研究。

(2)隐性子宫内膜炎奶牛子宫腔液中外泌体的提取与鉴定

从屠宰场采集刚屠宰完毕健康奶牛子宫和患子宫内膜炎症奶牛子宫各6个，用经0.22μm过滤过，4℃预冷的PBS反复清洗子宫腔，收集清洗液，4℃，300×g离心10min，小心吸取上清；在4℃，3000×g条件下再次离心15min，吸去上清，置于-80℃冰箱内保存备用，进行外泌体的提取和电子显微镜形态检测(如图2A所示)、NanoSlight粒径检测和Western BlotCD63蛋白表达检测(如图2B所示)。

上述电子显微镜形态检测、NanoSlight粒径检测和Western Blot CD63蛋白检测的结果表明，从奶牛子宫腔液中提取出的外泌体经过鉴定合格，可以用于后续研究。

2、外泌体中RNA的提取

采用天根(QIAGEN)RNA抽提试剂盒对外周血外泌体和子宫腔液外泌体中的RNA进行提取。利用安捷伦2100(Agilent 2100)和纳米分光光度计2000(NanoDrop 2000)对提取的RNA浓度和质量进行质检，-80℃保存备用。

3、miRNA库的构建

每个样品取不少于10ng的总RNA，按照

4、外泌体中miRNA的深度测序及数据分析

利用Illumina基因组分析系统，使用切口接头(cut adapt)对接头序列进行去除并进行序列的长度过滤，去掉序列长度小于15bp，以及序列长度大于41bp的序列。使用fastx_tool kit(下一代测序数据预处理的软件，version版本0.0.13)软件，对序列进行Q20质控，保留Q20达到80％及以上的序列。随后使用NGSQCToolkit(下一代测序数据预处理的软件，version版本2.3.2)过滤掉含有N碱基的reads(数据的总碱基数)。最终得到高质量的clean reads(过滤得到的数据的总碱基数)并用于后续分析。

对clean reads的长度分布进行统计，以初步评估样本的小RNA分布情况。

根据该物种的参考基因组序列，将clean reads比对到基因组，统计reads比对到基因组的百分比。使用blastn软件，对clean reads同Rfam(下一代测序数据预处理的软件，version版本10.0)数据库进行比对，提取E

针对鉴定出的重复序列进行过滤去除，并不用于后续的新的miRNA预测分析。未注释上的小RNA序列使用Mirdeep2(下一代测序数据预处理的软件)软件进行新的miRNA预测，并使用RNA fold(RNA倍数)软件预测新预测miRNA的二级结构。

根据鉴定的已知的成熟体miRNA以及新预测的miRNA的序列，进行表达量统计，miRNA表达量计算采用TPM(transcript per million,每一百万一个转录本)计算度量指标，采用Audic_Claverie(欧蒂斯克拉弗里)公式计算P

5、检测目标差异基因的表达变化

采用荧光定量PCR方法检测，上述方法筛选出来的目标差异基因在大样本条件子宫内膜炎奶牛血液样品中的表达变化。通过荧光定量聚合酶链式反应检测奶牛血液中bta-miR-2483-3p，bta-miR-331-3p，bta-miR-433，bta-miR-218，bta-miR-146a，AC_000173.1_13530>AC_000173.1_13528的表达变化，一份血样如果出现上述6个miRNA同时表达上升，可判定该血样对应的奶牛可能患有子宫内膜炎症。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。