公开/公告号CN112251467A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-22
原文格式PDF
申请/专利权人 青岛大学;
申请/专利号CN202011114160.0
申请日2020-10-18
分类号C12N15/87(20060101);A01K67/027(20060101);A61K49/00(20060101);C12N15/11(20060101);C12Q1/6888(20180101);
代理机构37201 青岛海昊知识产权事务所有限公司;
代理人曾庆国
地址 266100 山东省青岛市崂山区香港东路7号
入库时间 2023-06-19 09:38:30
技术领域
本发明属于医用动物模型技术领域,具体涉及一种神经营养性角膜炎动物模型的建立方法。
背景技术
角膜作为一种无血管组织,是人体神经支配最密集的结构。角膜神经负责维持角膜的结构和功能完整,传达触觉、温度和疼痛的感觉,在瞬目反射、伤口愈合、泪液分泌中发挥作用。角膜神经损伤导致角膜知觉减退和营养障碍,可引起退行性角膜病变,包括角膜上皮脱落、持续性角膜上皮缺损、角膜溃疡、基质溶解、角膜穿孔等不同的临床表现。
神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis,NK)是由于三叉神经支配的角膜神经功能受损而引起的一种退行性角膜疾病,该病发病率小于1.6/10000,较为罕见,常被漏诊误诊。角膜神经损伤导致角膜上皮和基质细胞受损,从而影响这些靶细胞分泌神经营养因子(如神经生长因子NGF等),进一步加剧角膜神经的病变;同时,角膜神经损伤、NGF降低还可引起泪液分泌减少从而进一步加重角膜病变,导致恶性循环,最终进展为神经营养性角膜炎。该疾病最关键的临床特征是眼表知觉减退或缺失,因此造成临床的漏诊和误诊。
导致NK的致病因素是多种多样的,临床最常见的病因是病毒感染(如单纯疱疹或带状疱疹感染累及眼部)、化学烧伤、物理损伤、角膜手术、颅脑及神经外科手术、长期使用含防腐剂的眼局部药物或长期佩戴隐形眼镜。有些全身疾病也会导致神经营养性角膜炎,如糖尿病、多发性硬化、麻风病,或颅内占位病变等,而先天特发的案例相对罕见。
NK是一类与角膜神经受损相关的疾病,目前国内外还没有针对NK可以修复角膜神经损伤的无创的有效治疗方法,不能从根源上解决NK的致病因素,容易复发。目前关于NK的发病机制、诊断和治疗的一系列基础以及临床问题尚有待进一步深入研究。建立NK动物模型,是研究其发病机制和探索治疗方法的有效且实用的手段。
目前常用的是小鼠三叉神经眼支损伤模型,该方法涉及开颅,并损伤了颅脑,对动物脑部损伤大,且并发症多(如颅内压变化),术后需要缝合,伤口愈合时间长,术后护理程序繁琐,伤口感染几率大,手术时间长,且模型一致性差,损伤程度不一。为此,需要制作更多的更简易的NK动物模型,为NK的发病原因、病程进展、药物研发及药效评价等基础和临床研究提供重要载体。
发明内容
本发明的目的在于克服现有模型种类的不足,提供一种稳定的NK动物模型,从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种神经营养性角膜炎(neurotrophic keratitis,NK)小鼠模型(AQP5-KO模型小鼠),是通过降低AQP5基因表达量或敲除AQP5基因来构建的;
所述的敲除AQP5基因,作为实施例的一种具体记载,是通过敲除小鼠第15条染色体上的99589876-99594444区域的核苷酸片段来完成的;
本发明还提供一种神经营养性角膜炎动物模型的构建方法,是通过敲除动物中的AQP5基因来构建NK小鼠动物模型;
所述的敲除AQP5基因,是通过敲除小鼠第15条染色体上的99589876-99594444区域,长度为4569bp的基因片段;
所述的敲除动物中AQP5基因,是通过CRISPR/Cas9系统来完成的;
本发明还提供一种用于检测AQP5-KO小鼠的制品,所述的制品中包含有用于检测AQP5基因缺失片段的引物对;
其中用于检测上述缺失片段的引物对,其一种序列信息如下:
上游引物AQP5-F1:CAAAGTGCTCAAACACTAACCGTAC(SEQ ID NO:1)
下游引物AQP5-R1:GATTGGTGGTTTATTGGGAAACG(SEQ ID NO:2)。
下游引物AQP5-R3:TGCAGGTCTTTGTTTCTGCCG(SEQ ID NO:3)。
本发明所提供的NK小鼠模型应用于研究NK的发病机制或评价NK治疗药物的效果。
本发明的AQP5-KO模型小鼠,可重复性高,模型稳定,有利于干眼病理机制的研究和药物干预,可避免其他影响因素对实验结果产生影响。而且本发明的AQP5-KO小鼠模型,在出生后即出现角膜上皮下神经减少的特征性改变;在出生后,角膜敏感度即出现明显下降,且角膜敏感度随年龄增长无明显变化。
附图说明
图1:A、B为本发明实施例1的AQP5-KO小鼠信息及KO区域,C为AQP5-KO小鼠的测序鉴定结果图;
图2:本发明实施例1中AQP5-KO小鼠基因鉴定结果电泳图;
图3:本发明实施例1中野生型和AQP5-KO小鼠角膜敏感度统计结果图;
图4:本发明实施例1中野生和AQP5-KO小鼠角膜上皮下神经染色图;
图5:本发明实施例1中野生和AQP5-KO小鼠角膜上皮NGF实时定量检测统计结果图。
具体实施方式
申请人发现敲除水通道蛋白5基因(Aquaporin5,AQP5)的AQP5-KO小鼠出生后即表现为角膜敏感度下降,其上皮下神经纤维数量及分布区域,以及NGF的表达水平、均较野生小鼠明显减少。
采用CRISPR/Cas9技术,应用高通量电转受精卵方式,获得AQP5基因敲除小鼠(AQP5-KO)。AQP5-KO小鼠出生后即表现为NK,模型的表型稳定。
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1:构建AQP5-KO小鼠NK动物模型
1、AQP5-KO小鼠的构建及鉴定
AQP5(NCBI ID:11830)位于小鼠的15号染色体,AQP5-KO小鼠的信息及敲除的区域见图1A、B,采用CRISPR/Cas9技术,通过应用高通量电转受精卵方式,敲除chr15:99589876-99594444区域,长度为4569bp的基因片段,获得AQP5-KO小鼠。
图1C为AQP5-KO小鼠的测序鉴定结果,与野生型序列比较可见,共缺失了4569bp的序列,表明模型小鼠成功建立。
后续的常规饲养中,应用PCR扩增法检测AQP5-KO小鼠的敲除效果。
PCR扩增目的片段:反应条件与反应体系:
(1)PCR反应条件:94℃3min;94℃30sec,60℃30se,65℃50sec,33cycles;72℃10min。
(2)反应体系:(TAKARA LA Taq polymerase)
其中应用引物对分别为
AQP5-F1:CAAAGTGCTCAAACACTAACCGTAC、
AQP5-R1:GATTGGTGGTTTATTGGGAAACG、
AQP5-F1:CAAAGTGCTCAAACACTAACCGTAC、
AQP5-R3:TGCAGGTCTTTGTTTCTGCCG。
繁殖小鼠的鉴定结果见图2,鼠尾基因组DNA行PCR扩增的结果显示,1、2、6、7列仅有640bp的片段,为成功的AQP5-KO小鼠;3、4、5列有640bp和348bp的两条片段,为未完全敲除AQP5的杂合子小鼠,因此这些小鼠丢弃。仅选用AQP5-KO小鼠和野生小鼠进行后续实验。
2、AQP5-KO小鼠角膜的症状
选用野生小鼠和AQP5-KO小鼠,常规饲养,AQP5-KO小鼠在出生后即出现神经营养性角膜炎的特征性改变:小鼠角膜上皮细胞减少,荧光素钠着色;角膜知觉减退,结果见图3;免疫荧光染色结果显示,AQP5-KO角膜上皮下神经纤维的数量和分布区域明显减少,染色图及神经密度统计图见图4;角膜上皮的NGF的表达水平明显下降,统计分析结果见图5。
本发明所构建的动物模型,能用于研究NK的发病机制,并用于筛选或评价各种NK治疗药物的作用机制及效果评价;还可用于NK对眼表微环境的损害及机制的研究,及用于筛选或评价各种NK治疗药物对眼表微环境的保护作用及效果。
序列表
<110> 青岛大学
<120> 一种小鼠神经营养性角膜炎动物模型及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaagtgctc aaacactaac cgtac 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gattggtggt ttattgggaa acg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcaggtctt tgtttctgcc g 21
机译: 治疗中枢性视神经角膜区损伤的神经营养性野兔眼角膜炎的方法
机译: 包含胸腺素β4作为有效成分的神经营养性角膜炎治疗组合物
机译: 神经营养性角膜炎的建模方法