细胞片的制造方法、心肌细胞片和用于制造心肌细胞片的试剂盒

技术领域

本发明涉及细胞片的制造方法、心肌细胞片和用于制造心肌细胞片的试剂盒。

背景技术

用于移植的细胞片通过下述方式制备：利用细胞的粘接力，使细胞粘接在培养皿的底面等基材上进行培养(例如，参照专利文献1)。通过粘接培养而形成在支撑体上的细胞片，在使用时需要从支撑体上剥离，但是细胞的粘接力会造成妨碍，难以在保持细胞片形态的同时从支撑体剥离。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2011/058813

发明内容

发明所解决的技术问题

本发明的目的是，提供一种用于制造细胞片的技术，所述技术不会发生从支撑体剥离细胞片时所伴随的细胞片的破坏。

解决问题的技术手段

根据一个方案，提供一种制造细胞片的方法，所述方法包含下述工序：在使动物细胞朝培养液的中央方向集中的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，在所述培养液中形成悬浮的细胞片。

根据另一个方案，提供具有80～100％的心肌细胞纯度的心肌细胞片，所述心肌细胞纯度优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

根据另一个方案，提供用于制造心肌细胞片的试剂盒，所述试剂盒包含：源自iPS细胞的心肌细胞；用于培养所述心肌细胞的培养液；和容纳所述培养液的悬浮培养用容器。

发明效果

根据本发明，可提供一种用于制造细胞片的技术，所述技术不会发生从支撑体剥离细胞片时所伴随的细胞片的破坏。

附图说明

[图1]是用于说明“使动物细胞朝培养液的中央方向集中”的图。

[图2]是表示本发明的方法的优选方式的示意图。

[图3A]是表示24孔板中的心肌细胞片的制造例的照片。

[图3B]是表示24孔板中的心肌细胞片的制造例的照片。

[图4]是表示6cm皿(Dish)中的心肌细胞片的制造例的照片。

[图5]是表示10cm皿中的心肌细胞片的制造例的照片。

[图6]是表示不包含增稠剂的培养液中的心肌细胞片的制造例的照片。

[图7]是表示具有98％心肌细胞纯度的心肌细胞片的制造例的照片。

[图8]是表示小鼠成纤维细胞片的制造例的照片。

[图9]是表示人iPS细胞片的制造例的照片。

[图10]是表示具有四边形状的心肌细胞片的制造例的照片。

[图11]是表示人间充质干细胞片的制造例的照片。

具体实施方式

1.细胞片的制造方法

细胞片的制造方法包含下述工序：在使动物细胞朝培养液的中央方向集中的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，在培养液中形成悬浮的细胞片。

1-1.动物细胞

该方法中使用的动物细胞的动物的种类没有特别限定，优选为哺乳类、啮齿类，更优选为灵长类，进一步优选为人。

动物细胞没有特别限定，例如可举出：源自多能干细胞的分化细胞、从动物的组织中采集的分化细胞、多能干细胞、成体干细胞。“多能干细胞”是具有以下能力的干细胞：能够分化为构成生物体的所有细胞的多能性(pluripotency)和即使经过细胞分裂也能够保持其多能性的自我复制能力。“多能干细胞”包含胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)。“成体干细胞”是具有以下能力的干细胞：能够分化为特定细胞的限定分化能力和即使经过细胞分裂也能够保持其限定分化能力的自我复制能力。“成体干细胞”包含间充质干细胞。

动物细胞优选为源自多能干细胞的分化细胞，更优选为源自iPS细胞的分化细胞，进一步优选为源自iPS细胞的心肌细胞，最优选为源自iPS细胞的人心肌细胞。或者，动物细胞优选为成体干细胞，更优选为间充质干细胞，进一步优选为人间充质干细胞。

在动物细胞为源自多能干细胞的分化细胞的情况下，可通过公知的分化诱导法由多能干细胞制备。或者，源自多能干细胞的分化细胞可以使用市售品。在动物细胞为成体干细胞的情况下，可以使用从动物采集的，也可以使用市售品。

在动物细胞为源自多能干细胞的分化细胞的情况下，优选此类细胞具有较高的分化细胞纯度，例如80～100％的分化细胞纯度。在动物细胞为源自iPS细胞的心肌细胞的情况下，优选以80～100％的心肌细胞纯度包含源自iPS细胞的心肌细胞，更优选为85～100％，进一步优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。在本说明书中，细胞纯度的百分比表示基于细胞数量的百分比。心肌细胞纯度可通过以下方式求得：使用作为心肌标志物的心肌肌钙蛋白(cardiac troponin T，cTnT)、辅肌动蛋白(α-actinin)、心肌肌动蛋白(α-cardiac actin)、GATA-4等抗体通过流式细胞技术(flowcytometry)进行分析。

源自iPS细胞的心肌细胞是具有较高心肌细胞纯度的心肌细胞，可例如通过公知的无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法来制备(参照WO2015/182765)。由于无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法可实现较高的心肌分化效率，因此通过该方法制备的源自iPS细胞的心肌细胞可实现较高的心肌细胞纯度。

1-2.培养液和培养容器

培养液可使用：具有适用于培养所使用的动物细胞的组成的公知的培养液。在动物细胞为心肌细胞的情况下，培养液可使用公知的用于培养心肌细胞的培养液。优选用于培养心肌细胞的培养液包含缓冲液和无机盐类，所述无机盐类包含钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。更优选用于培养心肌细胞的培养液可以使用DMEM、RPMI、IMDM、Ham-12等基础培养基。基础培养基例如可从SIGMA ALDRICH JAPAN入手。例如，用于培养心肌细胞的培养液可以使用具有下述组成的培养液：

0.01～0.5g/L(例如，0.182g/L)的CaCl

0～1.0g/L(例如，0.09767g/L)的MgSO

0.1～1.0g/L(例如，0.4g/L)的KCl、

0～10.0g/L(例如，3.362g/L)的NaHCO

1.0～20.0g/L(例如，5.4525g/L)的NaCl、

0～1.0g/L(例如，0.109g/L)的Na

0～20.0g/L(例如，5.958g/L)的HEPES。

培养液可以不包含血清，也可以以相对于血清添加前的培养液为40质量％以下的量包含血清。培养液的pH没有特别限定，优选为6.0～9.0，更优选为7.0～8.0。

为了细胞的悬浮培养和细胞片形成，优选将培养液装入容器中并使得培养液的深度为例如5mm以上，优选为5～50mm。

从细胞片的制造效率的观点出发，优选培养液进一步包含增稠剂。当培养液中包含增稠剂时，培养液被赋予粘度。其结果，可使动物细胞在培养液中不易沉入容器底面，同时稳定地保持悬浮状态。此外，动物细胞与培养液的摩擦减少，动物细胞变得易于在培养液中移动。当增稠剂存在于培养液中时，动物细胞易于在培养液中以悬浮的状态聚集成片状，由此，能够提高细胞片形成的效率。另一方面，从细胞片的移植利用的观点出发，为了消除增稠剂对于细胞片的附着的可能性，优选培养液不包含增稠剂。

增稠剂只要能够赋予培养液粘度就没有特别限定，例如可使用：甲基纤维素、聚乙二醇、黄原胶、结冷胶、胶原蛋白、透明质酸、Hystem(注册商标)等。可将增稠剂以制备具有例如10～3000mPa·S，优选50～1000mPa·S的粘度的培养液所需要的量而添加至培养液中。即，包含增稠剂的培养液例如具有10～3000mPa·S的粘度，优选50～1000mPa·S的粘度。本说明书中“粘度”是指25℃下的粘度。在使用甲基纤维素(例如R&D Systems,Inc.HSC001)作为增稠剂的情况下，例如可以甲基纤维素重量计为0.001～0.01g/mL的浓度添加至培养液中。

容纳培养液的容器可使用适用于悬浮培养的任意容器。容器优选具有细胞粘接性较低的内壁。例如，可使用内壁上施加了涂层的容器，所述涂层抑制细胞对容器的粘接。这样的悬浮培养用容器是众所周知并且市售的。涂层已知有下述涂层：例如使用Poly-HEMA即聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)得到的涂层、或使用MPC即2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱而得到的涂层。

容器优选为平底容器。平底容器适用于使悬浮培养中的动物细胞集中为片状。平底容器的底面的形状是任意形状，可以为圆形，也可以为四边形。在本发明的方法中，制造具有与平底容器的底面相似形状的细胞片，因此，在制造圆形的细胞片的情况下，优选使用具有圆形的底面的平底容器。

容器可使用市售的悬浮培养用平底容器，可使用：悬浮培养用皿、悬浮培养用烧瓶、悬浮培养用板(即，微量滴定板)等。更具体而言，可使用：直径3.5～10cm的悬浮培养用皿、培养面积12.5～225cm

1-3.悬浮培养

将动物细胞接种至悬浮培养用培养液中，并使其分散在培养液中。此时，优选使动物细胞以单个细胞的状态即细胞分离的状态，分散于培养液中。用于接种至培养液中的动物细胞可通过用蛋白质分解酶对细胞块进行处理来制备。

动物细胞优选在悬浮培养开始时以适于形成细胞片的细胞密度存在于培养液中。动物细胞优选在悬浮培养开始时以例如0.1×10

在本发明的方法中，在使动物细胞朝培养液的中央方向集中的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养。优选在使动物细胞朝培养液的中央方向集中的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，以使其整体形成为片状。

将用于说明“使动物细胞朝培养液的中央方向集中”的图示于图1。在本说明书中，“使动物细胞朝培养液的中央方向集中”是指，以使培养液中的各细胞朝“通过培养液的重心与重力方向平行的直线”移动的方式使动物细胞集中(参照图1)。优选“使动物细胞朝培养液的中央方向集中”是指，以使培养液中的各细胞朝“通过培养液的重心与重力方向平行的直线”并且沿大致水平方向移动的方式使动物细胞集中(参照图1)。在本说明书中，“大致水平方向”是指相对于重力方向为90°±10°的方向，优选为相对于重力方向为90°±5°的方向。

可通过使动物细胞朝培养液的中央方向集中，来增加悬浮培养中细胞彼此接触的机会，由此使得细胞彼此粘接，通过重复该过程，而能够在不使用支撑体的情况下在培养液中形成悬浮的细胞片。

因此，就悬浮培养而言，只要能够使动物细胞朝培养液的中央方向集中，就可通过任意方法进行。悬浮培养优选通过对培养液施加振动来进行。或者，悬浮培养可以通过对培养液发射朝向培养液的中央方向的声波来进行。

悬浮培养可在适用于所使用的动物细胞的培养条件下进行。在心肌细胞的情况下，悬浮培养可在5％CO

在优选方式中，细胞片的制造方法包含下述工序：在对培养液施加振动的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，在培养液中形成悬浮的细胞片。

将本发明的方法的优选方式示意性地示于图2。图2的(a)表示动物细胞1分散在培养容器3容纳的培养液2中的情况，图2的(b)表示在对培养液2施加振动的同时对动物细胞1进行悬浮培养时，动物细胞1朝培养液2的中央方向缓慢聚集的情况，图2的(c)表示，当连续进行悬浮培养时，动物细胞1自集合成片状，彼此粘接并形成细胞片4的情况。

可通过对培养液施加振动，来增加悬浮培养中的细胞彼此接触的机会，由此使得细胞彼此粘接，通过重复该过程，而在不使用支撑体的情况下在培养液中形成悬浮的细胞片。

因此，只要能够增加悬浮培养中的细胞彼此接触的机会，由此使细胞彼此粘接，就可采用任意振动条件。

振动优选为与重力方向交叉的方向的振动，更优选为大致与重力方向垂直的方向的振动。由此，使得悬浮培养中的细胞可高效地接触并高效地粘接。在本说明书中，“大致与重力方向垂直的方向”是指相对于重力方向为90°±10°的方向，优选为相对于重力方向为90°±5°的方向。振动更优选为与重力方向垂直的方向(即，水平方向)的振动。

振动可以是往复振动，但优选为旋转振动。在本说明书中，“旋转振动”是伴随旋转体的旋转运动所产生的振动，例如是圆周运动状的振动。

可通过旋转振动，例如圆周运动状的振动，来使细胞高效地朝培养液的中央方向集中。振动更优选为大致与重力方向垂直的方向的圆周运动状的振动。振动进一步优选为与重力方向垂直的方向(即，水平方向)的圆周运动状的振动。

振动的频率通常为1～10000Hz，优选为2～3000Hz，更优选为5～100Hz，进一步优选为10～50Hz，振幅通常为0.1～10000μm，优选为0.5～100μm，更优选为0.5～10μm，进一步优选为1～10μm。需要说明的是，在振动为旋转振动的情况下，所述的“振幅”是指与旋转轴垂直的第1方向的振幅和与旋转轴和第1方向垂直的第2方向的振幅。

施加振动时的悬浮培养可使用例如振动施加装置来进行。作为一个实例，振动施加装置包含：在内部具有用于对细胞进行静置培养的培养空间的培养器主体；和安装在培养器主体的内部并用于对培养容器施加振动的振动发生器。

就培养器主体而言，由于需要在提供以满足适用于细胞培养的环境条件(温度、湿度、氛围等)的方式进行管理的密封空间的同时，可从培养容器进行存取，因此在前面具备开闭式的门。培养器主体通常具备用于放置培养容器的载置台。培养器主体的内部空间可进行换气，也可不进行换气。

振动发生器安装于培养器主体的内部。振动发生器可以设置在培养器主体的顶部，也可以设置在用于放置培养容器的载置台上。振动发生器包含例如马达。振动发生器优选以使得马达的旋转轴与重力方向平行的方式安装于培养器主体的内部。

通常而言，在整个悬浮培养期间连续性地对培养液施加振动。优选至少在直至形成细胞片的期间连续性地对培养液施加振动。就振动而言，只要能够使细胞朝培养液的中央方向集中，就可以连续性地施加，也可以间歇性地施加。

细胞片的制造是否完成，可通过下述方式进行判断：在通过肉眼观察确认细胞片的制造的同时，摇晃培养容器并确认细胞片是否保持完整性。

1-4.效果

本发明的方法可通过悬浮培养在培养液中形成悬浮的细胞片。因此，本发明的方法与通过粘接培养在支撑体上制造细胞片的情况不同，不需要从支撑体剥离细胞片，可直接用作移植材料。此外，本发明的方法可在不发生从支撑体剥离细胞片时所伴随的细胞片的破坏的情况下制造细胞片。

此外，由于本发明的方法可通过进行约1天的悬浮培养来制造细胞片，因此是可在短期间内制造细胞片的非常简便的方法，适用于细胞片的大量生产。

此外，根据本发明的方法，可制造期望片化的目标细胞的纯度较高的细胞片。即，可制造细胞纯度较高的细胞片，而不需要以往制造细胞片所需要的成纤维细胞等额外的细胞。本发明人等证实了，可制造具有高达98％的心肌细胞纯度的心肌细胞片。由于心肌细胞不会癌变，因此心肌细胞纯度较高的心肌细胞片具有：在移植后，癌变的风险较低这样的优点。

此外，根据本发明的方法，可制造具有均匀的形状的细胞片。在本说明书中，“均匀的形状”是指细胞片在通过肉眼观察时，细胞片的平面的90％以上的面积具有大致均匀的厚度，并且显示出与培养容器底面相似的形状。“细胞片在通过肉眼观察时，细胞片的平面的90％以上的面积具有大致均匀的厚度”意味着，可在细胞片的一小部分位置(例如，片的边缘、中央部分的一小部分位置等)存在厚度极薄的部分。换而言之，只要细胞片在通过肉眼观察时，细胞片的平面的90％以上的面积具有大致均匀的厚度，在实际使用上就没问题。“大致均匀的厚度”是指，例如在细胞片的平面的90％以上的面积中，最小的厚度和最大的厚度在其中间值±25％的范围内，优选在其中间值±20％的范围内。显然，由于细胞片是培养液中分散的细胞通过集合而形成，难以控制细胞片的形状，因此“与培养容器底面相似的形状”的表述并不代表严格相似的形状。“均匀的形状”的表述，以排除细胞片被破坏的情况、表现出收缩卷曲的形状的情况的意义进行使用。作为培养容器，在使用容器底面为正圆的平底容器的情况下，“均匀的形状”是指，在通过肉眼观察时，细胞片的整个片具有大致均匀的厚度，并且显示与完美的圆形相似的形状(即，大致圆形的形状)。

此外，本发明的方法可通过改变培养容器的底面尺寸，来自由地控制细胞片的尺寸，制造较大尺寸的细胞片。例如在圆形片的情况下，可制造直径5cm以上的细胞片。此外，由于本发明的方法可制造具有与培养容器的底面相似的形状的细胞片，因此可通过改变培养容器的底面的形状，来自由地控制细胞片的形状。

此外，由于根据本发明的方法，可制造具有足够的强度，并且容易处理的细胞片，因此具有移植时易于使用这样的优点。例如，本发明的细胞片可用刮刀等捞起并贴附在移植部位。

另一方面，常规的方法(WO2011/058813)通过将成肌细胞与成肌细胞以外的细胞(间充质干细胞、成纤维细胞等)混合并粘接培养来制造细胞片，在细胞片的形成中，除了期望片化的目标细胞之外，还必须添加额外的细胞。在本申请申请日的时间点阶段，这种常规的方法(即，利用了额外细胞的通过粘接培养进行的方法)是该技术领域的主流，临床研究刚刚开始使用通过这种常规的方法制造的心肌细胞片。本发明人等试图使用常规的方法(WO2011/058813)制造具有80％以上的心肌细胞纯度的心肌细胞片，但是从支撑体剥离细胞片时细胞片会被破坏，或收缩卷曲，无法制造具有均匀的形状的片。

如上所述，在本发明的方法中，即使几乎不存在期望片化的目标细胞以外的细胞，也能够制造具有均匀的形状和足够的强度的细胞片。认为这是因为，在悬浮培养中，细胞在几乎没有间隙并密集的状态下自集合为片状，彼此粘接并片化。本发明的方法推翻了必须在细胞片的制成中添加额外的细胞这样的本申请申请时的技术常识，可采用与以往完全不同的手法来制造细胞纯度较高的细胞片，是划时代的方法。

2.细胞片

根据另一个方案，提供通过上述方法制造的细胞片。本发明的细胞片具有上述“1-4.效果”的项中所述的效果。

由于本发明的细胞片在制造时，除了期望片化的目标细胞之外，不需要成纤维细胞等额外的细胞，因此期望片化的目标细胞的纯度较高。具体而言，本发明的细胞片优选具有80～100％的目标细胞纯度，更优选为85～100％，进一步优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。细胞片的目标细胞纯度与用于形成片所使用的原料细胞中的目标细胞纯度大致相同。

此外，本发明的细胞片优选具有均匀的形状。此外，本发明的细胞片优选不包含目标细胞以外的细胞。即，本发明的细胞片优选具有100％的目标细胞纯度。本发明的细胞片优选不包含成纤维细胞。

此外，本发明的细胞片可根据目的而制成各种尺寸的片。例如，在用于移植至小型动物或筛选药物反应而制造细胞片的情况下，可制成较小的尺寸。或者，在移植至大型动物或检查较大组织特有的药物反应而制造细胞片的情况下，可制成较大的尺寸。本发明的细胞片例如具有0.1～30cm的最大长度，优选为1～10cm。在本说明书中，“最大长度”是指细胞片的平面的轮郭上的两点连成的线中最长的长度。在细胞片为圆形的情况下，例如具有0.1～30cm的最大长度，优选为1～10cm。在细胞片具有大致正圆的形状的情况下，例如具有0.1～30cm的直径，优选1～10cm。在细胞片为四边形的情况下，例如具有0.1～30cm的最大长度，优选1～10cm。细胞片例如具有0.01～1cm的厚度。

细胞片是任意动物种类的任意细胞类型的片，但是优选为心肌细胞片，更优选为人心肌细胞片。本发明的心肌细胞片具有上述“1-4.效果”的项中所述的效果。

本发明的心肌细胞片具有较高的心肌细胞纯度。具体而言，心肌细胞片优选具有80～100％的心肌细胞纯度，更优选为85～100％，进一步优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。人心肌细胞片具有优选为80～100％的人心肌细胞纯度，更优选为85～100％，进一步优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。心肌细胞片的心肌细胞纯度与用于形成片所使用的原料细胞中的心肌细胞纯度大致相同。

本发明的心肌细胞片优选具有均匀的形状。此外，本发明的心肌细胞片优选不包含心肌细胞以外的细胞。即，本发明的心肌细胞片优选具有100％的心肌细胞纯度。本发明的心肌细胞片优选不包含成纤维细胞。

此外，本发明的心肌细胞片可根据目的而制成各种尺寸的片，可制成较大尺寸。本发明的心肌细胞片例如具有0.1～30cm的最大长度，优选1～10cm。在心肌细胞片为圆形的情况下，例如具有0.1～30cm的最大长度，优选1～10cm。在心肌细胞片具有大致正圆的形状的情况下，例如具有0.1～30cm的直径，优选1～10cm。在心肌细胞片为四边形的情况下，例如具有0.1～30cm的最大长度，优选1～10cm。

3.用于制造心肌细胞片的试剂盒

根据另一个方案，提供一种用于制造心肌细胞片的试剂盒，所述试剂盒包含：

源自iPS细胞的心肌细胞；

用于培养心肌细胞的培养液；和

容纳培养液的悬浮培养用容器。

在本发明的试剂盒中，源自iPS细胞的心肌细胞优选具有80～100％的心肌细胞纯度，更优选为85～100％，进一步优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。这种心肌细胞可如上所述通过公知的无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法来制备(参照WO2015/182765)。

心肌细胞可以是通过公知的无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法制备的心肌细胞块，也可以是通过将通过公知的无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法制备的心肌细胞块用蛋白质分解酶进行处理而得到的单个细胞的集团。“单个细胞的集团”是指细胞彼此不附着并处于分离的状态。

在本发明的试剂盒中，培养液可使用公知的用于培养心肌细胞的培养液。就培养液而言，例如可制成上述“1-2.培养液和培养容器”的项中所述的“用于培养心肌细胞的培养液”。如上所述培养液可以不包含血清，但是优选包含血清。在培养液包含血清的情况下，可相对于血清添加前的培养液以例如40质量％以下的量包含血清。

培养液如上述“1-2.培养液和培养容器”的项中所述，在制造细胞片时可以包含增稠剂。因此，试剂盒中包含的培养液可以预先包含增稠剂。在这种情况下，通常而言，增稠剂以赋予培养液以期望的粘度所需要的量而包含在培养液中。或者，试剂盒中包含的培养液不包含增稠剂，并且增稠剂可以通过与培养液分别单独封装的方式包含在试剂盒。在这种情况下，通常而言，增稠剂以赋予培养液以期望的粘度所需要的量而包含在试剂盒中。在增稠剂通过与培养液分别单独封装的方式包含在试剂盒中的情况下，用户需要在制造细胞片前，将增稠剂添加至培养液中。

在本发明的试剂盒中，悬浮培养用容器可设为上述“1-2.培养液和培养容器”的项中所述的培养容器。即，悬浮培养用容器可使用上述“1-2.培养液和培养容器”的项中所例举的容器。

如上所述，优选悬浮培养用容器具有细胞粘接性较低的内壁。如上所述，优选悬浮培养用容器被施加有涂层，所述涂层抑制细胞与该容器的内壁粘接。涂层已知有下述涂层：使用Poly-HEMA即聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)而得到的涂层；或使用MPC即2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱而得到的涂层。

本发明的试剂盒可以进一步包含记载了制备心肌细胞片的步骤的说明书。该说明书记载了上述“1-3.悬浮培养”的项中所述的悬浮培养的方法，以使用户能够制造心肌细胞片。

在本发明的试剂盒中，根据期望制造的细胞片的尺寸、即悬浮培养用容器的底面尺寸，将源自iPS细胞的心肌细胞以适当的量包含在试剂盒内中。此外，在本发明的试剂盒中，根据悬浮培养用容器的尺寸，将培养液以适当的量包含在试剂盒内中。例如，在将具有直径6cm的圆形底面和10mL容量的悬浮培养用容器包含在试剂盒内中的情况下，可将1～100×10e6个的心肌细胞和1～1000mL的培养液包含在试剂盒内。

4.优选的实施方式

以下，总结表示本发明的优选实施方式。

项[1]一种细胞片的制造方法，其包含下述工序：在使动物细胞朝培养液的中央方向集中的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，在所述培养液中形成悬浮的细胞片。

项[2]根据项[1]所述的方法，其中，通过对所述培养液施加振动来进行所述悬浮培养。

项[3]一种细胞片的制造方法，其包含下述工序：在对所述培养液施加振动的同时对培养液中分散的动物细胞进行悬浮培养，在所述培养液中形成悬浮的细胞片。

项[4]根据项[2]或项[3]所述的方法，其中，所述振动是大致与重力方向垂直的方向的振动，优选是与重力方向垂直的方向的振动。

项[5]根据项[2]～[4]中任一项所述的方法，其中，所述振动为旋转振动。

项[6]根据项[2]～[5]中任一项所述的方法，其中，所述振动是圆周运动状的振动。

项[7]根据项[2]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述振动是大致与重力方向垂直的方向的圆周运动状的振动，优选是与重力方向垂直的方向的圆周运动状的振动。

项[8]根据项[2]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述振动具有1～10000Hz的频率，优选为2～3000Hz，更优选为5～100Hz，进一步优选为10～50Hz。

项[9]根据项[2]～[8]中任一项所述的方法，其中，所述振动具有0.1～10000μm的振幅，优选为0.5～100μm，更优选为0.5～10μm，进一步优选为1～10μm。

项[10]根据项[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，所述培养液具有5mm以上的深度，优选为5～50mm。

项[11]根据项[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述培养液包含增稠剂。

项[12]根据项[11]所述的方法，其中，使所述增稠剂以制备具有10～3000mPa·S，优选为50～1000mPa·S的粘度的培养液所需要的量而包含在培养液中。

项[13]根据项[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，容纳所述培养液的容器为平底容器。

项[14]根据项[1]～[13]中任一项所述的方法，其中，容纳所述培养液的容器被施加有涂层，所述涂层抑制细胞与该容器内壁的粘接。

项[15]根据项[1]～[14]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞在所述悬浮培养开始时以0.1×10

项[16]根据项[1]～[15]中任一项所述的方法，其中，所述悬浮培养在5％CO

项[17]根据项[1]～[16]中任一项所述的方法，其中，所述悬浮培养在20～43℃的温度下进行。

项[18]根据项[1]～[17]中任一项所述的方法，其中，所述悬浮培养进行6小时以上，优选进行12～24小时。

项[19]根据项[1]～[18]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞为哺乳类或啮齿类的细胞，优选为灵长类的细胞，更优选为人的细胞。

项[20]根据项[1]～[19]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞包含：源自多能干细胞的分化细胞、从动物的组织中采集的分化细胞、多能干细胞或成体干细胞。

项[21]根据项[1]～[20]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞包含源自多能干细胞的分化细胞。

项[22]根据项[1]～[21]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞包含源自iPS细胞的分化细胞。

项[23]根据项[1]～[22]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞包含源自iPS细胞的心肌细胞。

项[24]根据项[1]～[23]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞以80～100％的心肌细胞纯度包含源自iPS细胞的心肌细胞，优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

项[25]根据项[23]或项[24]所述的方法，其中，所述源自iPS细胞的心肌细胞为源自iPS细胞的人心肌细胞。

项[26]根据项[1]～[20]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞为间充质干细胞。

项[27]根据项[1]～[21]中任一项所述的方法，其中，所述动物细胞为人间充质干细胞。

项[28]一种细胞片，其通过项[1]～[27]中任一项所述的方法制造。

项[29]根据项[28]所述的细胞片，其具有80～100％的心肌细胞纯度，所述心肌细胞纯度优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

项[30]一种心肌细胞片，其通过项[1]～[27]中任一项所述的方法制造。

项[31]根据项[30]所述的心肌细胞片，其具有80～100％的心肌细胞纯度，所述心肌细胞纯度优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

项[32]一种心肌细胞片，其具有80～100％的心肌细胞纯度，所述心肌细胞纯度优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

项[33]根据项[30]～[32]中任一项所述的心肌细胞片，其具有均匀的形状。

项[34]根据项[30]～[33]中任一项所述的心肌细胞片，其不包含心肌细胞以外的细胞。

项[35]根据项[30]～[34]中任一项所述的心肌细胞片，其具有0.1～30cm的最大长度，优选为1～10cm。

项[36]根据项[30]～[35]中任一项所述的心肌细胞片，其具有圆形或四边形的形状。

项[37]根据项[30]～[36]中任一项所述的心肌细胞片，其中，所述心肌细胞片为哺乳类或啮齿类的心肌细胞片，优选为灵长类的心肌细胞片，更优选为人的心肌细胞片。

项[38]一种用于制造心肌细胞片的试剂盒，其包含：

源自iPS细胞的心肌细胞；

用于培养所述心肌细胞的培养液；和

容纳所述培养液的悬浮培养用容器。

项[39]根据项[38]所述的试剂盒，其中，所述容器被施加有涂层，所述涂层抑制细胞与该容器内壁的粘接。

项[40]根据项[38]或项[39]所述的试剂盒，其中，所述心肌细胞具有80～100％的心肌细胞纯度，所述心肌细胞纯度优选为85～100％，更优选为90～100％，进一步优选为95～100％，最优选为98～100％。

项[41]根据项[38]～[40]中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含用于赋予所述培养液粘度的增稠剂。

项[42]根据项[38]～[41]中任一项所述的试剂盒，其中，所述容器为平底容器。

项[43]根据项[38]～[42]中任一项所述的试剂盒，其中，所述心肌细胞为哺乳类或啮齿类的心肌细胞，优选为灵长类的心肌细胞，更优选为人的心肌细胞。

实施例

[实施例1]心肌细胞片的制造

(1)方法

使用无蛋白心肌分化诱导(PFCD)法，由人iPS细胞(京都大学iPS细胞研究所253G1株)，制备心肌细胞纯度85～98％的心肌细胞块(即，具有数百微米～数毫米的尺寸的心肌细胞凝聚体)(参照WO2015/182765)。心肌细胞纯度通过以下方式求得：使用作为心肌标志物的cTnT抗体并通过流式细胞技术(flowcytometry)进行分析。

将得到的心肌细胞块用包含0.25％的胰朊酶的蛋白酶溶液进行20～40分钟处理，分散为分离的单个心肌细胞。

对分散的单个心肌细胞进行离心操作，除去包含蛋白酶溶液的上清夜。然后，将得到的心肌细胞悬浮在添加了20％甲基纤维素、20％FBS、10μM Y 27632(Rho结合激酶抑制剂)的DMEM或IMDM基础培养基中。

以1×10

超低吸附96孔板(CORNING)

超低吸附24孔板(CORNING)

超低吸附6孔板(CORNING)

超低吸附6cm皿(CORNING)

超低吸附10cm皿(CORNING)

将培养容器转移至具备培养器主体和振动发生器的振动施加装置中，在37℃，5％CO

振动条件如下(参照后述的“(3)振动的测定”的项)。

种类：大致水平方向的圆周运动状的振动

频率：20Hz(1200rpm)

振幅：0.5～3.0μm

在实施本发明的方法的期间，将培养容器直接静置在金属板上，在培养容器下什么都不放置。另一方面，在实施比较例的方法的期间，在培养容器下放置与培养容器相同的空容器，或者在培养容器下放置防振材料(缓冲垫)。

从培养开始20～24小时后，通过肉眼观察确认是否形成了心肌细胞片。

(2)结果

在将培养容器直接静置在金属板上的情况下，形成具有0.1～8cm的直径的圆形的心肌细胞片。然后确认了，即使用手摇晃振动培养容器，片的形状也保持圆形。具体的结果如下。

在超低吸附96孔板的情况下，形成直径约1mm～数mm的圆形的心肌细胞片。

在超低吸附24孔板的情况下，形成直径约0.5～1cm的圆形的心肌细胞片。将得到的心肌细胞片的照片示于图3A和3B。

在超低吸附6孔板的情况下，形成直径约1～3cm的圆形的心肌细胞片。

在超低吸附6cm皿的情况下，形成直径约2～5cm的圆形的心肌细胞片。将得到的心肌细胞片的照片示于图4。

在超低吸附10cm皿的情况下，形成直径约4～8cm的圆形的心肌细胞片。将得到的心肌细胞片的照片示于图5。

所有心肌细胞片均可确认跳动和细胞内钙荧光。

所有心肌细胞片均具有与用于形成片所使用的原料细胞中的心肌细胞纯度相同的85～98％心肌细胞纯度。由于本发明的方法不需要目标细胞以外的额外细胞来形成细胞片，因此可通过使用具有较高心肌细胞纯度的原料细胞，来制造具有较高心肌细胞纯度的细胞片。

此外，所有心肌细胞片均具有均匀的形状。即，所有心肌细胞片均在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。

此外，所有心肌细胞片均具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。

此外，由所述结果证实，本发明的方法可通过改变培养容器的底面尺寸来自由地控制细胞片的尺寸。

另一方面，在培养容器下放置了与培养容器相同的空容器的情况下，形成多个带孔的分离的片，不能形成保持完整性的1个片。在培养容器下放置了防振材料(缓冲垫)的情况下也形成多个带孔的分离的片，不能形成保持完整性的1个片。

(3)振动的测定

振动通过振动测定装置(LKーG5000位移计KEYENCE公司)进行测定。在以下三个位置测定振动：金属板(即，用于放置培养容器的台)、培养容器和振动施加装置主体。

在装置的深度方向上测定金属板的水平方向的振动。金属板的水平方向的振动为：频率20Hz(1200rpm)、振幅0.5～3.0μm。

在装置的深度方向上测定培养容器的水平方向的振动。培养容器的水平方向的振动为：频率20Hz(1200rpm)和振幅0.5～3.0μm。

在装置的宽度方向和深度方向这两个方向上测定振动施加装置的水平方向的振动。宽度方向的振动为：频率20Hz(1200rpm)和振幅0.5～3.0μm。深度方向的振动为：频率20Hz(1200rpm)和振幅0.5～3.0μm。

在金属板、培养容器和振动施加装置主体这三个位置中，测定到相同频率和相同振幅。此外，在宽度方向和深度方向上，测定到相同频率和相同振幅。由此认为，通过振动施加装置而发生大致水平方向的圆周运动状的振动。

另一方面，在培养容器下放置了与培养容器相同的空容器情况、在培养容器下放置了防振材料(缓冲垫)的情况下，当对培养容器的水平方向的振动进行测定时，仅偶尔观察到非常小的振幅。

(4)考察

推测在本实施例中形成细胞片的机理如下。通过大致水平方向的圆周运动状的振动，对培养容器的侧壁附近的培养液施加强振动，对培养容器的中央附近的培养液施加比侧壁附近的培养液弱的振动。由此，使得培养液中分散的各细胞一边振动一边从该细胞存在的位置向施加较弱振动的位置(即，朝培养液的中央方向)缓慢移动，并朝培养液的中央方向聚集。其结果，认为形成了保持完整性的细胞片(参照图2)。

[实施例2]使用不包含增稠剂的培养液制造心肌细胞片

除了不向培养液中添加20％甲基纤维素之外，根据与实施例1同样的方法制造心肌细胞片。培养容器使用超低吸附96孔板(CORNING)。以1×10

即使不在培养液中添加增稠剂，也能够形成直径5mm左右的圆形的心肌细胞片。将得到的心肌细胞片的照片示于图6。在图6中，左侧的照片表示1×10

所有心肌细胞片的心肌细胞纯度均为95.0％。此外，所有心肌细胞片均具有均匀的形状。即，所有心肌细胞片均在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。此外，所有心肌细胞片均具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。

[实施例3]具有98％的心肌细胞纯度的心肌细胞片的制造

对具有98％的心肌细胞纯度的心肌细胞块进行分化诱导，将其接种至培养容器中，除此之外，根据与实施例1同样的方法制造心肌细胞片。培养容器使用超低吸附6cm皿(CORNING)。以2.2×10

可形成具有98％的心肌细胞纯度的心肌细胞片。直径为约3cm。将得到的心肌细胞片的照片示于图7。

心肌细胞片具有均匀的形状。即，心肌细胞片在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。此外，心肌细胞片具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。从心肌细胞的增殖性较低的方面出发，具有较高心肌细胞纯度的心肌细胞片易于控制品质，并且在用于移植的情况下具有成瘤性的风险较低这样的优点。

[实施例4]小鼠成纤维细胞片和人iPS细胞片的制造

除了将小鼠胎儿成纤维细胞(MEF饲养细胞COSMO BIO CBA-311)接种至培养容器中之外，根据与实施例1同样的方法制造细胞片。培养容器使用超低吸附24孔板。以2×10

在使用成纤维细胞的情况下也能够形成细胞片。直径为约1.5cm。将得到的成纤维细胞片的照片示于图8。

成纤维细胞片的成纤维细胞纯度为100％。此外，成纤维细胞片具有均匀的形状。即，成纤维细胞片在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。此外，成纤维细胞片具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。成纤维细胞片可用于培养皮肤、结缔组织的移植等。

此外，除了将人iPS细胞(京都大学iPS细胞研究所253G1株)接种至培养容器中之外，根据与实施例1同样的方法制造细胞片。培养容器使用超低吸附24孔板(CORNING)。以2.5×10

在使用未分化的iPS细胞的情况下也能够形成细胞片。直径为约0.7cm。将得到的iPS细胞片的照片示于图9。

iPS细胞片的iPS细胞纯度为99％。此外，iPS细胞片具有均匀的形状。即，iPS细胞片在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。此外，iPS细胞片具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。iPS细胞片可用于各种组织分化培养。

[实施例5]四边形状的细胞片的制造

除了使用超低吸附T25烧瓶(CORNING)作为培养容器之外，根据与实施例1同样的方法制造心肌细胞片。以3×10

在使用具有四边形状的底面的容器的情况下也能够形成心肌细胞片。心肌细胞片的尺寸为约1.0×约2.5cm。将得到的心肌细胞片的照片示于图10。

心肌细胞片的心肌细胞纯度为95％。此外，心肌细胞片具有均匀的形状。即，心肌细胞片在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有与容器底面相似的四边形状。此外，心肌细胞片具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。

由所述结果证实，本发明的方法可通过改变培养容器的底面的形状，来自由地控制细胞片的形状。

[实施例6]人间充质干细胞片的制造

除了将人间充质干细胞(hMSC LONZA PT-2501)接种至培养容器中之外，根据与实施例1同样的方法制造细胞片。培养容器使用超低吸附6孔板。以2×10

在使用人间充质干细胞的情况下也能够形成细胞片。最大长度为约1.8cm。将得到的成纤维细胞片的照片示于图11。

人间充质干细胞片的细胞纯度为100％。此外，人间充质干细胞片具有比较均匀的形状。即，人间充质干细胞片在通过肉眼观察时，整个片具有大致均匀的厚度，并且具有大致圆形的形状。此外，人间充质干细胞片具有足够的强度，可用刮刀捞取并处理。人间充质干细胞片可用于心肌梗塞、下肢缺血、移植到伤口等。