CircPPM1F介导巨噬细胞炎症反应及其在制备T1DM药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种环状RNA的新用途，具体为circPPM1F在制备I型糖尿病药物中的应用。

背景技术

1型糖尿病(type 1diabetes mellitus，T1DM)又称胰岛素依赖性糖尿病，是由T细胞介导的自身免疫系统对胰岛β细胞进行特异性损伤而引起的一种器官特异性的自身免疫疾病[1]。T1DM多发生于青少年时期，临床症状较严重，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势，严重危害患者的生活质量及身心健康。T1DM的致病机理非常复杂，胰岛β细胞自身抗原，机体免疫系统的T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及由这些免疫细胞所分泌的细胞因子和炎症因子等在T1DM的发病过程中起到了非常重要的作用[2-4]。

在T1DM的发病过程中，巨噬细胞是最早浸润胰岛的细胞之一，提示巨噬细胞在T1DM发病过程中发挥着重要作用。巨噬细胞作为一类功能多样性的免疫细胞，其功能依赖于激活状态，其中由LPS和IFN-γ等激活的M1型巨噬细胞可增强炎症反应、促进T1DM的发生[5]，而与免疫调节和修复相关的M2型巨噬细胞则控制炎症，减轻自身免疫反应，调节T1DM的病理过程。Calderon等研究证明，在非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠体内，采用氯磷酸盐脂质体清除M1型巨噬细胞，可减轻胰岛炎并控制疾病进程[6]。同时研究发现，在炎细胞浸润的胰岛中，巨噬细胞以M1型为主，其产生的细胞因子包括IL-1β、TNF-α和IFN-γ等，IL-1β和TNF-α联合IFN-γ可诱导胰岛β细胞凋亡[7]。此外，M1型巨噬细胞也可通过诱导Th1/Th17亚群失衡或分泌炎性细胞因子改变细胞因子微环境，从而参与包括T1DM在内的多种自身免疫病的发生[8]。因此研究巨噬细胞激活的调控机制，对于探究T1DM的发病机制、诊疗和预防措施都有着十分重要的意义。

与本发明有关的参考文献：

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的I型糖尿病预防、诊断或者治疗的药物靶点。

在最近几年，非编码RNA(non-coding RNA)成为基因组中调控基因表达的研究新热点。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类经反向剪接后、由3'末端和5'末端共价结合形成的环状非编码RNA分子。高通量测序发现数千个circRNA广泛存在于多种生物细胞中，具有结构稳定、序列保守及细胞或组织特异性表达等特征[9,10]。circRNA在调控基因表达、翻译蛋白、吸附miRNA、与RNA结合蛋白(RBP)形成复合物等多个层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程，揭示其在人类的多种疾病的调控过程中起到极其重要的作用，有在未来成为疾病的新的检测标志物的潜力[11-14]。近来的研究表明，circRNA也参与到T1DM等自身免疫性疾病的发生发展过程。例如研究发现环状RNA CDR1as在胰岛细胞中通过阻碍miR-7的功能从而影响糖尿病患者的胰岛素分泌和胰岛β细胞的更新[15]。我们研究的circPPM1F(hsa_circ_0062444)通过正向调控LPS-TLR4通路，诱导LPS-巨噬细胞活化，进而促进T1DM的发生发展，可能成为T1DM预防、诊断和治疗的新靶点。本发明在此基础上完成。

本发明提供了一种环状RNA的应用，所述的环状RNA是circPPM1F；所述的应用是circPPM1F在制备I型糖尿病药物中的应用。

本发明中，circPPM1F能够抑制胰岛细胞的增殖或者促进其凋亡。

较好的，circPPM1F是I型糖尿病药物的靶标，例如，作为T1DM预防、诊断和治疗的新靶点。

较好的，所述的I型糖尿病药物针对NF-κB或者LPS-TLR4通路活性高的细胞。例如，所述的I型糖尿病药物针对活化的LPS-巨噬细胞。

本发明中，circPPM1F的检测包括以下步骤：

收集离体的PBMC细胞样本；

提取RNA；

对PBMC细胞中的环状RNA进行RT-qPCR测定；

计算和分析circPPM1F的表达情况。

相应的，本发明提供了一种I型糖尿病的检测试剂盒，其含有检测circPPM1F的试剂，例如引物探针或者抗体。

较好的，所述的检测试剂盒中含有circPPM1F的标准品。

通常，上述检测试剂盒中还含有说明书，或者阴性对照，等等。

本发明通过circRNA microarray分析，在T1DM患者PBMC中得到59个差异表达的circRNA，其中高表达的circPPM1F与炎症因子IL-6和IL-1β正相关，在巨噬细胞中，circPPM1F通过激活NF-κB信号正向调控LPS-TLR4通路，进而促进炎症因子的表达，最终抑制胰岛细胞增殖，并促进凋亡，介导T1DM的发生发展。

circRNA作为一种新型调控分子，在人类多种疾病的发生和发展过程都有着重要作用，包括多种免疫相关疾病，比如，circRNA通过免疫反应因子NF90/NF110调节病毒感染[16]；mcircRasGEF1B在细菌引起的免疫反应中调控巨噬细胞活化[17]；hsa_circ_0020397通过吸附miR-138上调PD-L1的水平进而促进结肠直肠癌细胞的免疫逃逸[18]。多数circRNA来源于外显子区域，定位于细胞质，作为miRNA或蛋白质的海绵发挥作用，有些circRNA，尤其内含子来源的circRNA位于细胞核内，通过竞争性结合RBP影响hostgene表达，或者参与调控基因转录或反转录形成假基因[11]。circRNA环形的特点使其在细胞内或血液唾液中都比较稳定，具有作为诊断标志物诊断某些疾病的潜能[11]。例如circANKRD36在T2DM患者PBMC中显著高表达，并且其水平与炎症因子相关[19]。

circPPM1F在T1DM患者的PBMC中呈明显高表达，与炎症因子IL-6和IL-1β的表达水平具有正相关性，同时ROC曲线表明circPPM1F作为T1DM的诊断marker有着相当的可信度。另外，circPPM1F在机制上参与NF-κB信号通路的激活，抑制circPPM1F可减缓巨噬细胞的炎症反应，circPPM1F过表达会明显抑制胰岛细胞MIN6增殖，促进凋亡，损伤胰岛细胞功能。因此circPPM1F可能作为一个新的药物干预靶点，或者结合PD-L1等检查点抑制剂，为诊断和治疗T1DM带来新的希望。

附图说明

图1.儿童T1DM患者PBMC中高表达的circPPM1F与T1DM发展相关。(A)热图和火山图表示对儿童T1DM患者的PBMC进行circRNA microarray分析；(B，D)RT-qPCR检测circPPM1F、IL-6和IL-1β在T1DM和正常人中的表达水平；(C)ROC曲线评价circPPM1F区分T1DM患者和正常人的可信度；(E)circPPM1F表达水平与IL-6和IL-1β相关性分析。

图2.circPPM1F通过激活NF-κB通路促进LPS诱导的巨噬细胞激活。(A)circPPM1F在转录本上的定位及PCR测序；(B-D)在诱导的巨噬细胞中，使用siRNA降低circPPM1F的表达水平，LPS刺激细胞，qPCR检测LPS诱导的巨噬细胞激活相关基因的表达水平，westernblot检测检测LPS-TLR4通路下游激活的p65、JNK、p38和ERK磷酸化表达水平。

图3.circPPM1F通过促进LPS诱导的巨噬细胞激活损伤胰岛细胞。(A)CCK-8法检测共培养后MIN6细胞增殖情况；(B)AnnexinV-FITC/PI染色法检测共培养后MIN6细胞凋亡情况。

具体实施方式

材料和方法：

1细胞培养和转染

人单核细胞THP1购自ATCC，小鼠胰岛细胞MIN6和巨噬细胞Raw264.7购自FDCC。THP1和MIN6培养基为1640(含10％胎牛血清，100U/mL青霉素-链霉素)，MIN6培养基需再加50uM 2-巯基乙醇，Raw264.7培养基为DMEM(含丙酮酸钠，10％胎牛血清)。传代时，MIN6用0.05或0.25mM含EDTA胰酶消化，Raw264.7用细胞刮，THP1为悬浮细胞。37℃5％CO

siRNA按照LipoRNAiMAX说明书方法转染，质粒按照Lipo2000说明书转染。CircPPM1F的siRNA及相应的阴性对照来自上海吉玛公司。

2 RNA抽提和逆转录

将THP1诱导的巨噬细胞培养于24孔板，用LipoRNAiMAX脂质体转染方法转染circPPM1F的siRNA(200nM)及阴性对照(NC)，48h后加入LPS(200ng/mL，RD公司)，刺激3h后,除去上清，使用Trizol(Invitrogen公司产品)抽提RNA。

mRNA和circRNA的逆转录采用PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa公司)，加样体系为10ul，逆转录反应条件为37℃15min，85℃5s。

3实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

在

4免疫印迹实验(western blot)

将THP1诱导的巨噬细胞培养于6孔板，用LipoRNAiMAX脂质体转染方法转染circPPM1F的siRNA(200nM)及阴性对照(NC)，48h后加入LPS处理0min，5min与15min，用RIPABuffer(Thermo公司)裂解法抽提总蛋白。采用抗体p-p65(CST公司)，p-65(CST公司)，β-tubulin(abcam公司)。

5人巨噬细胞或Raw264.7与MIN6共培养

将THP1诱导的巨噬细胞或Raw264.7培养于6孔板，转染circPPM1F siRNA或过表达质粒3D5-circPPM1F 48h后加LPS刺激20h；收上清，4℃,3,000rpm离心30min，此为条件培养基。将MIN6细胞铺于96孔板，1.8*10

实施例1 T1DM患者PBMC中高表达的circPPM1F与T1DM发展相关

我们通过收集4例儿童T1DM患者和4例相同年龄段正常儿童的PBMC细胞，并进行circRNA microarray分析，发现有27个circRNA表达上调，32个表达下调(图1A)。我们筛选数个表达显著的circRNA在40例患者PBMC样本中进行RT-qPCR实验验证，发现相比于正常样本，只有circPPM1F显著高表达，(图1B)，感受性曲线(ROC)面积为0.8041(图1C)。同时我们也检测了40例样本中炎性因子IL-6和IL-1β的表达呈显著上调(图1D)，并且与circPPM1F表达呈正相关(图1E)。

这些结果揭示了PBMC中的高表达的circPPM1F极有可能参与到儿童T1DM的发生发展过程中。

实施例2 circPPM1F通过激活NF-κB通路促进LPS诱导的巨噬细胞激活

我们通过生物信息学分析及PCR产物测序，确定了circPPM1F在转录本上的定位，来源于PPM1F的第6—8三个外显子(图2A)。采用siRNA降低circPPM1F表达，随后LPS刺激巨噬细胞，qPCR检测发现，降低circPPM1F的表达后，能够明显抑制LPS诱导的巨噬细胞激活相关基因(IL-1β，TNF-α和CXCL10)的表达水平(图2B)；同时通过免疫印迹检测，我们也验证了敲低circPPM1F能够明显降低LPS激活的p65的磷酸化水平(图2C)，但不影响JNK，p38和ERK的磷酸化水平(图2D)。

以上结果表明circPPM1F通过激活NF-κB信号通路正向调控LPS诱导的巨噬细胞激活。

实施例3 circPPM1F通过促进LPS诱导的巨噬细胞激活损伤胰岛细胞

为了体外模拟巨噬细胞中异常表达的circPPM1F对胰岛细胞的影响，我们收集THP1诱导的人巨噬细胞和鼠巨噬细胞Raw264.7中下调或过表达circPPM1F后的条件培养基，然后用来处理MIN6细胞。CCK-8法表明，巨噬细胞低表达circPPM1F能明显促进MIN6细胞增殖，而高表达则抑制MIN6增殖(图3A)。另外，流式细胞术表明巨噬细胞低表达circPPM1F能显著抑制MIN6细胞凋亡，而高表达则促进MIN6凋亡(图3B)。

上述结果说明，circPPM1F正向调控巨噬细胞对胰岛细胞的损伤。