一种防止生物样品中DNA降解的保存保护剂

技术领域

本发明涉及生物样品保存领域，更特别地，涉及一种防止生物样品中DNA降解的保存保护剂，更具体的涉及一种防止精液中DNA降解的精液保存剂，可以保证精液中DNA的完整性，保持精液活力。

背景技术

冷冻保存技术是随着人工授精技术发展起来的，是人工授精技术的重大革新。精液冷冻保存技术的原理是利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其它冷源，将精子经过适当的处理，使精子代谢完全停止。使用时在解冻进行人工授精和体外授精。精液冷冻可以大大提高种公畜的利用率，减少公畜的饲养量，节约成本且不受地域、时间的限制。有利于家畜品种的杂交改良，是家畜育种和珍惜濒危物种保护的有效技术手段。总之，精液的冷冻保存对研究人类生殖医学、促进家畜遗传育种、推广人工授精和保护濒危野生动物方面具有重要意义。

在精液冷冻保存中冷冻保护剂(CPM)是精子超低温贮存成功与否的关键。CPM根据其主要成分和缓冲特点可分为三大类型：单一甘油型、甘油复合型和无甘油型。在精液的冷冻过程中，最重要的低温保护剂是甘油。甘油可以渗入细胞内，浓缩或结合胞内水分，而且甘油也有稀释作用，能降低溶液中盐的浓度和冷冻液的渗透压，从而发挥其低温下对精子的保护作用，但甘油对精子有毒害作用。另外冷冻方法也是影响精子冻贮后效果的主要因素。目前精液的冷冻方法有多种，包括一步冻贮法、分步冻贮法及微机控制程序降温法等。归纳起来可以分为速冻和缓冻法两大类。自从出现最简单的精液稀释液和解冻液(保护液)以来，其设计理论和药物组成已经形成了较为统一的模式，即高纯度的溶剂和化学纯以上的药物合成。冷冻精液成功的应用以后，从冻前处理到冷冻-解冻，以及为了提高妊娠率等不同目的，又在原有成分的基础上，添加了更多种类的“特殊”成分，如咖啡因、ATP、GSH、BSA、酶类、维生素、激素、微量元素及抗冻蛋白等，对“特殊活性”及“特殊作用”的因果追求，已成为当今国内外精子保护剂的研究中心。

但是现有技术中存在的精液保存保护剂仍然存在较多的问题，主要集中在：精液中的核酸酶含量高、代谢物质多、PH 范围波动较大，故精液中DNA所处的生物环境相对于其他生物样品来说会更复杂。如果精液中有白细胞或者是上皮细胞破裂基因组DNA降解进入精液中，或者是如果精液中的核酸酶未被抑制，初始DNA将会在短时间内被降解掉，会造成保存环境的复杂和不可控。相比较其他生物样品，精液收集之后要求在4℃条件下保存并运输，若长期保存需转移到-80℃超低温冰箱储存，以便最大限度下保证精液中DNA信息的原始状态。即便如此，仅仅依靠低温，仍然不能有效地在一定时间内保藏精液样品中的DNA信息。此外，渗透性有机溶剂和糖类已经应用于哺乳动物精液的冷冻保存研究中，但是有机溶剂和糖类并不能解决细胞内外冰晶的产生问题，此外，渗透性有机溶剂、糖类、抗冻蛋白（包括卵磷脂、低密度脂蛋白等具有类似功能的外源蛋白）的应用也存在一定的局限性，例如：渗透性有机溶剂对精子都具有一定的损害，尤其是猪精子对甘油浓度极为敏感，过高浓度的甘油会对猪精子造 成严重的损伤。抗冻蛋白是一种异源蛋白，可能导致动物产生一定的免疫反应；而且价格高昂，纯度也存在一定的问题。

因此，需要一种防止精液中DNA降解的精液保存剂，可以保证精液中DNA的完整性，保持精液活力。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种防止精液中DNA降解的保存保护剂，其为包含以下质量分数的物质的水溶液：0.4-0.8％的十二烷基硫酸钠、0.1-0.8％的十二烷基酰胺、0.1-0.5％的失水山梨醇脂肪酸酯、0.2-0.5％的脂肪酸单乙醇酰胺、0.3-0.8%的月桂酸、0.2-0.5%的三乙醇胺，0.5-1.5%的脂肪酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯盐，余量为双蒸水。

优选的，本发明的保存保护剂中还含有0.1-0.3%的核酸酶抑制剂，所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EDTA金属盐、硫酸铵中的一种或多种组合。核酸酶抑制剂主要是通过螯合Mg

优选的，本发明的保存保护剂中还含有0.2-0.5%的过氧化保护剂，所述过氧化保护剂选自天然VE、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素等天然抗氧化剂中的一种或多种组合。过氧化保护剂的添加主要是因为：精子对降温、冷冻和解冻过程敏感性主要因为精子内外膜之间胆固醇及磷脂比例不同而且分布不均匀，及与精子质膜上多不饱和脂肪酸的含量有关。多不饱和脂肪酸在活性氧族（ROS）的作用下易发生脂质过氧化，使质膜多不饱和脂肪酸减少，由于精子质膜含有大量多不饱和脂肪酸，对氧化攻击极为敏感，最终导致精子活力和受精能力降低，加入天然组分的过氧化保护剂可以有效的抑制氧化反应的进行，提高精子质膜、顶体的完整性。

优选的，本发明的保存保护剂中还含有10-20%的pH缓冲液，所述PH缓冲液为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钾盐、磷酸钠盐、碳酸氢钠、硼酸盐、乙酸盐中的任一种或多种组合。优选地，所述pH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液的任意组合。pH缓冲剂主要是调整样品pH保持在合理的6.0-8.0的范围内。

进一步的，本发明还提供了一种精液保存方法，所述方法为：

(1) 配置保存保护剂，并添加总体积20%的蛋黄，充分混匀，保持在17℃，备用；

(2) 采精和浓缩：进行精液采集、预稀释、17℃平衡，然后再17℃条件下进行精液离心分离，收集分离的下层液体，控制精子密度在10亿/ml以上，保存、备用；

(3) 稀释：将17℃预热后的保存保护剂与精液混合稀释，保存保护剂与精液的稀释比例为1∶3-9，稀释后的精液放置在4℃平衡2-3小时，按照5-8℃/h的速度逐步降温到4℃，再用0.5ml细管进行灌装封口；

(4) 冷冻保存：将灌封好的细管精液在托架上码好，置于程序冷冻仪中按照设定好的曲线进行冷冻。冷冻完后将细管精液置于液氮中保存。

有益效果

将采用本发明所提供的保存保护剂和保存方法可以有效的保证经历的活力、顶体完整性和酶活体系，能为改进猪冷冻精液稀释剂配方和从分子层面改进猪精液冷冻保存效果提供参考依据。

本发明提供的保存保护剂和保存方法已经达到生产应用水平，通过实际母猪人工授精验证，可以实现不输活精的妊娠效果。本发明为普及、推广猪冻精在生产上的应用提供科学依据，将养猪生产、节约成本、减少疾病传播发挥重要作用。

本发明提供的保存保护剂和保存方法可以广泛的应用在我国实现猪遗传资源长期保存过程中，将为今后国内、外提供一种猪精液冷冻及应用的技术方法和标准。

附图说明

图1 精子活力检测结果

图2 具有完整顶体的精子扫描图片，其中A为完整精子、B为DNA轻度损伤精子、C为DNA中度损伤精子，D为DNA重度损伤精子。

图3精子顶体完整性评价结果

图4 对精液中超氧化物歧化酶(SOD) 、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、透明质酸酶(HAase)、顶体酶(ACE)活性的测定结果。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1 一种防止精液中DNA降解的精液保存剂的建立

精液的采集

所用精液采集于唐山市玉田县桂荣养猪场3头体格健壮、繁殖性能良好，性欲正常的大约克夏种公猪。使用手握法收集公猪精液：等待公猪爬跨后，对其阴茎以及包皮周围进行清洗消毒，等待公猪阴茎从包皮中伸出后，带上手套握住公猪螺旋状的龟头，手掌有节奏地施压使公猪阴茎充分勃起，最后引导公猪射精。待公猪射精后，采集射精中段的精液，用纱布过滤后装入精液带，并放置于37℃预热的保温桶中，立即送回实验室检查。利用精子分析系统分析精子活力及各项指标，选择形态正常并且活率高于90%、活力高于80%的精液装入等温离心瓶，在800g下离心10min，离心后结束后用注射器去掉上清液，备用。

配置精液保存剂

按照表1配置不同组成和含量的精液保存剂，利用方差分析方法筛选最优配置，同时利用商业化产品1、2作为对照组1、2，和不添加任何产品的阴性对照（阴性对照），阳性对照（新鲜猪精）进行平行试验。

表1不同组分含量的精液保存剂

猪精冷冻保存

（1）配置保存保护剂，并添加总体积20%的蛋黄，充分混匀，保持在17℃，备用；

（2）采精和浓缩：进行精液采集、预稀释、17℃平衡，然后再17℃条件下进行精液离心分离，收集分离的下层液体，控制精子密度在10亿/ml以上，保存、备用；

（3）稀释：将17℃预热后的保存保护剂与精液混合稀释，保存保护剂与精液的稀释比例为1∶3-9，稀释后的精液放置在4℃平衡2-3小时，按照5-8℃/h的速度逐步降温到4℃，再用0.5ml细管进行灌装封口；

（4）冷冻保存：将灌封好的细管精液在托架上码好，置于程序冷冻仪中按照设定好的曲线进行冷冻。冷冻完后将细管精液置于液氮中保存。

实施例2精液品质检测

将上述置于液氮中保存的冻存管在水浴37℃下轻轻摇动1～3分钟至完全融化，使其复苏，进行精子活力检测。

2.1 精子活力检查

精子活力是指在37℃下呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。将稀释后的精液样本稀释至0.5×10

结果如图1所示，添加核酸酶抑制剂、过氧化保护剂、PH缓冲液的猪冷冻精液解冻后精子活力（2-6组）显著高于不添加组（1组），但是不添加组（1组）的效果也要明显好于对照组（对照1、2），而对照组的效果又要明显好于阴性对照组（P<0.05)；添加表没食子儿茶素没食子酸酯、V

2.2精子顶体完整性评价

冷冻精液解冻后，在900g下离心5min，弃上清液，沉淀用PBS洗2次，然后用PBS重悬。取一滴精液滴于载玻片，并均匀铺满整个载玻片，加入30μl DAPI，常温染色10min，然后滴加30μl FITC-PNA，37℃染色30min，染色完成后使用PBS冲洗干净，自然风干，用无色指甲油密封，并迅速在荧光显微镜下观察、拍照。判断标准:精子经FITC-PNA染色后，在荧光显微镜下，整个精子顶体区可见强绿色荧光，且顶体边缘光滑、着色均匀的精子均为具有完整顶体的精子类型（如图2所示）。

精子顶体完整性分析结果如图3所示，添加核酸酶抑制剂、过氧化保护剂、PH缓冲液的第3组猪冷冻精液解冻后顶体完整率显著高于其它各组（P<0.05）。选择不同的过氧化保护剂、PH缓冲液的各组之间相比没有差异性（P>0.05）。

冻融精子的复速率取决于冷冻技术、冷冻稀释液的成分、稀释和冷冻速率及解冻方法。从上述结果中可以看出，在精液的保存过程中使用本发明所提供的精液保存剂，能显著提高冻后猪精子活力与顶体完整率。综合来看，0.5%十二烷基硫酸钠、0.5%十二烷基酰胺、0.2%失水山梨醇脂肪酸酯、0.3%脂肪酸单乙醇酰胺、0.5%月桂酸、0.5%三乙醇胺、1%脂肪酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯盐、0.2%EDTA、0.2%表没食子儿茶素没食子酸酯、10%柠檬酸缓冲液是最适配方。上述保护液能保护多种物种的精子细胞在冷冻过程中免遭损伤，能改善冻后精子活率、顶体完整率，提高精子的受精能力。究其原理，上述保护剂可以与质膜融合，对精子质膜起到了较好的保护作用，从而有效改善了冻融后精子质量。而且本发明中保护剂中的表面活性剂成分具有粘性，对精子膜结构中的脂类有稳定作用，降低或者阻碍由冷冻保存所引起的似获能性变化，从而起到保护质膜和顶体的作用。

2.3精子酶活性评价

精子含有一个与受精密切相关的酶系，精子酶活性在哺乳动物冷冻精液的品质评定及受精过程中的调控作用己引起有关学者的极大关注。本试验检测了鲜精及使用上述冷冻保护剂的猪精液冷冻前后5种酶的活性变化，以期分析本发明的冷冻保护剂对冷冻-解冻对精子酶活性的影响。

上述冷冻精液解冻后，在1000rpm下离心10min，弃上清液留沉淀，重复洗涤1～2次。在沉淀中加入一定量的PBS，使精子浓度达到10

结果显示，本实验中猪精液冷冻保存后，SOD、LDH、GSH-PX、Hase、ACE活性均比鲜精有所降低，但是使用发明试剂3所述的保护剂可以使精子酶活体系保持较好的状态，相对而言降低程度较低。这是由于冷冻-解冻影响精子酶系统功能，导致精子抗氧化化能力降低，顶体反应、受精卵结合和穿透明带异常，受精能力下降。但是相比较阴性对照和对照组，本发明的冷冻保护剂能改善猪精液冷冻保存后精子的SOD、LDH、GSH-PX、Hase、ACE的活性（P<0.05)（如图4所示）。

实施例3 人工授精品质检测

利用实施例1的方法，将试剂1、试剂3、阳性对照、对照1保存的精液解冻复苏，在农场条件下进行输精授胎试验，以检测本发明的冷冻保护液在生产中的实际应用价值（分为4组，每组5头发情母猪，共计20头母猪）。采用本领域常见的先后深部输精方法进行人工授精，步骤概括为：将上述复苏的精液稀释液在35-37℃条件下孵育，调节精子密度在0.5-1×10

母猪生产结果如表2所示，从结果上看，利用本发明所述的保护剂进行冷冻后的精液可以达到与活精类似的生产效果，可以在生产实践中进行大规模的应用，已经实现实践生产应用水平。

表2 母猪生产数量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。