NETs的生物标志物在制备视网膜静脉阻塞早期诊断产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及NETs的生物标志物在制备视网膜静脉阻塞早期诊断产品中的应用。

背景技术

视网膜静脉阻塞是常见眼底血管疾病，也是世界范围内常见的致盲原因之一。根据阻塞的部位不同，视网膜静脉阻塞可分为视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞及半侧视网膜静脉阻塞。视网膜静脉阻塞的常见病因为血栓形成、炎症、高血压等；黄斑水肿、新生血管及新生血管性青光眼为其常见的并发症，且预后不良。由于预后与病程有关，病程短的预后相对病程长的好，因此早期诊断和治疗对于视网膜静脉阻塞尤为关键。尽管不断有人对视网膜静脉阻塞疾病进行研究，但是在其临床诊断方面仍有不足。目前视网膜静脉阻塞的诊断依据是临床医师裂隙灯检查、眼底照相及机眼底荧光血管造影及RVO PPP。患者在就诊时已经出现眼部症状或其并发症症状，在眼科检查图像上已有特征性改变，治疗效果不理想。因此，我们需要研究探索一种诊断方法，可以在患者未出现明显的眼部症状时诊断出该疾病，并对其进行积极治疗，改善患者预后，减轻患者的经济压力。

NETs(neutrophil extracellular traps)是由中性粒细胞释放的一种具有多种生物学活性的网状结构，有研究认为NETs作为宿主抗微生物的介质，但是其也有促炎症及血栓形成的作用。目前有研究表明NET与中风、心血管疾病、肿瘤以及全身系统性疾病有关，并未有研究表明NETs与视网膜静脉阻塞的关系。

发明内容

本发明提供了NETs的生物标志物在制备视网膜静脉阻塞早期诊断产品中的应用，标本易于获得，可以在患者未出现明显的眼部症状时辅助诊断该疾病，并对其进行积极治疗，便于改善患者预后，减轻患者的经济压力，具有重要的临床指导意义，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案是：

NETs的生物标志物在制备视网膜静脉阻塞诊断产品中的应用。

进一步地，所述NETs的生物标志物为NETs中的cfDNA、和/或MPO-DNA、和/或H3Cit。

进一步地，所述NETs的生物标志物为NETs中的cfDNA、MPO-DNA和H3Cit三种。

进一步地，所述诊断产品为早期诊断产品。

进一步地，所述诊断产品为辅助诊断产品。

进一步地，具体应用时，检测受检者血液、视网膜组织或玻璃体液中cfDNA/NETs、和/或MPO-DNA、和/或H3Cit的含量，并与正常人群进行对比，对比结果作为诊断依据之一；cfDNA/NETs、和/或MPO-DNA、和/或H3Cit在视网膜静脉阻塞患者中高表达。

进一步地，具体应用时，检测受检者静脉血中cfDNA/NETs、MPO-DNA、和H3Cit的含量，并与正常人群进行对比，对比结果作为诊断依据之一；cfDNA/NETs、MPO-DNA和H3Cit在视网膜静脉阻塞患者中高表达。

进一步地，所述诊断产品所针对的样品为血液、视网膜组织或玻璃体液，优选静脉血液。

一种视网膜静脉阻塞诊断产品，包括检测cfDNA/NETs含量的试剂，检测MPO-DNA含量的试剂，检测H3Cit含量的试剂。

本发明的有益效果：

本发明所用检测标本为诊断对象的静脉血，易于获得，对诊断对象无创伤，具有可行性。通过检测诊断对象静脉血的NETs相关生物标志物，得出结论NETs的生物标志物与炎症和血栓形成有关，而视网膜静脉阻塞的病因与炎症和血栓形成有关，因此，通过检测NETs的生物标志物来进行视网膜静脉阻塞的早期诊断，可以在患者未出现明显的眼部症状时辅助诊断该疾病，并对其进行积极治疗，便于改善患者预后，减轻患者的经济压力。本发明的NETs相关生物标志物取材方便，作为视网膜静脉阻塞疾病的早期预警指标，检测灵敏，具有重要的临床指导意义，利于进一步研究NETs靶向治疗视网膜静脉阻塞。

附图说明

图1为视网膜静脉阻塞及对照组中性粒细胞计数、cfDNA,MPO-DNA和H3Cit的差异变化；

图2为视网膜静脉阻塞及对照组中性粒细胞计数、cfDNA,MPO-DNA和H3Cit的敏感性分析，其曲线下面积分别为0.859,0.871及0.928。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。

本发明采用病例-对照研究，按照RVO PPP诊断标准，将77位视网膜静脉阻塞患者，及无既往系统或者循环炎症及血栓性疾病、无既往黄斑水肿或接受抗-VEGF治疗、无血液系统肿瘤病史以及能够配合研究操作的48位对照组志愿者纳入本研究，记录每位患者及志愿者的年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒史、糖尿病、高血压史等。

采集两组人员的血液，取3支血样(1管不加抗凝剂，2管加抗凝剂)，其中2支在室温下1900g离心15min，提取血清和血浆。循环样品(血清和血浆)保存在-80℃中，用于实验室检测。采集样本4小时后，全血将用于中性粒细胞计数。cfDNA定量使用PicoGreen dsDNA定量分析试剂盒(Invitrogen公司，美国)，根据说明书对血浆中游离DNA进行定量。MPO-DNA的定量使用固定相修饰的靶向MPO和dsDNA的特异性抗体。H3Cit的定量使用细胞死亡检测ELISA试剂盒(瑞士罗氏诊断公司)的抗组蛋白抗体，根据说明书对血浆样品中的H3Cit进行定量。各组连续数据以均数±标准差表示，两组间差异采用非配对t检验。分类变量以计数和比例表示，组间差异采用卡方分析。通过ROC方法，研究NETs相关生物标志物对RVO的潜在诊断效果。采用Pearson方法对NETs相关参数与炎症、血栓性指标之间的相关性进行分析，并对其线性相关性进行线性回归模拟。使用Graphpad Prism 8.3(Graphpad SoftwareInc)进行统计分析。p<0.05被认为有统计学意义。

检测所有标本中中性粒细胞计数、NETs的生物标志物cf-DNA、MPO、H3Cit的含量及炎症因子CRP、VEGF、IL1、IL6和血栓形成标志物PT、APTT、TT、FIB的含量。进行统计学分析，RVO组与对照组在年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒史、高血压史没有统计学差异。与对照组相比，RVO组中FBG、HbAlc增高、中性粒细胞计数、NETs的生物标志物cf-DNA、MPO、H3Cit、炎症因子及血栓形成标志物增多，如图1和表1所示。

如图1所示,与对照组相比，cfDNA含量(21.0±29.8vs7.9±0.6ng/ml，P＝0.004)，MPO-DNA含量(310.6±262.1vs125.0±32.6ng/ml,P<0.001)及HECit含量(15.6±31.2vs3.4±1.2ng/ml，P＝0.011),三种生物标志物均显著增高。

视网膜静脉阻塞每位患者和对照组每位志愿者的性别、年龄、BMI、高血压、糖尿病、吸烟饮酒史以及炎症和血栓标志物记录如下表1。

表1

本发明以上测定结果说明，NETs标记物与炎症、血栓形成有显著相关性。cfDNA与MPO-DNA、cfDNA与H3Cit、MPO-DNA与H3Cit呈显著正线性相关。当中性粒细胞受到炎症、肿瘤等因素的刺激时释放NETs，促进炎症和血栓形式，进一步导致视网膜静脉阻塞的发生。得出结论NETs与NETs生物学标志物与炎症和血栓形成及视网膜静脉阻塞的发生相关。NETs的生物标记物cf-DNA、MPO、H3Cit可作为RVO的诊断标志物,用于视网膜静脉阻塞的辅助诊断。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。