火落和火落性质细菌的培养和/或计数及其可用的试剂盒

背景技术

火落(Hiochi)细菌，有时称为火落(hi-ochi)或火落菌(hi-ochi kin)，是引起诸如清酒(sake)的酒精饮料腐败的一种类型的乳酸菌。火落性质(Hiochi-natured)细菌是与火落细菌相关的乳酸菌，因为它们也会引起诸如清酒的酒精饮料腐败。火落和火落性质细菌两者的特征在于它们能够在高醇浓度下生长，诸如存在于葡萄酒和清酒中的那些。

发明内容

一种制备火落或火落性质细菌的培养物的方法可以包括将包含火落或火落性质细菌的样品与缓冲液混合以形成接种混合物，并且用所述接种混合物接种培养板。所述方法的特征在于，缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙醇和甲瓦龙酸。

一种计数火落或火落性质细菌的方法可以包括：

将包含火落或火落性质细菌的样品与缓冲液混合以形成接种混合物，所述缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙醇和甲瓦龙酸；用所述接种混合物接种培养板以形成接种的培养板；并且对所述培养板上的火落或火落性质细菌的菌落数量进行计数。与制备培养物的方法类似，所述计数方法的特征在于，所述缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙醇和甲瓦龙酸。

一种试剂盒可以包括一个或多个培养板和缓冲液。与所述培养方法和所述计数方法类似，所述试剂盒的特征在于，所述缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙醇和甲瓦龙酸。

具体实施方式

在整个本公开中，为方便起见，常常使用单数形式诸如“一种”、“一个”和“该/所述”；然而，除非上下文明确规定或清楚指示仅为单数，否则单数形式意指包括复数。当单独称为单数时，通常使用术语“仅仅一个”。

本公开中的一些术语定义如下。其它术语对于本领域的技术人员将是熟悉的，并且应当被赋予本领域的普通技术人员将赋予它们的含义。

术语诸如“常见的”、“典型的”和“通常的”以及“常见地”、“典型地”和“通常”在本文中用于指说明书中经常采用的特征，并且除非明确地对照现有技术使用，否则并不旨在表示这些特征存在于现有技术中，远少于现有技术中那些常见的、通常的或典型的特征。

术语“清酒”用于指一种类型的酒精饮料，通常由大米制成且与日本和日本料理相关，而当今清酒不一定是日本制造的；在现代，清酒也在包括美国在内的多种其它地方制造。“清酒”包括在英语语言中通常称为sake的所有类型的酒精饮料，包括seishu(澄清的清酒)、doburoku(未过滤的清酒)、nigori(浑浊的清酒)、futsu-shu(普通的清酒)、tokuteimeisho-shu(特别命名的清酒)、junmai daiginjo-shu(纯米，特别酿造的清酒)、daiginjo-shu(特别酿造的清酒)、junmai ginjo-shu(纯米，特别酿造的清酒)、ginjo-shu(特别酿造的清酒)、tukubestsu junmai-shu(特别纯米清酒)、tokubetsu honjozo-shu(特别本酿造清酒)、junmai-shu(纯米清酒)、honjozo-shu(本酿造清酒)、namazake(未经高温消毒的清酒)、genshu(未经稀释的清酒)、koshu(古老的清酒)、taruzake(装在木桶(通常为杉木(sugi)，即日本雪松)中的清酒)、shiboritate(鲜榨清酒)、fukurozuri(雫清酒)、tobingakoi(压入大容器中的清酒)、amazake(甜清酒)、jizake(本地酿造的清酒)、kuroshu(由糙米制成的清酒)、teseihaku-shi(由精米制成的清酒)、toso(由药粉诸如屠苏散(tososan)浸泡的清酒)等。

火落细菌是可在具有高乙醇含量的环境中生长的一种类型的乳酸菌，在一些情况下，乙醇含量多达25％或甚至更多。典型的火落细菌属于乳杆菌属，并且包括同型种(homohiochii)及其所有亚种。火落性质细菌是在本领域中未被认为是真正火落细菌，但是仍然可在高乙醇环境(像支持火落细菌的那些环境)中生长的乳酸菌。火落性质细菌也是乳杆菌属，并且除其它之外至少包括可在高醇环境中生长的乳杆菌种干酪(casei)、希氏(hilgardii)和干酪(casei)的那些亚种。

火落和火落性质细菌可能是酒精饮料腐败的原因。具体地讲，火落和火落性质细菌对于由大米生产的酒精饮料而言是有问题的，但是它们也会使其它酒精饮料腐败，例如在生产过程中使用真菌的那些。这包括基于葡萄的酒精饮料(诸如葡萄酒)，因为许多酿酒葡萄受到所谓的“贵腐菌(noble rot)”(也以法语术语“pourriture”和“pourriturenoble”为人所知)的特意影响，该贵腐菌是灰色真菌、通常为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的一种理想形式。其它酒精饮料诸如miju(中国米酒)、cheongju(韩国米酒)、awamori(传统上在冲绳生产的米酒液)、shochu(米液)等也可被火落和火落性质细菌腐败。

尽管具有在高醇环境中生长的共同特征，但是以使得可在单一培养板中培养火落细菌、火落性质细菌或两者的方式培养样品是个问题。相关问题是要找到一种测试，其可计数一个培养板上的火落细菌、火落性质细菌或两者的菌落。当前的方法不允许在使用即用型培养基的单一薄膜培养板中一起培养或计数火落和火落性质细菌。当前，琼脂培养板必须是由使用者制备来用于培养(与即用型薄膜板的便利性相比)。这是有问题的，因为与使用即用型薄膜培养板相比，需要更多的操作者时间来制备琼脂培养板并且当每次必须制备琼脂培养板时，发生操作者错误的几率更大。

另一个问题涉及测试火落和火落性质细菌所需的时间量。虽然火落和火落性质细菌均可使用琼脂板检测，但是使用已知方法培养与检测火落和火落性质细菌两者需要较长时间(诸如七天至十天)。

本公开通过以下方式解决了这些问题：提供缓冲液用于与含有火落细菌或火落性质细菌的样品混合，然后可将其接种于薄膜培养板上。当使用如本文所述的缓冲液时，可在同一薄膜培养板上将火落和火落性质细菌两者一起培养。通常，薄膜培养板是以PETRIFILM

除非另有规定，否则不需要该方法区分火落和火落性质细菌，因为就食品或饮料样品而言，该两种中的任一种或组合以不可接受的水平存在均指示食品或饮料腐败。尽管如此，在一些情况下可以区分火落和火落性质细菌。

一种制备火落或火落性质细菌的培养物的方法可包括将包含火落或火落性质细菌的样品与缓冲液混合以形成接种混合物，并且用所述接种混合物接种培养板。该方法的特征在于，缓冲液具有如本文所述的组分和pH。该方法还可包括对培养板上的火落或火落性质细菌的菌落数量进行计数的计数步骤。

一种计数火落或火落性质细菌的培养物的方法可包括将包含火落或火落性质细菌的样品与缓冲液混合以形成接种混合物，用接种混合物接种培养板以形成接种的培养板，并且对接种的培养板上的火落或火落性质细菌的菌落数量进行计数。该方法的特征在于，缓冲液具有如本文所述的组分和pH。

在培养或计数火落或火落性质细菌的任一方法中，样品可以是含有或可含有火落或火落性质细菌的任何样品。样品可来自食品或饮料产品，但是也可以是环境样品，例如来自生产食品或饮料产品的制造设施的表面。一般来讲，当样品来自食品或饮料时，它为酒精饮料。最常见地，酒精饮料是从大米酿造或蒸馏的一种饮料，其包括从大米和其它谷物的混合物酿造或蒸馏的那些。清酒是用作样品的最常见饮料，但是miju(中国米酒)、cheongju(韩国米酒)、awamori(传统上在冲绳生产的米酒液)、shochu(米液)、葡萄酒等也可作为用于本文所述方法中的任一种的样品。当样品为环境样品时，它通常是通过在制备酒精饮料的设施中擦拭一个或多个表面诸如工作表面、设备表面等来获得。

在培养或计数火落或火落性质细菌的方法中，或在试剂盒中，缓冲液包含至少一种缓冲剂，该至少一种缓冲剂在添加到培养板中时提供4.0至6.0的pH，并且其宜为磷酸盐和柠檬酸盐以及乙醇和甲瓦龙酸的组合。这些组分中的每一种都必须存在；除去这些组分中的任一种都将使得缓冲液对于培养火落和火落性质细菌两者无效。因此，令人惊讶的是，只有含有全部这些元素的缓冲液才可用于在同一培养板上培养、计数或培养且计数火落或火落性质细菌。

缓冲液可处于火落和火落性质细菌能够生长的任何pH。通常，在将样品与缓冲液混合之后，就快速将样品接种到培养板上。因此，缓冲液的pH通常足以在接种培养板之后提供具有火落和火落性质细菌能够生长的适当pH的培养板。在此类情况下，缓冲液的pH将取决于培养板的组分。在许多情况下，缓冲液所具有的pH足以使得在接种之后，接种的培养板所具有的pH为4.0–6.0，诸如4.0或更大、4.1或更大、4.2或更大、4.3或更大、4.4或更大、4.5或更大、4.6或更大、4.7或更大、4.8或更大、4.9或更大、5.0或更大、5.1或更大、5.2或更大、5.3或更大、5.4或更大、5.5或更大、5.6或更大、5.7或更大、5.8或更大或甚至5.9或更大。在此类情况下，缓冲液所具有的pH足以使得在接种之后，接种的培养板所具有的pH为6.0或更小、5.9或更小、5.8或更小、5.7或更小、5.6或更小、5.5或更小、5.4或更小、5.3或更小、5.2或更小、5.1或更小、5.0或更小、4.8或更小、4.7或更小、4.6或更小、4.5或更小、4.4或更小、4.4或更小、4.3或更小、4.2或更小或甚至4.1或更小。具体地讲，缓冲液所具有的pH为接种的培养板提供4.5-5.5，且最具体地4.8-5.2的pH。

在许多情况下，缓冲液本身所具有的pH为3.5-6.0，诸如3.5或更大、3.6或更大、3.7或更大、3.8或更大、3.9或更大、4.0或更大、4.1或更大、4.2或更大、4.3或更大、4.4或更大、4.5或更大、4.6或更大、4.7或更大、4.8或更大、4.9或更大、5.0或更大、5.1或更大、5.2或更大、5.3或更大、5.4或更大、5.5或更大、5.6或更大、5.7或更大、5.8或更大或甚至5.9或更大。在此类情况下，缓冲液所具有的pH足以使得在接种之后，接种的培养板所具有的pH为6.0或更小、5.9或更小、5.8或更小、5.7或更小、5.6或更小、5.5或更小、5.4或更小、5.3或更小、5.2或更小、5.1或更小、5.0或更小、4.9或更小、4.8或更小、4.7或更小、4.6或更小、4.5或更小、4.4或更小、4.4或更小、4.3或更小、4.2或更小、4.1或更小、4.0或更小、3.9或更小、3.8或更小、3.7或更小或甚至3.6或更小。可采用McIlvaine缓冲液通过本领域技术人员已知的方法实现适当的pH。

当缓冲液包含柠檬酸盐和磷酸盐时，柠檬酸盐和磷酸盐可以允许火落或火落性质细菌生长的任何比率使用。虽然可采用其它缓冲液，但是与例如单独的磷酸盐缓冲液相比，包含柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲液提供火落和火落性质细菌的更快生长和检测。因此，虽然本公开不限于包含柠檬酸盐和磷酸盐两者的缓冲液，但是此类缓冲液可以是有利的。典型的比率通过使用如本文所述的柠檬酸盐和磷酸盐的浓度来确定，以实现同样如本文所述的期望pH。11:9(柠檬酸盐与磷酸盐)的比率是典型的。

柠檬酸盐和磷酸盐浓度可以是允许火落或火落性质细菌生长的任何浓度。通常，磷酸盐的用量为0.05M或更多和0.5M或更少，诸如0.05M或更多、0.075M或更多、0.1M或更多、0.125M或更多、0.15M或更多或0.175M或更多、0.2M或更多、0.225M或更多、0.25M或更多、0.275M或更多、0.3M或更多、0.35M或更多、0.4M或更多、0.45M或更多、0.5M或更少、0.45M或更少、0.35M或更少、0.325M或更少、0.3M或更少、0.275M或更少、0.25M或更少、0.225M或更少、0.2M或更少、0.175M或更少、0.15M或更少、0.125M或更少、0.1M或更少或者0.075M或更少。柠檬酸盐的用量通常为0.025M或更多和0.5M或更少，诸如0.025M或更多、0.075M或更多、0.1M或更多、0.125M或更多、0.15M或更多或0.175M或更多、0.2M或更多、0.225M或更多、0.25M或更多、0.275M或更多、0.3M或更多、0.35M或更多、0.4M或更多、0.45M或更多、0.5M或更少、0.45M或更少、0.35M或更少、0.325M或更少、0.3M或更少、0.275M或更少、0.25M或更少、0.225M或更少、0.2M或更少、0.175M或更少、0.15M或更少、0.125M或更少、0.1M或更少或者0.075M或更少。

磷酸盐(phosphate)可包括任何磷酸盐，诸如磷酸盐(phosphate salt)、磷酸氢盐(出于本公开的目的被视为磷酸盐)等。磷酸盐的抗衡离子可以是任何阳离子，只要所得的磷酸盐可溶于缓冲液即可，并且通常为碱金属或碱土金属离子，最常见的是钠或钾。取决于pH值，磷酸盐可以是磷酸氢盐或未质子化磷酸盐或磷酸氢盐和未质子化磷酸盐的组合。柠檬酸盐(citrate)可包括任何柠檬酸盐，诸如柠檬酸或柠檬酸盐(citrate salt)。通常，在所使用的pH值下，柠檬酸盐将主要呈一种或多种柠檬酸盐的形式，但是也可能以柠檬酸的形式具有柠檬酸盐中的一些或全部。当所有或部分柠檬酸盐作为柠檬酸盐存在时，可使用柠檬酸盐的任何抗衡离子，只要所得盐可溶于缓冲液即可。最常见地，采用碱金属离子或碱土金属离子，具体地钠或钾作为柠檬酸盐的抗衡离子。

乙醇可以适用于火落和火落性质细菌生长的任何浓度存在于缓冲液中。乙醇在缓冲液中典型的浓度按照体积％计为3％至30％，诸如3％或更大、4％或更大、5％或更大或6％或更大并且还诸如30％或更小、25％或更小、20％或更小、15％或更小、14％或更小、13％或更小、12％或更小、11％或更小、10％或更小、9％或更小或8％或更小。最常见地，使用7％浓度的乙醇。

甲瓦龙酸可以适用于火落和火落性质细菌生长的任何浓度存在于缓冲液中。甲瓦龙酸典型的浓度为0.5ppm至50ppm，诸如0.5ppm或更大、1ppm或更大、2ppm或更大、3ppm或更大、4ppm或更大并且还诸如50ppm或更小、45ppm或更小、40ppm或更小、35ppm或更小、30ppm或更小、25ppm或更小、20ppm或更小、15ppm或更小、10ppm或更小、9ppm或更小、8ppm或更小、7ppm或更小、或6ppm或更小。最常见地，使用5ppm的浓度。

其它组分可包括在缓冲液中，但是除非另有规定，否则它们不是必需的。当采用时，最常见的其它组分是氯化钠，其可以足以提供适合微生物、具体地乳酸菌生长的离子强度的浓度使用。当采用时，氯化钠的量和浓度将取决于缓冲液中其它溶质的量。营养物质、维生素等也可用作缓冲液的组分，然而除非另有规定，否则这些组分中无一是必需的。

因为薄膜培养板通常是干燥的，或者(如果不是)它们仅具有非常少量的液体，所以当使用薄膜培养板时几乎不用担心缓冲液将被稀释。因此，与琼脂板不同，预制缓冲液可以可靠地与薄膜培养板一起使用，而无需担心像琼脂培养板那样，缓冲液被水合培养基稀释。

可将样品与缓冲液以任何合适的比率混合，包括本领域已知的用于培养火落或火落性质细菌的本领域公认方法的比率。通常，将样品以如下样品:缓冲液的体积/体积比率混合：1:1至1:20，诸如1:5至1:15，诸如1:7至1:12

在火落或火落性质细菌的培养方法或计数方法中，对培养板的接种可通过本领域的任何手段执行，并且关于如何接种培养板的细节将是相关领域的普通技术人员已知的。如何执行接种，包括待使用的接种混合物的体积、待放置接种培养基的培养板上的位置等将取决于所使用的特定培养板。

在火落或火落性质细菌的培养方法或计数方法中或在试剂盒中，薄膜培养板可以是适用于生长乳酸菌(诸如乳杆菌属的那些)的任何薄膜培养板，并且不必针对火落或火落性质细菌进行特别设计，只要采用本文所述的缓冲液即可。一般来讲，多种薄膜培养板在本领域中是已知的；一些薄膜培养板公开于例如WO2017019345、US4565783、WO1993012218以及本领域的其它地方。最常见地与本公开一起使用的薄膜培养板是PETRIFILM

培养方法或计数方法还可包括将接种的培养板暴露于升高温度的步骤。升高的温度可以是有利于乳酸菌(诸如乳酸杆菌属的那些，并且具体地火落和火落性质细菌)生长的任何温度。示例性温度为25℃至35℃，诸如30℃。可将培养板暴露于该温度长达足以允许火落或火落性质细菌生长的时间段。示例性时间段为2天至14天，诸如2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、5天或更多天、6天或更多天、7天或更多天、8天或更多天、9天或更多天、10天或更多天、11天或更多天、12天或更多天或甚至13天或更多天。该时间段也可以是14天或更短、13天或更短、12天或更短、11天或更短、10天或更短、9天或更短、8天或更短、7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短或甚至3天或更短。典型的时间段为5天至9天，并且最典型地为7天。也可使用长于14天或短于2天的时间段，这取决于使用者的要求、培养的具体样品、使用的培养板等。在所有情况下，升高的温度或任何特定的时间段都不是必须要求的。就计数方法以及还包括计数步骤的培养方法的实施方案而言，能够充分地检测出存在于培养板中的火落或火落性质细菌以进行计数就足够了。

计数作为计数方法的一部分或作为还具有计数步骤的那些培养方法的一部分，可通过本领域已知的任何手段来完成。培养板可使用人眼并通过技术人员已知的技术手动计数来进行计数。另选地，可使用读板机，诸如可从美国明尼苏达州圣保罗的3M公司商购获得的那些读板机，在这种情况下，使用者可遵循用于所采用的读板机的说明书。可使用能够对所采用的培养板进行计数的任何读板机。

用于培养火落和火落性质细菌中的一者或两者的试剂盒可包括一个或多个培养板，其可以是如上所述的培养板中的任一种；和如本文所述的缓冲液。培养板为薄膜板，其示例为Petrifilm

表1中列出的乳杆菌菌株购自酒类综合研究所(日本广岛市)(National ResearchInstitute of Brewing(Hiroshima,Japan))或国家技术与评价研究所(日本木更津市)(National Institute of Technology and Evaluation(Kisarazu,Japan))，并且将其单独地在30℃下在SI半固体培养基中温育3天至7天。通过用选自表2的缓冲液中的一种连续地稀释每个培养物样品来制备单个种菌。在连续稀释后，每种种菌的最终浓度为约1-150个菌落形成单位(cfu)计数/1mL

SI粉末培养基购自日本酿造协会(日本东京)(Brewing Society of Japan(Tokyo,Japan))。

甲瓦龙酸包含在培养基中。

甲瓦龙酸购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)(Sigma-AldrichCorporation(St.Louis,MO))。

柠檬酸、Na

通过以9:11的比率(体积/体积)混合Na

用于形成接种混合物的每种缓冲液的组成在表2中描述。

通过用缓冲液1(表2)连续地稀释乳杆菌菌株(表1中的A-D)中的每一者来制备含有单一乳杆菌菌株的四种接种混合物。根据制造商的说明书将每种接种混合物(1mL)添加到单独的PETRIFILM乳酸菌计数板(明尼苏达州圣保罗的3M公司)并且在30℃下温育2天、3天、7天或10天。在添加种菌混合物后，水合培养基具有约5的pH(如通过购自株式会社堀场制作所(日本京都)(HORIBA,Let(Kyoto,Japan))的pH计和探针测量的)。在温育期结束时，通过目测对菌落形成单位(cfu)进行计数。然后通过按连续稀释的数量和体积调整来自板的菌落计数来计算原始(未稀释)样品的cfu每毫升(cfu/mL)计数。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表3中。

在表8中，针对每个乳杆菌菌株通过实施例1的方法获得的cfu/mL计数相对于通过比较例1的方法获得的对应cfu/mL计数的计算比率以百分比报告(比率计算公式：[(通过实施例1的方法获得的cfu/mL)/(通过比较例1的方法获得的cfu/mL)]×100)。

通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS，明尼苏达州圣保罗的3M公司)连续地稀释乳杆菌菌株(表1中的A-D)中的每一者来制备含有单一乳杆菌菌株的四种接种混合物。通过将5g的SI粉末培养基与90mL的蒸馏水和1g的琼脂粉末混合来制备SI琼脂培养基。将混合物在沸水浴中加热直至全部琼脂熔化。加热之后，在无菌条件下添加10mL乙醇。将每种接种混合物(1mL)接种到培养皿中。然后将SI琼脂培养基倾注到培养皿中。盖上培养皿并且使用矩形广口瓶中的ANEROPACK-ANERO(日本东京的三菱瓦斯化学株式会社(Mitsubishi GasChemical,Tokyo,Japan))在30℃下厌氧温育2天、3天、7天或10天。在温育期结束时，通过目测对白色菌落形成单位(cfu)进行计数。然后通过按连续稀释的数量和体积调整来自板的菌落计数来计算原始(未稀释)样品的cfu每毫升(cfu/mL)计数。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表4中。

遵循如实施例1中所述的相同程序，不同之处在于使用缓冲液2代替缓冲液1来制备接种混合物。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表5中。

遵循如实施例1中所述的相同程序，不同之处在于使用缓冲液3代替缓冲液1来制备接种混合物。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表6中。

遵循如实施例1中所述的相同程序，不同之处在于使用缓冲液4代替缓冲液1来制备接种混合物。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表7中。

遵循如实施例1中所述的相同程序，不同之处在于使用缓冲液5代替缓冲液1来制备接种混合物。结果以每个温育时间点的平均cfu/mL计数(n＝2)报告于表8中。