一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域中有关检测昆虫突变基因的频率，可监测对拟菊酯类除虫药剂产生抗性水平的相关技术，具体是一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物，并提供一种鉴定三叶斑潜蝇击倒抗性相关突变位点M918T和L1014F的方法及其专用引物。

背景技术

三叶斑潜蝇(liriomyza trifolii Burgess)属双翅目、潜蝇科、斑潜蝇属，世界上许多国家将它列为重大检疫性害虫，是有害观赏植物、蔬菜及农作物的主要害虫之一，2005年在我国广东省首次发现三叶斑潜蝇危害蔬菜，2006入侵到海南。近年来，该虫已经成为我国蔬菜特别是豇豆上的重要防治对象之一。当前化学防治仍然是控制斑潜蝇的主要手段，而过度使用化学农药会导致斑潜蝇抗药性问题，同时，也严重威胁到蔬菜的可持续生产和食品质量。

拟除虫菊酯类杀虫剂是一种重要的农药，具有高效、低毒和易分解的特点，广泛用于防治多种农业害虫，大量使用会导致许多昆虫产生了高度的抗性。昆虫神经细胞膜电压敏感钠离子通道是拟除虫菊酯类杀虫剂的主要作用靶标，由钠离子通道靶标部位敏感度降低而对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂产生的抗性，叫击倒抗性(Knowdown resisitance，kdr)，这是昆虫对菊酯类农药产生抗性最重要的机制。分子遗传学研究表明，击倒抗性表型与钠离子通道突变位点连锁，检测昆虫突变基因的频率可以监测抗性水平。目前，国内针对三叶斑潜蝇抗药性研究还很少，关于三叶斑潜蝇击倒性抗性研究也未见报道，利用现有研究还无法对三叶斑潜蝇抗药性特别是击倒性抗性突变位点进行有效快速监控；因此，有必要研制一种鉴定三叶斑潜蝇击倒抗性相关突变位点的方法和专用引物，用于快速监测三叶斑潜蝇对拟除虫菊酯类药剂的抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物，且特别是提供一种鉴定三叶斑潜蝇钠击倒抗性相关突变位点L1014F和M918T的方法及其专用引物，用于监测三叶斑潜蝇对拟除虫菊酯类药剂的抗性，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物，包括鉴定三叶斑潜蝇击倒抗性相关突变位点M918T和L1014F的方法和专用引物。

所述专用引物包含扩增引物和测序引物；

所述扩增引物包括正向引物和反向引物；

所述扩增引物的正向引物LT5F序列如SEQ ID NO.1所示；所扩增引物的反向引物LT5R 序列如SEQ ID NO.2所示；

所述测序引物的同扩增引物的反向引物LT5R。

所述鉴定三叶斑潜蝇击倒抗性相关突变位点L1014F和M918T的方法：利用所述的扩增引物LT5F对三叶斑潜蝇DNA进行PCR扩增，并对PCR产物纯化回收；通过二代测序技术，利用所述的测序引物对PCR扩增产物测序，根据核苷酸序列，检测出三叶斑潜蝇钠离子通道击倒抗性相关突变位点；仪器设备为常规分子生物学仪器，如PCR仪、移液枪等。

本实验室研究发现，在三叶斑潜蝇田间种群钠离子通道基因II S4-6结构域SEQID NO.4 (GenBank登录号：MT670290)的918和1014位点密码子存在突变，在918位密码子由ATG 突变为ACG，导致该位点由亮氨酸改变为苯丙氨酸；在1014位点密码子由CTT突变为TTT，导致该位点由甲硫氨酸改变为苏氨酸。本发明提供的专用引物能够有效的鉴定出三叶斑潜蝇击倒抗性相关钠离子通道基因突变(M918T和L1014F突变)。

作为本发明的进一步方案：所述PCR扩增体系为：Green Taq Mix(含Taq DNAPolymerase、 dNTPs以及优化缓冲体系的2×Master Mix)25μL，10M正向引物2μL，10M反向引物2μL，单头DNA模板5μL，由双蒸水补足至50μL。

作为本发明的再进一步方案：所述PCR扩展程序为：95℃，3min；(95℃，15s；60℃，15s；72℃，30s)30；72℃，5min。

作为本发明的再进一步方案：所述PCR产物的扩增量为5-10管200μL规格微量离心管。

作为本发明的再进一步方案：所述PCR产物纯化回收程序为：用PCR产物纯化回收试剂盒对PCR产物纯化回收，用移液枪确定PCR产物体积，加入5倍体积的CP Buffer；吸打混合均匀后，放入到离心柱里，13000rpm离心1min，倒掉废液；加入700μL DNA wash Buffer，13000rpm离心1min，倒掉废液，重复1次；13000rpm离心2min后，加入30-50μL ElutionBuffer于离心柱中间的白色部分，下接1.5mL离心管，室温静置2min，13000rpm离心1min；取20-30μL送样测序。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的专用引物能够有效的鉴定出三叶斑潜蝇击倒抗性相关钠离子通道基因突变 (M918T和L1014F突变)。本发明利用扩增引物扩增三叶斑潜蝇钠离子通道基因IIS4-6结构域部分区段，仪器设备为常规分子生物学仪器，如PCR仪、移液枪等。通过二代测序技术，利用测序引物对扩增产物测序；目前二代测序技术成本低，准确性高，本发明利用测序引物反向测序进行一个反应即可完成测序。根据核苷酸序列图谱，可准确的鉴定出三叶斑潜蝇钠离子通道击倒抗性突变位点，从而判断三叶斑潜蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平，具有快速有效、实验操作简单、检测结果准确直观的优点，能够监测三叶斑潜蝇田间种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性基因频率和抗药性发生动态，对于指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

附图说明

图1为一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物的检测流程图；

图2为一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物中实施例1中对三叶斑潜蝇提取DNA后进行PCR反应的电泳图；图中：泳道M为DNA Marker 2000条带，泳道1-5 为扩增产物条带；

图3为一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物中实施例1中三叶斑潜蝇钠离子通道基因M918T位点测序图；

图4为一种鉴定三叶斑潜蝇钠离子通道基因突变的方法及专用引物中实施例1中三叶斑潜蝇钠离子通道基因L1014F位点测序图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例；下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；仪器设备为常规分子生物学仪器，如PCR仪等。

实施例1 三叶斑潜蝇击倒抗性基因突变的鉴定包括以下检测流程及步骤：

1.三叶斑潜蝇田间种群取样

在田间豇豆地采集有斑潜蝇潜道的叶片，放入塑料袋中，拿回实验室，用解剖针挑剖潜道后，用小刷子轻轻将幼虫扫到离心管中；

2.三叶斑潜蝇单头DNA提取

利用百泰克公司提供的DNA提取试剂盒按照操作说明书进行单头三叶斑潜蝇DNA提取，提取后的DNA保存于-20℃备用；

3.利用扩增引物LT5F对DNA进行PCR扩增

(1)将合成好的专用引物按照说明溶于去离子水中，终浓度为20μmol/L，保存于-20℃备用；

(2)专用引物的核苷酸序列：

正向引物LT5F：5’-TTGGAGCTGGAGGCACAAAC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物LT5R：5’-CCCCTTGCCAACTGATGGTT-3’(SEQ ID NO.2)。

(3)PCR反应体系：

诺维赞Green Taq Mix，25μL；正向引物LT5F，2μL；反向引物LT5R 2μL；单头DNA 模板5μL；由双蒸水补足至50μL。

(4)PCR扩展程序：

95℃，3min(95℃，15s；60℃，15s；72℃，30s)30；72℃，5min。

4.电泳试验验证

电泳试验：称量0.5mg的琼脂糖，加入广口烧瓶中，用量筒取1×TAE 50mL加入烧瓶中，震荡摇匀后放入微波炉加热2min全部溶解，待冷却至60℃，再加入5μL核酸染料，摇匀后倒入凝胶板中。20min后待凝胶凝固后放入普通电泳仪电泳槽中，加入PCR产物，在120V 的条件下电泳20min。

验证结果：电泳结束后，在紫外透射仪下观察结果，如图2所示；

5.PCR产物纯化回收

利用PCR产物纯化回收试剂盒对PCR产物纯化回收，所述PCR产物纯化回收程序为：用移液枪确定PCR产物体积，加入5倍体积的CP Buffer；吸打混合均匀后，放入到离心柱里，13000rpm离心1min，倒掉废液；加入700L DNA wash Buffer，13000rpm离心1min，倒掉废液，重复1次；13000rpm离心2min后，加入30-50L Elution Buffer于离心柱中间的白色部分，下接1.5mL离心管，室温静置2min，13000rpm离心1min。取20-30μL 送样测序。

6.利用LT5R对回收产物测序

将条带明亮单一无异的PCR产物送上海铂尚生物公司，利用测序引物LT5R进行反向测序。将测序的结果上传美国国家生物信息中心(the US National Center forBiotechnology Information)网站，进行核苷酸序列的比对，检测出2个三叶斑潜蝇击倒抗性相关钠离子通道基因突变位点。

6.分析测序结果及计算频率

三叶斑潜蝇钠离子通道基因击倒抗性基因测序结果：

在三叶斑潜蝇钠离子通道基因M918T位密码子由ATG突变为ACG，导致该位点由亮氨酸改变为苯丙氨酸，如图3所示；在L1014F位点密码子由CTT突变为TTT，导致该位点由甲硫氨酸改变为苏氨酸，如图4所示。

本实验室经计算频率及效果分析发现，在三叶斑潜蝇田间种群钠离子通道基因IIS4-6结构域SEQ ID NO.4(GenBank登录号：MT670290)的918和1014位点密码子存在突变，在918 位密码子由ATG突变为ACG，导致该位点由亮氨酸改变为苯丙氨酸；在1014位点密码子由CTT 突变为TTT，导致该位点由甲硫氨酸改变为苏氨酸。本发明提供的专用引物能够有效的鉴定出三叶斑潜蝇击倒抗性相关钠离子通道基因突变(M918T和L1014F突变)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。