一种基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。

骨钙素(Osteocalcin，OC)又称为骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由骨中的非增殖期成骨细胞特异合成并分泌的一种体内含量最多的非胶原骨基质蛋白，其表达量受年龄、性别及绝经状态的影响。人OC基因为单拷贝基因，位于1号染色体，由49个氨基酸残基组成，含有3个羧化的谷氨酸残基，且在第23、29位形成一个分子内二硫键。在Ca

最早的骨钙素检测可以追溯到1980年有学者采用放射免疫分析(RIA)，后期又有学者开发了固相酶联免疫测定(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)等。近些年商业公司开发出了能用于临床检验使用的ELISA的检测试剂盒，如Quidel公司的MicroVue Osteocalcin等。但ELISA的操作过程时间较长，一般需要数个小时，而且样本量也受到一定的限制。

胶乳增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的均相免疫比浊检测方法。胶乳增强比浊法是在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液透光性能(即吸光度)。而且，反应液透光性能的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。胶乳增强比浊法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，该方法可以在大型全自动生化仪上使用，不需要添置额外的设备。胶乳增强比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。

发明内容

针对OC现有技术方法学检测时间过长，检测量过小的问题，本发明提供一种基于多克隆抗体制备的骨钙素胶乳增强比浊检测试剂盒的制备方法，可代替ELISA等其他检测方法，提高检测效率，扩大检测样本量。同时该方法和ELISA一样具有较高的特异性和灵敏度，且适用于各类全自动生化分析仪分析，便于临床应用。具体技术方案如下：

一种基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒，该试剂盒中含有交联抗人OC多克隆抗体胶乳微球，所述交联抗人OC多克隆抗体胶乳微球为交联山羊抗人OC多克隆抗体的胶乳微球，其制备方法包括如下步骤：

S1：重组人OC蛋白的制备

从人全血中提取骨钙素基因组DNA，并扩增连接到克隆载体后导入到克隆菌中进行复制，然后提取质粒进行酶切后再导入到表达菌中进行发酵表达，最后将表达产物进行纯化和鉴定，获得重组人OC蛋白；

S2：山羊抗人OC多克隆抗体的制备

将步骤S1中制备的重组人OC蛋白对山羊多次注射进行免疫，待抗体效价达到指定抗体水平后无菌采血，制备抗血清；然后将抗血清纯化获得免疫球蛋白，再经鉴定后获得山羊抗人OC多克隆抗体；

S3：制备交联山羊抗人OC多克隆抗体胶乳微球

将步骤S2制备的山羊抗人OC多克隆抗体交联至聚苯乙烯胶乳微球，得到交联山羊抗人OC多克隆抗体的胶乳微球，作为胶乳增强比浊法检测骨钙素试剂盒的一种成分。

具体地，步骤S1中所述重组人OC蛋白的制备具体包括如下子步骤：

S1-1：人OC基因的获取

设计骨钙素特异性引物，采用DNA提取试剂盒从人全血中提取DNA，并利用设计的引物进行PCR反应，获得人OC基因；所述特异性引物含有双酶切位点；

S1-2：表达载体构建

步骤S1-1中的PCR反应获得的人OC基因经测序无误后连接到克隆载体上，然后导入到克隆菌的感受态细胞中进行培养，再提取质粒进行双酶切，获得人OC基因片段；回收该基因片段连接到质粒载体上，然后导入BL21的感受态细胞中培养，经含有氨苄青霉素的LB固态培养基筛选后，再通过PCR反应鉴定，获得构建成功的工程菌表达载体；

S1-3：重组人OC蛋白的表达

挑取步骤S1-2中构建的工程菌表达载体于含氨苄青霉素的LB液态培养基中复苏活性，并放大培养至OD值达到1.0，加入IPTG，诱导人OC基因发酵表达，然后收集工程菌，破碎后获得含有目的蛋白rOC的沉淀；

S1-4：重组人OC粗制品的制备

将步骤S1-3获得的含有目的蛋白rOC的沉淀进行重悬，然后反复冻融3次，再进行超声裂解，离心后取上清，得到重组人OC粗制品；

S1-5：重组人OC粗制品的纯化

将步骤S1-4获得的重组人OC粗制品经亲和层析，脱盐、缓冲液置换，离子交换层析及分子筛层析处理后收集收集rOC，再经Wersten Blot验证获得纯化的重组人OC，再加入20％甘油无菌分装，于-80℃下保存备用。

步骤S2中所述山羊抗人OC多克隆抗体的制备具体包括如下子步骤：

S2-1：山羊的免疫

将制备的重组人OC蛋白与等量弗氏完全佐剂充分匀浆至稳定乳液作为抗原，按照设计的时间点注射山羊四肢内侧免疫4次，然后采用重组人OC蛋白作为抗原耳缘静脉注射免疫1次，测定抗体效价1:32及以上，终止免疫；再进行颈部静脉无菌放血法获得全血；

S2-2：多克隆抗体的纯化

将步骤S2-1中获得的全血静置取上清，离心，获得血清；加入等体积的PBS混匀后再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，静置，离心，弃上清，获得沉淀；再进行两次PBS溶解沉淀，加入饱和度为33％的硫酸铵，静置，离心步骤；获得的沉淀用PBS溶解，装入透析袋透析除盐，获得纯化的山羊抗人OC多克隆抗体；

S2-3：多克隆抗体的验证

使用制备的重组人OC蛋白为抗原，步骤S2-2中获得的山羊抗人OC多克隆抗体为第一抗体，兔抗山羊IgG为第二抗体做Wersten Blot，验证获得的山羊抗人OC多克隆抗体制备成功。

优选的，步骤S1-1中所述特异性引物序列为：

上游引物：CTCGAGAGGCCAGCTGAGTCCTGAGC

下游引物：TCATAGTCATTCCTCTTCTGGAG；

其含有的双酶切位点为：上游引物带有XhoI酶切位点；下游引物带有EcoRV酶切位点。

优选的，步骤S1-2中所述回收基因片段连接到质粒载体上，采用的质粒载体为pET32a。

优选的，步骤S1-4中所述重悬沉淀加入PBS的量与沉淀质量体积比1:2；所述反复冻融沉淀的条件为－20℃与4℃；所述超声裂解的条件为：4℃下，300W功率，工作6s，间隔3s，破碎10min，重复3次；所述离心条件为：于4℃，12000r/min，离心15min。

优选的，步骤S3中所述制备交联山羊抗人OC多克隆抗体胶乳微球，所述使用的胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，其直径为60～300nm，采用化学交联法将其与山羊抗人OC多克隆抗体交联在一起。

前述的基于多克隆抗体的骨钙素胶乳增强比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2及OC校准品；所述试剂R1包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂及防腐剂；所述试剂R2包括缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂及所述的交联抗人OC多克隆抗体胶乳微球。

具体地，所述试剂R1的组分包括：Tris-HCl缓冲液10～50mM/L，PEG600010～50g/L，BSA 1～9g/L，NaCl 5～10g/L，MgCl

所述试剂R2的组分包括：Tris-HCl缓冲液10～50mM/L，BSA 1～9g/L，NaCl 5～10g/L，交联抗人OC多克隆抗体胶乳微球(V/V)5～20％，TX-100 0.1～1.0％，NaN

所述OC校准品的组分包括：Tris-HCl缓冲液10～50mM/L，BSA 1～9g/L，NaCl 5～10g/L，rOC 30～90mg/L，NaN

本发明的有益效果是：

相比其他方法，本发明试剂盒实现利用胶乳增强免疫比浊法测定骨钙素，检测信号倍数放大提高了检测灵敏度；采用多克隆抗体相比单克隆抗体具有较好的特异度；相比于ELISA方法，本产品具有较好的一致性，并且可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉且自动化高，节省检测时间。此外，在高稳定性和高精密度情况下相比同类产品具有更高的灵敏度和特异性，提升了骨钙素检测的应用价值。

附图说明

图1为重组人OC蛋白Western Blot鉴定结果；

图2为制备的抗OC蛋白多克隆抗体Western Blot鉴定结果；

图3本发明试剂盒与商品化人OC蛋白ELISA检测试剂盒相关性曲线图；

图4本发明试剂盒线性范围验证图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1为重组人OC蛋白的制备，实施例2为山羊抗人OC多克隆抗体的制备，实施例3为一种骨钙素胶乳增强免疫比浊法试剂盒及其使用方法，实施例4为效果例，骨钙素胶乳增强免疫比浊法试剂盒的评价。

实施例1

本实施例为重组人OC蛋白的制备，具体包括如下步骤：

S1-1：人OC基因的获取：

采用宝日医生物技术(北京)有限公司DNA提取试剂盒(货号9781S)从人全血中提取DNA，并利用引物进行PCR反应；

人OC基因引物序列：

上游引物:

下游引物:

上游引物带有XhoI酶切位点；下游引物带有EcoRV酶切位点，该序列经大肠杆菌偏好密码子优化。

重组人OC序列为：

CTCGAGAGGCCAGCTGAGTCCTGAGCAGCAGCCCAGCGCAGCCACCGAGACACCATGAGAGCCCTCACACTCCTCGCCCTATTGGCCCTGGCCGCACTTTGCATCGCTGGCCAGGCAGGTGCGAAGCCCAGCGGTGCAGAGTCCAGCAAAGGTGCAGCCTTTGTGTCCAAGCAGGAGGGCAGCGAGGTAGTGAAGAGACCCAGGCGCTACCTGTATCAATGGCTGGGAGCCCCAGTCCCCTACCCGGATCCCCTGGAGCCCAGGAGGGAGGTGTGTGAGCTCAATCCGGACTGTGACGAGTTGGCTGACCACATCGGCTTTCAGGAGGCCTATCGGCGCTTCTACGGCCCGGTCTAGGGTGTCGCTCTGCTGGCCTGGCCGGCAACCCCAGTTCTGCTCCTCTCCAGGCACCCTTCTTTCCTCTTCCCCTTGCCCTTGCCCTGACCTCCCAGCCCTATGGATGTGGGGTCCCCATCATCCCAGCTGCTCCCAAATAAACTCCAGAAGAGGAATGACTATGA

使用宝日医生物技术(北京)有限公司预混PCR反应试剂(货号R001A)进行PCR，PCR反应条件:95℃预变性5min；95℃变性30S，59.5℃退火40S，72℃延伸60S，循环35次，最后72℃延伸10min，获得PCR扩增产物。

S1-2：表达载体构建：

PCR产物经测序无误后使用连接酶(货号2011A)连接到克隆载体pMD-18T载体中，导入到克隆菌感受态细胞DH5α中；LB培养基37℃培养过夜，使用宝日医生物技术(北京)有限公司质粒提取试剂盒(货号9760)提取质粒，XhoⅠ酶和EcoRV酶进行双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将521bp大小片段切下使用宝日医生物技术(北京)有限公司胶回收试剂盒(货号9762)回收DNA，将回收的DNA使用连接酶连接到pET32a上，并导入BL21感受态细胞中；

LB培养基37℃220rpm摇菌1h，涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜，取含氨苄青霉素的LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，鉴定为阳性，表示表达载体构建成功，记为pET-28a-OC。

S1-3：重组人OC蛋白的表达：

挑取pET-28a-OC工程菌于含氨苄青霉素10μg/mL的LB培养基中37℃摇菌1h复苏工程菌活性，后在LB培养基(含氨苄青霉素10μg/mL)中放大培养6h后，测OD值达到1.0时，加入IPTG，30℃诱导表达(终浓度10μg/mL)5h，收集细菌，破碎后获得上清和沉淀，即为带HIS标签的目的蛋白rOC。

S1-4：重组人OC粗制品的制备：

加入质量体积比1:2的PBS重悬沉淀，-20℃与4℃反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率300W，工作6s，间隔3s，超声破碎10min，重复3次，于4℃，12000r/min离心15min分别取上清、沉淀，得到粗制蛋白。

S1-5：重组人OC粗制品纯化：

亲和层析:将粗制蛋白过滤处理后过HIS亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 60mM还原性谷胱甘肽pH 7.2)梯度洗脱，收集rOC峰；

脱盐、缓冲液置换:将第一步纯化的rOC过脱盐柱，用缓冲液(50mM Tris-ClpH9.0)置换，准备下一步离子交换层析；

离子交换层析：分别用Loading buffer(50mM Tris-Cl pH7.0)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mM Tris-Cl 1M NaCl pH7.0)梯度洗脱，收集rOC峰；

分子筛层析：离子交换层析收集到的rOC过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa

取收集rOC做Wersten Blot验证:使用abcam公司OC单克隆抗体(ab133612)为抗体，使用abcam公司山羊抗鼠IgG(HRP标记)为第二抗体做WB，沉淀与上清样本在约24kD处均有阳性条带，如图1所示，图中泳道M：蛋白Marker 26610；泳道1：空菌对照；泳道2：重组人OC蛋白纯化后样本；泳道3：abcam公司重组人OC蛋白对照。从图中泳道2阳性片段和泳道3阳性片段位置大小基本一致可以判定重组OC构建成功，并成功表达，表明纯化后所得rOC为骨钙素，即重组人OC蛋白。然后加入20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用。

实施例2

本实施例为山羊抗人OC多克隆抗体的制备，具体包括如下步骤：

S2-1：山羊的免疫：

选择6～7月龄体重40kg左右雌性山羊，取1mLrOC抗原(5mg/mL)与等量弗氏完全佐剂充分匀浆至稳定乳液既得乳化抗原。每只山羊于四肢内侧注射共2mL乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，改用弗氏不完全佐剂，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，免疫方案如前；49日后进行第五次免疫，采用耳缘静脉注射2mLrOC抗原(2.5mg/mL)；55日取耳缘静脉血使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫。采用颈部静脉无菌放血法获得全血。

S2-2：多克隆抗体的纯化：

全血于室温划十字口静置2h，取上清获得粗制血清。粗制血清于4℃，4000r/min离心15min，获得血清。加入等体积的PBS混匀得混合液，向混合液中再缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置3h以上。于4℃，4500r/min离心30min。上清中抗体含量较低，弃去，将沉淀用500ml的PBS溶解，调整硫酸铵饱和度为33％，4℃下静置4h后，4℃，4500r/min离心30min。上清中抗体含量较低，弃去，将沉淀用500ml的PBS溶解，硫酸铵饱和度33％，4℃下静置4h后，4℃，4500r/min离心30min。沉淀用500ml的PBS溶解，装入透析袋(10kD)，4℃下透析(20倍体积的PBS透析液)12h除盐。即为山羊抗人OC多克隆抗体。

S2-3：多克隆抗体的验证：

使用上述制备的rOC为抗原，上述制备的多克隆抗体为第一抗体，使用abcam公司兔抗山羊IgG(HRP标记，ab6741)为第二抗体做WB，抗原在24kD处有阳性条带产生。如图2所示，图中泳道M：蛋白Marker26610；泳道1：BSA对照；泳道2：制备的抗OC蛋白多抗；泳道3：abcam公司抗人OC蛋白单抗对照。从图中泳道2出现的阳性片段结合实施例1重组人OC蛋白鉴定结果，并阳性片段大小与泳道3位置大小一致，可以判定山羊抗人OC蛋白多克隆抗体制备成功。

实施例3

本实施例为一种骨钙素胶乳增强免疫比浊法试剂盒及其使用方法，具体如下：

本实施中所述骨钙素胶乳增强免疫比浊法试剂盒包括试剂R1、试剂R2和OC校准品，具体组分如下：

(1)试剂R1中含有：

Tris-HCl缓冲液··················· 20mM/L，

PEG6000·······················30g/L，

BSA·························5g/L，

NaCl························ 9g/L，

MgCl

NaN

EDTA························ 0.5g/L；

(2)试剂R2中含有：

Tris-HCl缓冲液·················· 20mM/L，

BSA························· 5g/L，

NaCl·························9g/L，

交联山羊抗人OC多克隆抗体的胶乳微球··········5％，

TX-100························0.5％，

NaN

EDTA························ 0.5g/L；

(3)OC校准品中含有：

Tris-HCl缓冲液··················· 20mM/L，

BSA························· 5g/L，

NaCl·························9g/L，

rOC························· 60mg/L，

NaN

EDTA·························0.5g/L。

所述交联山羊抗人OC多克隆抗体的胶乳微球，使用聚苯乙烯胶乳微球，直径60～300nm，采用化学交联法将山羊抗人OC多克隆抗体交联到聚苯乙烯胶乳微球上。

本实施还提供一种使用所述试剂盒的测定方法，具体为：

分析方法：两点终点法；

反应方向：上升反应；

校准方式：Logit-Log(4P)；

测定波长：540nm；

测定温度：37℃；

样本:试剂R1:试剂R2＝20:225:75(μL)；

测试步骤：吸取20μL样本，加入225μL试剂R1，37℃孵育5min，加入75μL试剂R2，1min后读取吸光值A1，3min后读取吸光值A2，计算ΔA。

定标方法：5点定标，采用日立7080全自动生化分析仪(或其他品牌型号)，进行检测，设置校准品浓度分别为：3.75、7.5、15、30、60ng/ml。

依据浓度和ΔA值测算样本中OC含量。

实施例4效果例

(1)相关性验证

利用实施例3配方配制试剂，与国家食品药品监督管理总局认可的某上市公司的OC检测试剂盒进行对照检测，检测100份临床血清样本，检测结果如下表1，获得了本发明试剂盒与上市某公司在售OC检测试剂的相关性曲线，如图3所示，通过检测结果显示，两试剂盒的线性相关曲线为y＝1.0086x-0.0228，相关系数R2＝0.9714，说明本试剂盒与商品化人OC蛋白检测试剂盒相关性良好。

表1本发明试剂盒与某上市公司在售OC检测试剂盒线性相关性比对值

(2)线性范围验证

使用重组OC纯化品和生理盐水配制成浓度100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、1.5625mg/L和0mg/L(生理盐水对照)的测试品，使用本发明试剂盒测定各测试品浓度，以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。结果显示测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y＝1.022x-0.2015，如图4所示。相关系数R2＝0.999，说明线性关系良好，线性范围可达100mg/L。

表2本发明试剂盒线性范围验证

(3)准确度验证

取具有溯源性高值血清质控和低值血清质控各一份，使用所述试剂盒检测6次，取均值，与质控靶值进行比对。结果表明检测值较靶值相对偏差较小，准确度较高。见表3。

表3所述试剂盒准确度验证结果

(4)精密度验证

取经在售试剂盒检测的临床血清样本高值和低值各一份，使用所述试剂盒对同一份血清样本连续检测10次，计算所述试剂盒的变异系数。精密度检测数据如下表4，检测结果表明所述试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小，分别为1.95％和5.27％，精密度较好。

表4所述试剂盒精密度验证结果

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。