增加固体组合物中植酸酶的稳定性的方法及包含磷酸盐和植酸酶的颗粒组合物

技术领域

本发明的组合物和方法涉及用磷酸盐对植酸酶进行热稳定化，以及在含有植酸酶的经热处理的食品或动物饲料粒料的生产过程中提高植酸酶的回收率。

背景技术

在食品和动物饲料中使用诸如酶等活性剂是常见的。已知酶改善食品或动物饲料的可消化性，减少食品和动物饲料中的抗营养因子，并提高动物的生产力。

当与干饲料混合物相比时，饲料粒料具有受本行业欢迎的特性，诸如饲料品质提高、病原体减少、生产过程中粉尘水平降低、方便处理以及成分剂量更均匀。

优选的工业制粒工艺在称为调质的过程中利用蒸汽喷射，其在制粒步骤之前增加水分并升高温度，这迫使蒸汽加热的饲料成分或经过调质的糊料(mash)穿过模具。制粒工艺温度通常为约70℃至100℃，或更高。

由于制粒工艺中使用的蒸汽、温度、压缩力和化学品，在加工期间酶的活性或效能往往显著降低。如果酶在加工后再活化，则失活是至少部分可逆的，而如果加工后催化活性没有恢复则失活是不可逆的。酶的不可逆失活在诸如制粒的过程中是非常不令人希望的。

在食品和饲料行业中，需要稳定、耐久的酶颗粒来充当在经受蒸汽制粒工艺的制剂中的组分而没有酶活性的明显损失。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及使用磷酸盐增加组合物中植酸酶的稳定性，以及提高通过蒸汽制粒生产的动物饲料粒料的植酸酶回收率。

1.一方面，提供了一种用于增加固体组合物中植酸酶的稳定性或在包含此类固体组合物的制粒工艺中所述植酸酶的回收率的方法，所述方法包括将磷酸盐引入所述固体组合物中，其中所述磷酸盐和植酸酶在功能上接近且摩尔比为至少50:1，并且其中所述固体组合物包含摩尔比小于10:1的肌醇或磷酸肌醇与植酸酶。

2.在根据段落1的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐形成固体支持物，或掺入固体支持物中或其上。

3.在根据段落1或2的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐形成颗粒，或掺入颗粒中。

4.在根据段落3的方法的一些实施例中，所述颗粒是基质颗粒。

5.在根据段落3的方法的一些实施例中，所述颗粒是多层颗粒。

6.在根据段落5中任一段的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐掺入所述多层颗粒的单个层中。

7.在根据段落3-6中任一段的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐掺入所述颗粒的核中。

8.在根据段落3-7中任一段的方法的一些实施例中，所述颗粒包含在食品或动物饲料粒料中，其中在蒸汽制粒后，在热处理后的回收活性百分比为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更高。

9.在根据段落3-8中任一段的方法的一些实施例中，所述颗粒包含在食品或动物饲料粒料中，其中在食品或动物饲料制粒后，与在相同的食品或动物饲料粒料中，使用没有在功能上接近且摩尔比为至少50:1的磷酸盐和植酸酶的颗粒时的回收活性相比，回收活性相对提高为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％或更多。

10.另一方面，提供了一种用于增加液体组合物中植酸酶的稳定性或在包含此类液体组合物的制粒工艺中所述植酸酶的回收率的方法，所述方法包括将磷酸盐引入所述组合物中，其中所述磷酸盐和植酸酶在功能上接近并且所述磷酸盐以50mM或更高的浓度存在，并且其中所述液体组合物包含低于10mM的肌醇或磷酸肌醇。

11.在根据段落10的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐处于溶液或悬浮液中。

12.在段落10或11的方法的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐包含在食品或动物饲料粒料中，其中在食品或动物饲料蒸汽制粒后，回收活性百分比为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

13.在段落10-12中任一段的方法的一些实施例中，将所述植酸酶和磷酸盐施加至食品或动物饲料粒料的表面，其中在食品或动物饲料蒸汽制粒后，回收活性百分比为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

14.在段落10-13中任一段的方法的一些实施例中，在食品或动物饲料制粒后，与在相同的食品或动物饲料粒料中，使用没有在功能上接近的磷酸盐和植酸酶以及以50mM或更高浓度存在的磷酸盐的颗粒时的回收活性相比，回收活性相对提高为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。

15.在前述段落中任一段的方法的一些实施例中，所述磷酸盐不是所述固体组合物或液体组合物中存在的植酸盐的水解产物。

16.在前述段落中任一段的方法的一些实施例中，所述固体组合物或液体组合物基本上不含肌醇或磷酸肌醇。

17.在前述段落中任一段的方法的一些实施例中，所述磷酸盐是单磷酸盐。

18.在前述段落中任一段的方法的一些实施例中，与未在至少50:1的磷酸盐与植酸酶浓度摩尔比或至少50mM的磷酸盐浓度下用磷酸盐稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少2.7℃。

19.另一方面，提供了一种包含磷酸盐和植酸酶的颗粒组合物，其中所述磷酸盐和植酸酶在功能上接近且摩尔比为至少50:1，或者磷酸盐以至少50mM磷酸盐的量存在。

20.在根据段落19的颗粒的一些实施例中，所述颗粒是基质颗粒。

21.在根据段落19的颗粒的一些实施例中，所述颗粒是多层颗粒。

22.在根据段落20的颗粒的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐掺入所述多层颗粒的单个层中。

23.在根据段落19-22中任一段的颗粒的一些实施例中，所述植酸酶和磷酸盐掺入所述颗粒的核中。

24.在根据段落19-22中任一段的颗粒的一些实施例中，所述磷酸盐不是所述固体组合物或液体组合物中存在的植酸盐的水解产物。

25.在根据段落19-22中任一段的颗粒的一些实施例中，所述固体组合物或液体组合物不含植酸盐。

26.在根据段落19-22中任一段的颗粒的一些实施例中，所述磷酸盐是单磷酸盐。

27.另一方面，提供了一种包含段落19-26中任一段的颗粒的粒料组合物。

28.另一方面，提供了一种粒料组合物，其包含在功能上接近且摩尔比为至少50:1的植酸酶和磷酸盐，或其中磷酸盐以至少50mM的浓度存在，其中所述磷酸盐不是所述粒料组合物中存在的植酸盐的水解产物。

根据包括附图的说明书，本发明的组合物和方法的这些及其他方面和实施例将是清楚的。

附图说明

图1是显示向植酸酶中添加浓度不断增加的植酸钠对液态酶的熔解温度的影响的图。

图2是显示随着磷酸钠浓度的不断增加，植酸酶UFC的熔解温度曲线的图。

图3是显示向植酸酶中添加浓度不断增加的磷酸钠对液态酶的熔解温度的影响的图。

图4是显示关于液态植酸酶的熔解温度，对以阴离子当量归一化的不同赋形剂的比较的图。

图5是显示关于液态植酸酶的熔解温度，对以电荷当量归一化的不同赋形剂的比较的图。

图6是显示随着磷酸钠水平的不断增加，植酸酶UFC的热失活曲线的图。

图7是显示随着柠檬酸钠水平的不断增加，植酸酶UFC的热失活曲线的图。

图8是显示在存在植酸底物和不断增加的磷酸钠水平的情况下对植酸酶的竞争性抑制的图。

图9是显示在存在植酸底物和不断增加的柠檬酸钠水平的情况下对植酸酶的竞争性抑制的图。

图10是显示(A)无受体、(B)具有植酸盐或(C)具有磷酸盐的颗粒的蒸汽模拟器回收率的图。

图11是显示(A)无受体、(B)具有植酸盐或(C)具有磷酸盐的颗粒的进料制粒回收率的图。

具体实施方式

I.定义和缩写

在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所用，术语“植酸”是指肌醇六磷酸(IP6)，其可以包括少量(即，小于10％)的作为IP6分解代谢产物的磷酸肌醇，包括五磷酸肌醇(IP5)、四磷酸肌醇(IP4)、三磷酸肌醇(IP3)、二磷酸肌醇(IP2)和单磷酸肌醇(IP1)、其盐及其混合物。术语“植酸”不涵盖肌醇(IP0)或无机磷酸盐。注意，IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和IP6全部称为“磷酸肌醇”。

如本文所用，术语“磷酸盐”(PO

如本文所用，术语“食品”以广义使用并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。

如本文所用，关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。动物可以是反刍动物或非反刍动物。反刍动物的实例为牛、绵羊、山羊和马。非反刍动物的实例为单胃动物，诸如猪、家禽(诸如鸡和火鸡)、鱼(诸如鲑鱼)、狗、猫和人。

如本文所用，术语“食品或饲料成分”包括被添加到或可以被添加到食品或食料中的配方，并且包括可以在各种产品中以低水平使用的配方。食品成分可以呈溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。本文所述的酶可以用作食品或饲料成分或用在制备或生产中。所述酶可以添加到或可以不添加到食品补充剂中。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。

如本文所用，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

如本文所用，术语“植酸酶”意指这样的蛋白质或多肽，其能够催化包括植酸盐/植酸在内的磷酸的酯的水解，并释放无机磷酸盐。

如本文所用，关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

如本文所用，关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参考多肽不同的多肽，因为它在一个或多个氨基酸位置处包含人为取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。

如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或甚至至少约99％纯。

如本文所用，术语“修饰”和“改变”可互换使用并且意指变化或变更。在修饰或改变多肽的上下文中，这些术语可以意指直接或通过改变编码核酸来改变氨基酸序列，或诸如通过将酶糖基化来改变多肽的结构。

如本文所用，术语“固体支持物”是指可以例如通过喷雾、混合、吸收或以其他方式形成为粒子(诸如颗粒或粉末)，将植酸酶和磷酸盐掺入其中或其上的惰性固体材料。固体支持物的实例包括但不限于硫酸钠、硫酸镁、粒状蔗糖、淀粉-蔗糖糖丸(non-pareil)(ASNP)和麦芽糖糊精。

如本文所用，术语“颗粒”是指物质的致密小粒子。该粒子可以由基质材料制成，或者可以包括具有一个或多个任选包衣层的核。

如本文所用，术语“多层颗粒”是指包含核和至少一个包衣层的组合物。

如本文所用，术语“基质颗粒”是指具有均质结构的颗粒，其包括基质材料和均质分散的酶。

如本文所用，术语“核”可与术语“籽”互换。

如本文所用，术语“包衣层”和“层”可互换。包衣层通常将核封装，以便形成基本上连续的层，使得核表面具有很少或没有未包衣层区域。颗粒和/或多层颗粒中使用的材料(例如，本文详述的试剂、组分和酶)适合用于食品和/或动物饲料。所述材料可为食品级或饲料级。

如本文所用，术语“外包衣层”是指多层颗粒的距核最远的包衣层(即，施加的最后一个包衣层)。

如本文所用，术语“酶包衣层”或“酶层”是指包含至少一种酶的酶层。在一些实施例中，酶层包含至少两种酶。在一些实施例中，酶层包含至少三种酶。

如本文所用，术语“功能上接近”意指磷酸盐和植酸酶的接近度使得磷酸盐能够稳定植酸酶。例如，磷酸盐和植酸酶都处于颗粒的同一层中；例如，磷酸盐和植酸酶都处于核中和/或磷酸盐和植酸酶都处于同一包衣层中。在另一个实例中，磷酸盐和植酸酶处于颗粒的相邻包衣层中。在另一个实例中，植酸酶处于核中，而磷酸盐处于相邻包衣层中。

如本文所用，术语“热处理”是指在高于90℃的温度下蒸汽制粒或暴露于干热。

如本文所用，术语“粒料”和“制粒”是指固体、圆形、球形和圆柱形的片剂或粒料以及形成此类固体形状，特别是饲料粒料和固体、挤出动物饲料的方法。已知的食品和动物饲料制粒制造工艺通常包括在室温下将食品或饲料成分掺和约1分钟至约5分钟，将所得掺和物转移到缓冲仓中，将掺和物运输至蒸汽调质器中，任选地将经蒸汽调质的掺和物转移到膨胀器，将掺和物转移至制粒机或挤出机，最后将粒料转移至粒料冷却器。Fairfield,D.1994.第10章,制粒成本中心(Pelleting Cost Center).在Feed ManufacturingTechnology IV[饲料生产技术IV]中.(McEllhiney编辑),弗吉尼亚州阿灵顿市美国饲料工业协会(American Feed Industry Association,Arlington,Va.),第110-139页。

如本文所用，术语“经热处理的食品或动物饲料粒料”是指通常在至少90℃的温度下经受热处理(诸如蒸汽调质)至少30秒的未制粒的掺和物。然后可以将掺和物挤出以形成动物饲料粒料。

如本文所用，术语“稳定性”是指其中植酸酶的酶活性或其他功能特性有益地得以维持或改善的多种作用中的任一种。植酸酶可以通过显示改善的“回收活性”、“热稳定性”或“失活可逆性”中的任一种来表现出稳定性。并且“稳定性”可以指在与饲料或饲料粒料组合之前或之后植酸酶组合物中维持的活性。

如本文所用，术语“回收活性”是指热处理后的植酸酶的活性量与热处理前的植酸酶的活性量相比。回收活性可以表示为百分比。回收活性百分比计算如下：

如本文所用，术语“回收活性的相对提高”是指稳定化的植酸酶的回收活性的量与未稳定化的植酸酶的回收活性的量相比。回收活性可以表示为百分比。回收率的相对增加计算如下：

如本文所用，“FTU”或“植酸酶转换单位”或“植酸酶活性单位”或“单位”是能够在pH 5.5和37℃下每分钟从过量植酸钠产生1微摩尔无机磷的酶的量。根据“分析化学家协会(AOAC)官方方法2000.12”测定植酸酶活性，如“Determination of phytase activity infeed by a colorimetric enzymatic method:collaborative interlaboratory study[通过比色酶法测定饲料中的植酸酶活性：实验室间合作研究]”Engelen,A.J.,van derHeeft,F.C.,Randsdorp P.H.,Somers,W.A.,Schaefer,J.,van der Vat,B.J.J AOAC Int.[AOAC国际杂志]2001年5月至6月；84:629-33中所述。简言之，将研磨样品用220mM乙酸钠三水合物、68.4mM氯化钙脱水物、0.01％吐温20(pH 5.5)萃取。然后测定上清液。该测定法在pH 5.5下于37℃测量水稻植酸酶中无机磷酸盐的释放，持续60分钟。用酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止测定，并通过钒钼磷的黄色络合物的强度定量磷酸盐。

如本文所用，酶的“熔解温度(Tm)”是50％的酶蛋白质处于未折叠的非天然状态时，即折叠状态和未折叠状态的自由能相等时的温度，并且可以通过本领域已知的技术来测量。一种合适的技术是差示扫描量热法(DSC)。其他适合的用于测定熔解温度的技术包括光散射、圆二色性和酶学实验。

为了便于参考，可以将本发明的组合物和方法的要素排列在一个或多个标题下。要注意的是，每个标题下的组合物和方法也适用于其他标题下的组合物和方法。

如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数冠词“一”、“一个/种”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均特此通过援引以其全文并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

℃ 摄氏度

g或gm 克

g/L 克/升

g/mol 克/升

mol/mol 摩尔与摩尔比

HPLC 高效液相色谱法

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔

mg 毫克

mL或ml 毫升

min 分钟

mM 毫摩尔

cm 厘米

mm 毫米

nm 纳米

PCR 聚合酶链式反应

rpm 每分钟转数

μg 微克

μL和μl 微升

μM 微摩尔

w/v 重量/体积

FTU/g 植酸酶单位/克

UFC 超滤液浓缩物

kW 千瓦

atm 大气压

摩尔比 mol:mol

II.使用磷酸盐来稳定植酸酶

本发明的组合物和方法基于这样的惊人观察结果，即在与相对于植酸酶摩尔过量的无机磷酸一起预温育后，植酸酶的热稳定性提高。磷酸盐是一种低成本的配方成分，可以有利地替代更昂贵的植酸酶稳定赋形剂，诸如植酸盐。下面描述了所述组合物和方法的各方面和实施例。

A.磷酸盐的来源

用于稳定植酸酶的磷酸盐可以源自无机盐，诸如钠盐、钙盐、钾盐或铝盐，或源自有机化合物。磷酸盐的来源不是本发明的组合物和方法的关键。合适的磷酸盐至少包括单磷酸盐，诸如磷酸钠(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠)；多磷酸盐，诸如六偏磷酸钠和三偏磷酸钠；以及焦磷酸盐，诸如二磷酸二钠、二磷酸三钠和二磷酸四钠。其他磷酸盐形式可能也会起作用，例如磷酸、焦磷酸等的钾盐、镁盐、钙盐、铁盐和氨盐。

根据本发明的组合物和方法，用于稳定植酸酶的磷酸盐需要以比食品或动物饲料成分中通常或固有地存在的水平显著更高的水平添加，植酸酶(诸如呈液体、粉末、基质颗粒或多层颗粒的形式)在制粒之前与植酸盐掺和。换句话说，用于稳定植酸酶的磷酸盐是外源性磷酸盐；食品或动物饲料成分中存在的磷酸盐是内源性磷酸盐。本发明的组合物和方法中磷酸盐的计算量不包括微量的内源性磷酸盐。作为本发明的组合物和方法的主题的磷酸盐是外源性磷酸盐，其与植酸酶在功能上接近，以用于稳定植酸酶的预期目的。

此外，根据本发明的组合物和方法用于稳定植酸酶的磷酸盐不是源自植酸盐或植酸盐的任何水解产物，包括例如用于稳定植酸酶的植酸盐或其他磷酸肌醇。植酸盐、IP5、IP4、IP3、IP2或甚至IP0(肌醇)可以另外添加到包含植酸酶和磷酸盐的组合物中，但它不是磷酸盐的来源。替代性地，本发明的组合物可以明确地不含植酸盐、IP5、IP4、IP3、IP2和/或IP0，或者可以仅包含低水平的肌醇或磷酸肌醇，即低于10mM或甚至低于5mM，或肌醇或磷酸肌醇与植酸酶的比率小于10:1或甚至小于5:1。

稳定植酸酶所需的磷酸盐的量与植酸酶相比为50:1的摩尔比，或者浓度为50mM或更高。这将本发明的组合物和方法与Gebert在(WO 2013/119468)中描述的那些需要10毫摩尔植酸盐的组合物和方法区分开来。由于与植酸盐相比磷酸盐的成本低得多(与植酸盐相比低10-20倍)，并且由于这样的事实，即对于给定量的植酸酶，可以以较低的质量百分比添加磷酸盐，因此本发明的组合物和方法大大降低配方成本。可获得比植酸纯度高得多的磷酸盐，从而提高了配制产品的一致性。磷酸盐作为散装货物而不是特种化学品广泛可用，并且不会生成终产物，诸如肌醇或磷酸肌醇。

在一些实施例中，相对于造粒之前的液体植酸酶组合物(例如，UFC)，在至少50mM、至少100mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM、至少500mM、至少550mM或甚至至少600mM的磷酸盐下，植酸酶得以稳定。

在一些实施例中，关于固体或液体植酸酶组合物，在功能上接近的磷酸盐与总植酸酶蛋白的摩尔比为至少50:1、至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1，或甚至至少300:1。

在一些实施例中，使用本文提供的回收活性％公式计算，与其他未用磷酸盐稳定的相同植酸酶相比，经磷酸盐稳定的植酸酶的回收活性相对提高为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更高。

可以使用任何方式为植酸酶提供磷酸盐，即，使磷酸盐和植酸酶处于功能上接近。例如，可以将包含磷酸盐的液体与包含植酸酶的液体掺和。在另一个实例中，将植酸酶和磷酸盐喷雾干燥到固体支持物上。在一个特定实施例中，植酸酶和磷酸盐在颗粒例如多层颗粒或基质颗粒中在功能上接近。磷酸盐可以盐的形式添加，例如作为磷酸二氢盐或磷酸氢二盐，作为磷酸或以上的任何组合。

B.合适的植酸酶

植酸酶是一种蛋白质或多肽，其能够催化磷酸(包括磷酸肌醇诸如植酸盐中的那些)的酯的水解，从而释放出无机磷酸盐。一些植酸酶也能够水解至少一些中等磷酸化程度的肌醇磷酸，诸如包括IP5、IP4、IP3、IP2、IP1或IP0。将植酸酶添加到食品和动物饲料中，以增加磷酸盐的利用率，从而增加产品的营养价值。例如在加热和高压下的食品或动物饲料加工，可使植酸酶变性并降低其活性。

用于本发明的组合物和方法中的植酸酶可以是适合用于食品或动物饲料中的任何植酸酶。在一些实施例中，该酶是6-植酸酶(也称为4-植酸酶”或植酸6-磷酸酶)。在一些实施例中，该酶是组氨酸酸性植酸酶(HAP)，其为包含在原核生物(例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的appA植酸酶)和真核生物(来自曲霉属(Aspergillus)物种的phyA和B，来自酵母和植物的HAP植酸酶)中发现的成员的类别。HAP植酸酶共享在N末端的共同活性位点基序及其C末端的基序。

在一个实施例中，植酸酶来自大肠杆菌、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)、隔孢伏革菌(Peniophora lycii)或黑曲霉(Aspergillus niger)。在一些实施例中，植酸酶来自布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)，例如，来自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属物种菌株P1-29的植酸酶，或其变体，诸如BP-11、BP17和BP-111。

来自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属物种菌株P1-29的野生型植酸酶的氨基酸序列，下面示为SEQ ID NO:1：

布丘氏菌属物种的变体植酸酶BP-11的氨基酸序列，与野生型酶(SEQ ID NO:1)相比包含11个氨基酸取代，下面示为SEQ ID NO:2：

布丘氏菌属物种的变体植酸酶BP-17的氨基酸序列，与野生型酶(SEQ ID NO:1)相比包含12个氨基酸取代，下面示为SEQ ID NO:3：

布丘氏菌属物种的变体植酸酶BP-111的氨基酸序列，与野生型(SEQ ID NO:1)相比包含21个氨基酸取代，下面示为SEQ ID NO:4：

在一些实施例中，植酸酶是

如本文所述使用的植酸酶可以是“前体”、“未成熟的”或“全长的”，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟的”，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，否则本文使用的氨基酸残基编号是指相应植酸酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留植酸酶活性，本发明的淀粉酶多肽也可被截短以去除N-末端或C-末端。

植酸酶通常在微生物细胞，例如细菌或真菌细胞中产生。在一些实施例中，植酸酶在木霉属(Trichoderma)宿主细胞中产生。在一些实施例中，植酸酶在木霉属宿主细胞中产生，该宿主细胞包含内切-N-乙酰氨基葡糖苷酶基因(有时称为“endo-T”)的缺失，该基因编码从蛋白质中去除N-联糖基化的酶，包括植酸酶。在WO 09/114380中描述了示例性的endo-T缺失菌株。

添加到食品或动物饲料中的植酸酶单位的量将取决于食品或饲料本身的组成。含有较少量的可用磷的食品和饲料通常将需要较高量的植酸酶活性。所需的外源性植酸酶的量可以由技术人员确定。在一些实施例中，掺入食品或动物饲料中的植酸酶的量为每克食品或动物饲料0.1至20单位的植酸酶活性。通常，每公吨(1,000kg)食品或动物饲料中植酸酶的量为约50克(12,000U/g植酸酶颗粒)；这相当于每克食品或动物饲料中0.6单位的植酸酶。

在一些实施例中，植酸酶处于溶液中。在其他实施例中，植酸酶呈固态。在其他实施例中，将植酸酶喷雾干燥到固体支持物上或掺入粉末中。在其他实施例中，将植酸酶掺入颗粒诸如基质颗粒或多层颗粒中。在大多数实施例中，植酸酶最终掺入食品或动物饲料中。

在一些实施例中，植酸酶以至少0.5％w/w、至少1.0％w/w、至少1.5％w/w、至少2.0％w/w、至少2.5％w/w、至少3.0％w/w、至少3.5％w/w、至少4.0％w/w、至少4.5％w/w和甚至至少5.0％w/w的量存在于含有磷酸盐的液体或固体组合物中。

III.包含植酸酶和磷酸盐的组合物

包含植酸酶和磷酸盐的组合物包括液体组合物以及固体组合物，诸如粉末(包括喷雾干燥的粉末)和颗粒(包括固体颗粒和多层颗粒)。将要描述此类组合物的实例。

A.液体食品和动物饲料组合物

在一些实施例中，食品或动物饲料是液体，诸如液体饲料。在其他实施例中，食品或动物饲料是固体。如本文所用，术语动物包括所有动物，其实例包括非反刍动物(即，单胃动物诸如猪和家禽、鱼、狗、猫和人)和反刍动物(诸如牛、绵羊、山羊和马)。

食品或动物饲料可以包含植物蛋白。植物蛋白的合适来源是大豆、大豆粉、谷物(诸如玉蜀黍(玉米)、小麦、燕麦、大麦、黑麦和高粱)、谷物粉(诸如玉米粉、小麦粉、燕麦粉、大麦粉、黑麦粉、高粱粉和菜籽粕)、麸皮(诸如小麦麸皮和燕麦麸皮)、油料种子(诸如油菜籽和向日葵籽)、油料种子粕(诸如菜籽粕)、棉籽粕、白菜、甜菜和糖甜菜。

食品或动物饲料可以包含动物蛋白。合适的动物蛋白包括鱼粉和乳清。食品或动物饲料可以包含添加剂。合适的添加剂包括酶抑制剂、维生素、微量矿物质、大量矿物质、着色剂、芳香族化合物、抗微生物肽(诸如Leucocin A、Thanatin和Tritrpticin)和酶。

可以将液体植酸酶组合物施加于固体动物饲料组合物，其方法是在货盘化之前将其直接混合到饲料糊料中，或者将液体植酸酶制粒后液态施加(PPLA)到成品粒料上。

B.固体食品和动物饲料组合物

1.生产类型和方法

固体支持物和颗粒可以通过多种制造技术由多种材料生产。固体支持物包括可以例如通过喷雾、混合、吸收或以其他方式形成粒子(诸如颗粒或粉末)，将植酸酶和植酸掺入其中或其上的惰性固体材料。固体支持物的实例包括但不限于硫酸钠、硫酸镁、粒状蔗糖、淀粉-蔗糖糖丸(ASNP)和麦芽糖糊精。核中使用的材料应适合用于食品和/或动物饲料。

颗粒可以通过以下方式制成：例如旋转雾化、湿法造粒、干法造粒、喷雾干燥、圆盘造粒、挤出、锅包衣法、滚圆、转鼓造粒、流化床结块、高剪切造粒、流化床喷涂、结晶、沉淀、乳液胶凝、旋转盘式雾化和其他浇铸方法以及球形化工艺。参见例如US 4689297、US5324649、US 454332、US 6248706、US 6534466、EP 656058 B1和EP 804532 B1及美国专利号。颗粒的核可以是颗粒本身或者是分层颗粒的内核。核中使用的材料应适合用于食品和/或动物饲料。

2.粒子核

核可以包含一种或多种水溶性试剂或水分散性试剂，包括但不限于硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(例如，纤维素和纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、磷酸盐及其组合。合适的可分散试剂包括但不限于粘土、糖丸(糖和淀粉的组合；例如，淀粉-蔗糖糖丸-ASNP)、滑石、硅酸盐、羧甲基纤维素、淀粉及其组合。

在一些实施例中，核主要包含硫酸钠。在一些实施例中，核基本上由硫酸钠组成。在一个特定的实施例中，核仅由硫酸钠组成。

在一些实施例中，核包含在功能上接近的植酸酶和磷酸盐。在其他实施例中，核除了植酸酶之外还包含一种或多种酶。在其他实施例中，核包含一种或多种除植酸酶以外的酶。在其他实施例中，核是惰性的并且不包含酶。

在一些实施例中，核是酶粉，包括含有酶的UFC。可以将酶粉喷雾干燥，并且可以任选地与本文列出的任何水溶性试剂或水分散性试剂掺和。该酶可以是或可以包括待稳定的植酸酶，在这种情况下，酶粉还应该包括磷酸盐。

3.包衣层

在一些实施例中，核被至少一个包衣层包衣。在一个特定的实施例中，核被至少两个包衣层包衣。在另一个特定的实施例中，核被至少三个包衣层包衣。用于包衣层的材料可以适合用于食品和/或动物饲料中(参见，例如US 20100124586、WO 9932595和US5324649)。

在一些实施例中，包衣层包含以下材料中的一种或多种：无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(例如，纤维素和纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、粘土、糖丸(糖和淀粉的组合)、硅酸盐、羧甲基纤维素、磷酸盐、淀粉(例如，玉米淀粉)、脂肪、油(例如，菜籽油和石蜡油)、脂质、乙烯基聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗结块剂(例如，滑石、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(诸如FOAMBLAST

在一些实施例中，包衣层包含糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、粒状蔗糖、麦芽糊精和果糖)。在一些实施例中，包衣层包含聚合物，诸如聚乙烯醇(PVA)。用于掺入多层颗粒的包衣层中的合适的PVA包括具有低度至高度粘性的部分水解的、完全水解的和中度水解的PVA。在一些实施例中，包衣层包含无机盐，诸如硫酸钠。在一些实施例中，包衣层包含磷酸盐。

4.酶包衣层

在一些实施例中，至少一个包衣层是酶包衣层。在一些实施例中，核被至少两个酶层包衣。在另一个实施例中，核被至少三个或更多个酶层包衣。

在一些实施例中，所述酶是植酸酶与选自由以下项组成的组的一种或多种附加酶的组合：植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂肪酶、转移酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、氧化酶(例如，己糖氧化酶和麦芽糖氧化还原酶)、蛋白酶及其混合物。通常，至少一个酶包衣层包含至少一种植酸酶、和磷酸盐。

以上酶列表仅是实例，并不意味着排他性。任何酶都可以用于本文所述的颗粒中，包括细菌、真菌、酵母、植物、昆虫和动物来源的野生型酶、重组酶和变体酶，以及酸性酶、中性酶或碱性酶。

在一些实施例中，酶包衣层还可以包含一种或多种选自由以下项组成的组的附加材料：糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、粒状蔗糖、麦芽糊精和果糖)、淀粉(例如，玉米淀粉)、脂肪、油(例如，菜籽油和石蜡油)、脂质、乙烯基聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗结块剂(例如，滑石、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(诸如可从法国莱斯昆的Ouvrie PMC公司获得的FOAMBLAST

4.磷酸盐在颗粒中的定位和分布

在颗粒被包衣的情况下，在一些实施例中，核包含植酸酶和磷酸盐两者。在一些实施例中，包衣包含植酸酶和磷酸盐两者。在一些实施例中，核包含植酸酶，而包衣包含磷酸盐。在一些实施例中，核包含磷酸盐，而包衣包含植酸酶。在一些实施例中，单个酶包衣层包含磷酸盐和植酸酶两者。在一些实施例中，多个酶包衣层包含磷酸盐和植酸酶两者。在一些实施例中，磷酸盐和植酸酶处于相邻的层中，因此在功能上接近。

C.食品和动物饲料粒料

根据各种已知的制粒方法中的任一种，粒料可以包含如本文所述的颗粒和/或多层颗粒，其实例在下文进一步描述。在一些实施例中，粒料包含植酸酶、磷酸盐和至少一种食品或饲料成分。在一些实施例中，粒料包含至少一种食品或饲料成分以及含有磷酸盐和植酸酶的颗粒。

本发明的组合物和方法的粒料可以通过将饲料混合物的温度升高至高水平以便杀灭细菌的方法来生产。通常在制粒之前通过称为调质的过程即蒸汽处理来升高温度。随后，可以使经过调质的饲料混合物通过模具以生产特定尺寸的粒料。可以通过将本文所述的颗粒和/或多层颗粒与如本文所述的食品或动物饲料混合来制备饲料混合物。

通常，蒸汽调质器在约85℃至约95℃或更高的温度下处理掺和物约20秒至约90秒，并且最多几分钟。蒸汽的量可以根据水分的量及食品或动物饲料混合物的初始温度而变化。据报道在制粒工艺中添加约4％至约6％的蒸汽，并且选择该量是为了在制粒之前在糊料中产生少于约18％的水分，或在打算用于挤出的糊料中产生最多约28％的水分。

任选的膨胀过程可在约100℃至约140℃的温度范围内进行约4秒至约10秒。制造过程的制粒机部分通常在约85℃至约95℃的温度下工作约3秒至约5秒。

在制粒之前，未制粒的混合物(所谓的粒料预混物或前体、基础混合物、糊料和稀释剂)通常含有维生素和微量矿物质。基础混合物通常含有食品和动物饲料成分，诸如磷酸二钙、石灰石、盐以及维生素和矿物质的预混物，但不含谷物和蛋白质成分。稀释剂包括但不限于谷物(例如小麦粉头和米糠)和粘土，诸如层状硅酸盐(硅酸镁海泡石、膨润土、高岭土、蒙脱土、锂蒙脱石、皂石、贝得石、凹凸棒石和硅镁石)。粘土还充当食品和动物饲料预混料的载体和流化剂或稀释剂。糊料通常包括完整的动物饮食。例如，糊料包含以下物质或由以下物质组成：玉米、大豆粉、豆油、盐、DL蛋氨酸、石灰石、磷酸二钙以及维生素和矿物质。在一个实例中，糊料由61.10％的玉米、31.43％的大豆粉、48.4％的豆油、0.40％的盐、0.20％的DL蛋氨酸、1.16％的石灰石、1.46％的磷酸二钙以及0.25％的维生素和矿物质组成。

在一个实施例中，通过将至少一种食品或饲料成分(诸如糊料)与溶液中的植酸酶和磷酸盐掺和，蒸汽调质所得掺和物，然后将掺和物制粒来生产食品或动物饲料。可以将液体植酸酶组合物施加于固体动物饲料组合物，其方法是在货盘化之前将其直接混合到饲料糊料中，或者将液体植酸酶制粒后液态施加(PPLA)到成品粒料上。

在一个实施例中，通过将至少一种食品或动物饲料成分(诸如糊料)与呈固态(诸如在颗粒如多层颗粒中)的植酸酶和磷酸盐掺和，蒸汽调质所得掺和物，然后将掺和物制粒来生产食品或动物饲料。

例如，可以将未制粒的玉米粉和大豆粉(诸如60％玉米粉和40％大豆粉)的混合物与包含植酸酶和磷酸盐的多层颗粒掺和，然后在90℃下进行蒸汽调质30秒。然后将掺和物挤出以形成动物饲料粒料。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法的组合物可存在于经热处理的食品或动物饲料粒料中。可以将此类经热处理的食品或动物饲料粒料在至少90℃的温度下进行热处理(诸如蒸汽调质)至少30秒(例如，在90℃-100℃下至少30-60秒)。然后可以将掺和物挤出以形成动物饲料粒料。

IV.使用磷酸盐来稳定植酸酶的方法和过程

本发明组合物的使用方法主要涉及向必须进行热处理(诸如通过蒸汽制粒)的食品和动物饲料产品中添加植酸酶。与尚未使用磷酸盐稳定的植酸酶相比，植酸酶的稳定性在液态和/或固态下可以显著改善。本发明的方法是对Gebert在WO 2013/119468中描述的那些方法的改进，后者需要至少10毫摩尔植酸盐。尽管稳定植酸酶所需的磷酸盐的量大于所需植酸盐的量，但与植酸盐相比，磷酸盐的成本低得多，大大有益于配方成本。

在一些实施例中，相对于造粒之前的液体植酸酶组合物(例如，UFC)，在至少50mM、至少100mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM、至少500mM、至少550mM或甚至至少600mM的磷酸盐下，植酸酶得以稳定。

在一些实施例中，关于固体或液体植酸酶组合物，在功能上接近的磷酸盐与总植酸酶蛋白的摩尔比(即，mol:mol)为至少50:1、至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1，或甚至至少300:1。

在一些实施例中，植酸酶以至少0.5％w/w、至少1.0％w/w、至少1.5％w/w、至少2.0％w/w、至少2.5％w/w、至少3.0％w/w、至少3.5％w/w、至少4.0％w/w、至少4.5％w/w和甚至至少5.0％w/w的量存在于含有磷酸盐的液体组合物中。

在一些实施例中，使用本文提供的回收活性％公式计算，与其他未用磷酸盐稳定的相同植酸酶相比，在热处理后经磷酸盐稳定的植酸酶的回收活性为至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％或更高。

在一些实施例中，使用本文提供的回收活性％公式计算，与其他未用磷酸盐稳定的相同植酸酶相比，经磷酸盐稳定的植酸酶的回收活性相对提高为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更高。

VI.各种实施例的组合

可以组合本文所述的组合物和方法的实施例，包括在不同章节标题下描述的那些，以及将对技术人员显而易见的其他实施例，除非该组合会破坏本发明的组合物和方法的既定目的和优点。

实例

以下实例旨在说明本发明的组合物和方法的实施例，而不应以任何方式解释为限制性的。

实例1.在赋形剂的存在下对植酸酶熔解温度的测定

进行实验以确定在热暴露期间添加不同的赋形剂是否会提高液态植酸酶的熔解温度。以最高的溶解度制备赋形剂溶液，然后将其从最高浓度滴定到最低浓度，之后将其添加到植酸酶UFC中。然后将酶/赋形剂组合暴露于21-95℃的温度曲线，并经由差示扫描荧光测定法测量熔解温度。

材料

使用以下设备和试剂：

·BP-17植酸酶UFC(70,000FTU/g或123.4g/L植酸酶)

·无水磷酸氢二钠(杰帝贝柯公司(J.T.Baker)，批号V31149，FW141.96)

·用于调节pH的浓磷酸

·植酸钠水合物(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，P8810-500G)

·柠檬酸钠二水合物(杰帝贝柯公司，FW 294.1)

·用于调节pH的浓柠檬酸

·无水硫酸钠粉末(FW 142.04)

·用于调节pH的硫酸

·玻璃状聚磷酸钠(光谱公司(Spectrum)，S0169，60-71％P

·用于调节pH的10％NaOH

·pH计

·Whatman Autovial非针头式过滤器，0.45μM

·带有标准毛细管的Prometheus NT.48nanoDSF(诺坦普科技有限公司(NanoTemper Technologies))

·Corning 3641 96孔透明平底聚苯乙烯非结合表面微孔板

·Corning 15mL聚丙烯离心管(西格玛奥德里奇)

UFC的制备

经由HPLC测得UFC中植酸酶的浓度为123.9g/L。通过向5mL的UFC中添加22μL的10％NaOH将UFC的pH从5.03调节至5.49，将植酸酶的浓度稀释至123.36g/L。

稳定剂的制备

将1克植酸溶于5mL的pH 5.5的0.1M乙酸盐缓冲液中，制得20％的植酸溶液。使用20％NaOH将pH从4.2调节至5.47，然后使用0.45μM非针头式过滤器过滤溶液。将5克无水硫酸钠溶解到20mL水中制得25％的无水硫酸钠溶液。使用硫酸将pH调节至5.6，然后使用0.45μM非针头式过滤器过滤溶液。将5克聚磷酸钠溶解到25mL水中制得20％的聚磷酸钠溶液。使用浓磷酸将pH调节至5.6，然后使用0.45μM非针头式过滤器过滤溶液。将5克柠檬酸钠溶解到20mL水中制得25％的柠檬酸钠溶液。使用80％的柠檬酸将pH调节至5.6，然后使用0.45μM非针头式过滤器过滤溶液。将2克磷酸氢二钠溶解到10mL水中制得20％的磷酸氢二钠溶液。使用浓磷酸将pH调节至5.6，然后使用0.45μM非针头式过滤器过滤溶液。

用于赋形剂稀释的板设置

将体积为100μL的赋形剂储液添加到96孔板第1列的孔A中。将体积为50μL的水添加到同一96孔板第1列的每个孔B-H中。通过将50μL转移到随后的每个孔中，将赋形剂储液从该板的列向下滴定2倍。向新的96孔板第1列的每个孔中添加80μL经pH调节的UFC。从滴定的赋形剂的每个孔中直接转移20μL体积到含UFC的相应孔中。

差示扫描荧光测定法设置

将含有酶和赋形剂组合的96孔板在平板振荡器上混合5秒。通过将毛细管浸入96孔板的每个孔中，然后将其上样到Nanotemper仪器上来填充nanoDSF的标准毛细管。将Nanotemper仪器编程为在10％激发功率和21-95℃下以1℃/分钟的斜率运行。Nanotemper仪器通过测量330nm和350nm的波长来监测蛋白质内在色氨酸荧光在解折叠时的转变。通过分析荧光强度之比(F350/F330)的变化来测定蛋白质熔解温度(Tm)，并且它是荧光与温度曲线的导数的最大值。

如图1所示，在摩尔比为14:1的植酸钠与植酸酶的存在下，植酸酶的Tm增加大约2.7℃。如图2和3所示，在摩尔比为130:1的磷酸钠与植酸酶的存在下，植酸酶的熔解温度增加大约5.5℃。磷酸盐似乎不稳定植酸酶UFC中存在的背景蛋白，背景蛋白由色谱图的第一个峰表示，而是特异性地影响植酸酶，植酸酶由色谱图的第二个峰表示。如图4所示，当针对阴离子当量归一化时，在与植酸酶相等的摩尔比下，磷酸钠的稳定作用高于植酸钠、聚磷酸钠和硫酸钠的稳定作用。另外，稳定机制似乎不是Hofmeister效应，即不是与盐通过与蛋白质周围的溶剂化水相互作用，在盐化我们的蛋白质构象或物理稳定蛋白质构象中充当感胶离子的程度有关，因为在磷酸盐而不是硫酸盐的存在下Tm的增加要高得多，而硫酸盐(参见，例如Hofmeister F.(1888)Arch.Exp.Pathol.Pharmacol.[实验室病理学和药理学档案]24:247-260；在Zhang Y.和Cremer P.S.(2006)Current Opinion in ChemicalBiology.[化学生物学最新观点]10:658-63中有综述)。

如图5所示，稳定机制似乎也不是电荷效应，因为当针对磷酸盐当量归一化时，在磷酸盐而不是柠檬酸盐的存在下，熔解温度的增加要高得多。

实例2：在稳定性盐的存在下对BP-17植酸酶的热失活

进行实验以确定在热应激条件下添加赋形剂是否使植酸酶保持其活性。温育30分钟后，选择在不存在赋形剂的情况下使植酸酶完全失活的温度。以最高的溶解度制备赋形剂溶液，然后将其从最高浓度滴定到最低浓度，之后将其添加到植酸酶UFC中。然后将酶/赋形剂组合暴露于70℃的温度下，并在温育2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟后经由比色活性测定法测量残留活性。

材料

使用以下设备和试剂：

·BP-17植酸酶UFC(70,000FTU/g或123.4g/L植酸酶)

·BP-17植酸酶标准品(22,000FTU/g)

·BP-17植酸酶对照(36,500FTU/g)

·具有12个孔的0.2mL PCR条管(VWR 53509-306)

·高压灭菌水

·具有温度梯度功能的温度循环仪

·96孔PCR制备架

·大型台式离心机

·无水磷酸氢二钠(西格玛奥德里奇)，141.96g/mol

·柠檬酸钠二水合物(杰帝贝柯公司)，294.1g/mol

·用于调节pH的磷酸和柠檬酸

·pH计

·测定缓冲液：含0.05％(w/v)吐温20的0.1M乙酸盐缓冲液pH 5.5

·底物缓冲液：0.1M乙酸盐缓冲液pH 5.5

·植酸钠水合物(西格玛奥德里奇)

·Pi Blue终止液：POPB-500(美国生物测定系统公司(BioAssay Systems US))

·

·用于96孔板的

·iEMS培养箱

·SpectraMax 340酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices))

稳定剂盐溶液的制备

将5克无水磷酸氢二钠溶于25mL水中，制得20％(或1.41M)的磷酸钠溶液。使用浓磷酸将pH调节至5.5。将5克柠檬酸钠二水合物溶解到20mL水中，制得25％(或0.85M)的柠檬酸钠溶液。使用80％的柠檬酸将pH调节至5.5。

PCR条的制备

将体积为80μL的20％磷酸钠储液添加到8个不同的12孔PCR条的第一个孔中。将40μL的-Q水加到每个PCR条的孔2、3、4、5和6中。从孔1到孔6，磷酸钠储液依次连续稀释2倍。将体积为80μL的25％柠檬酸钠储液添加到每个PCR条的孔7中。将40μL的水加到每个PCR条的孔8、9、10、11和12中。从孔7到孔11，磷酸钠储液依次连续稀释2倍，留下孔12仅含水。将BP-17植酸酶UFC在高压灭菌水中稀释50倍。将体积为40μL的稀释UFC添加到8个不同的含有稀释赋形剂的12孔PCR条的每个孔中。

热失活

将温度循环仪编程为70℃的温度。将一个PCR条密封并立即置于冰上以进行零时间测量。将剩余的PCR条密封，置于PCR内部，温育不同的时间增量(0.5分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟)，然后从PCR中取出并立即置于冰上。在冰上收集完每个PCR条后，将它们置于96孔PCR管架上，并以3500rpm离心2分钟。

植酸酶活性测定

由于在热失活过程中发生了一些沉淀，因此将PCR条进行离心，并将上清液取出并在非结合(Corning 3641)96孔板中用测定缓冲液(0.1M乙酸盐缓冲液pH 5.5+0.05％w/v吐温20)稀释至最终活性为0.012FTU/mL。将40μL的体积从酶稀释板转移到单独的反应板(Costar 9017，培养基结合)中。然后向反应板的每个孔中添加体积为40μL的底物(150μM植酸钠)。将反应板密封并在25℃和900rpm下温育10分钟。然后向反应板的每个孔中添加体积为170μL的Pi Blue终止液/显色试剂(美国生物测定系统公司生产的POPB-500)以终止反应。将板密封并在25℃和400rpm下温育30分钟以显色，然后在分光光度计中于620nm读数。

如图6所示，在352mM磷酸钠的存在下温育60分钟后，大约90％的相对残留植酸酶活性得以保留(使用本文所述的回收活性％计算)。在存在该浓度的一半时，温育60分钟后，大约60％的植酸酶活性得以保留。低于该浓度时，植酸酶似乎是几乎失活的。如图7所示，在425mM柠檬酸钠的存在下温育60分钟后，大约90％的植酸酶活性得以保留。在存在该浓度的一半时，温育60分钟后，大约50％或更少的植酸酶活性得以保留。低于该浓度时，植酸酶似乎是失活的。为了在热应激条件下实现相似的活性曲线，与磷酸钠相比需要更高浓度的柠檬酸钠。就这一点而言，磷酸钠似乎是比柠檬酸钠更好的植酸酶稳定剂。

实例3.抑制机制

通过在存在滴定的底物和滴定的赋形剂浓度的情况下测量植酸酶的活性，进行动力学分析以确定磷酸钠和柠檬酸钠对于植酸酶的稳定机制。

材料

使用以下设备和试剂：

·BP-17植酸酶UFC(70,000FTU/g或123.4g/L植酸酶)

·无水磷酸氢二钠(西格玛奥德里奇)，141.96g/mol

·柠檬酸钠二水合物(杰帝贝柯公司)，294.1g/mol

·用于调节pH的磷酸和柠檬酸

·pH计

·稀释缓冲液：含0.05％(w/v)吐温20的0.1M乙酸盐缓冲液pH 5.5

·4-硝基苯磷酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐(西格玛奥德里奇)

·底物缓冲液：0.25M乙酸盐缓冲液pH 5.5

·终止缓冲液：200mM硼酸盐pH 10.2

·Corning 3641 96孔透明平底聚苯乙烯非结合表面微孔板

·用于96孔板的VWR铝箔

·具有微孔板模块的Eppendorf ThermomixerTMR(飞世尔科技公司(FisherScientific))

·SpectraMax 340酶标仪(分子仪器公司)

酶和底物的制备

将BP-17植酸酶UFC在pH 5.5的0.1M乙酸盐缓冲液中稀释7,000倍。

将0.923克的4-硝基苯磷酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐溶解在5mL的0.25M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中制得底物储液(400mM)。将体积为200μL的底物储液添加到96孔板的第1列和第7列中。将体积为100μL的0.25M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)添加到同一96孔板的第2-6列和第8-12列中。通过以下方式进行连续稀释：将100μL从96孔板的第1列转移到第2列，然后在整块板上重复该稀释模式直到第6列，从而制得以下底物浓度：400mM、200mM、100mM、50mM、25mM和12.5mM。在该板的后半部分从第7列到第12列进行相同的连续稀释。

磷酸钠的制备

将5克无水磷酸氢二钠溶于25mL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中，制得20％(或1.41M)的磷酸钠溶液。然后，通过将1mL储液与6mL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)合并，将20％的磷酸钠溶液稀释7倍，制得200mM的浓度。向96孔板A行的每个孔中添加体积为200μL的磷酸钠溶液(200mM)。向同一96孔板的B-H行中的每个孔添加体积为100μL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)。通过以下方式进行连续稀释(2倍)：将100μL从96孔板的A行转移到B行，然后沿该板向下重复该稀释模式直到G行，从而产生以下磷酸钠浓度：200mM、100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM、3.125mM和0mM。

柠檬酸钠的制备

将5克柠檬酸钠二水合物溶于20mL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中，制得25％(或0.85M)的柠檬酸钠溶液。向一块新的96孔板A行的每个孔中添加体积为200μL的柠檬酸钠溶液(0.85M)。向同一96孔板的B-H行中的每个孔添加体积为100μL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH5.5)。通过以下方式进行连续稀释(2倍)：将100μL从96孔板的A行转移到B行，然后沿该板向下重复该稀释模式直到G行，从而产生以下柠檬酸钠浓度：850mM、425mM、212.5mM、106.25mM、53.13mM、26.56mM、13.28mM和0mM。

底物/赋形剂板的制备

通过向两块板的第1-6列和第7-12列添加25μL的滴定底物浓缩物，制备出两块相同的96孔底物板。向第一块底物板的每个相应孔中添加体积为75μL的滴定磷酸钠浓缩物，以得到以下浓度的底物和赋形剂：

100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM和3.125mM底物

150mM、75mM、37.5mM、18.75mM、9.38mM、4.69mM和2.34mM磷酸钠

向第二块底物板的每个相应孔中添加体积为75μL的滴定柠檬酸钠浓缩物，以得到以下浓度的底物和赋形剂：

100mM、50mM、25mM、12.5mM、6.25mM和3.125mM底物

637.5mM、425mM、212.5mM、106.25mM、53.13mM、26.56mM和13.28mM柠檬酸钠

PNPP测定

向空的96孔板的第1-6列添加体积为5μL稀释7,000倍的BP-17植酸酶UFC。向同一96孔板的第7-12列添加体积为5μL的0.1M乙酸盐缓冲液(pH 5.5)，用作空白。以相同的方式设置相同的板。向含有稀释UFC的第一块96孔板的每个相应孔中添加体积为55μL的底物/磷酸盐组合。向含有稀释UFC的第二块96孔板的每个相应孔中添加体积为55μL的底物/柠檬酸盐组合。将两块96孔反应板密封并于恒温混匀仪中在25℃、650rpm下放置15分钟。反应完成后，向每个孔中添加体积为70μL的硼酸盐终止缓冲液(200mM)pH 10.2。将板密封并于板振荡器上在25℃和650rpm下放置1分钟，然后在分光光度计中于405nm读数。PNPP测定法测量对硝基苯基磷酸酯脱磷酸化为对硝基苯酚，后者变成黄色可溶性产物，可以在分光光度计上在405nm的波长下测量该黄色可溶性产物。

如图8所示，在环境测定条件下，在存在浓度不断增加的植酸底物时，增加磷酸钠的浓度会降低植酸酶的活性。在150mM磷酸钠和100mM植酸底物的浓度下，植酸酶显示出极小的活性。在植酸底物的存在下，磷酸钠抑制酶的活性；因此，它必须竞争该酶的活性位点。如图9所示，在环境测定条件下，在存在浓度不断增加的植酸底物时，低浓度的柠檬酸钠开始降低植酸酶的活性，但在26mM或更高的浓度下，活性损失似乎趋于平稳。因此，柠檬酸钠的稳定机制必然不同于磷酸钠对植酸酶的稳定机制。

实例4.造粒和制粒性能

使用流化床喷雾工艺生产多层酶颗粒，如在通过援引并入的美国专利号5,324,649中所述(另见美国专利公开号2015037491)。如表1所汇总的，在(A)无受体、(B)具有植酸盐或(C)具有磷酸盐的情况下制备颗粒。

表1.颗粒的组成

在制粒之前，使用蒸汽模拟器装置蒸汽过程模拟器比较颗粒的回收活性，申请人发现可预测制粒稳定性。蒸汽过程模拟器由与一根柔性软管接通的饱和蒸汽源组成，该柔性软管的内径为大约1/4英寸，接入三通阀中，该三通阀向直径为约6英寸的接收室供汽，在接收室上方可以放置直径匹配的筛网。三通阀还与真空管线接通，以便在启动真空管线的同时可以立即关闭入口蒸汽供给。

为了进行蒸汽过程模拟器测试，将大约1-2克的植酸酶颗粒置于筛网上。打开供汽管线，使得蒸汽缓慢向上流过筛网，并与酶颗粒接触规定的秒数，之后转动三通阀以关闭供给，并引导环境空气反向流过颗粒，从而立即停止与蒸汽的接触并引起快速冷却和干燥。从蒸汽过程模拟器中移出筛网和蒸汽颗粒，并使其风干过夜。然后测定颗粒的保留植酸酶活性，并根据保留的植酸酶活性占蒸汽处理之前未经蒸汽处理的初始颗粒的植酸酶活性的百分比,计算植酸酶活性回收率。图10示出了与未经模拟蒸汽处理的颗粒相比，经过48秒模拟蒸汽处理的颗粒中回收的植酸酶活性的百分比。用磷酸盐稳定化提供的回收率比用植酸盐稳定化高11％。

将颗粒与60％玉米粉和40％大豆粉的混合物(即糊料)混合，其比率为60克颗粒与120千克玉米-大豆粉，使得制粒前混合物中植酸酶的最终活性为大约5单位/克。

然后将该混合物在动物饲料制粒机中制粒。将颗粒和玉米-大豆粉在卧式螺带混合器中混合大约8分钟。制粒机是单辊型Simon Heesen，装有内径为17.3cm的模具，粒料孔径为3mm。模具速度为500rpm，由7.5kW电机驱动。典型的进料速度为每小时300kg。在调质器的进料出口处测得的调质器中的温度保持在+/-0.1℃。该调质器具有级联式混合器系统。调质温度为100℃。蒸汽入口压力为2个大气压，调质器中的温度通过手动调质三个控制蒸汽输送的阀门进行控制。在调质器中的停留时间为30秒或60秒。达到目标温度时，系统运行大约5至10分钟，然后进行采样。采样1-1.5分钟，相当于5-7.5kg粒状饲料，然后立即置于具有穿孔底部和每小时1500立方米气流的冷却箱中。冷却15分钟后，使用分样器将样品缩小5倍，然后取250g进行实验室测试。制粒和冷却后，研磨粒料并测定其植酸酶活性。

图11中示出了使用本文提供的回收活性％公式，与未制粒的颗粒中的植酸酶活性相比，在100℃下制粒30秒或60秒的颗粒中回收的植酸酶活性的百分比。用磷酸盐稳定化提供的回收率在30秒后比用植酸盐稳定化高4％，在60秒后比用植酸盐稳定化高11％。

尽管出于清楚和理解的目的已经通过说明和实例的方式详细地描述了前述组合物和方法，但是将显而易见的是，在不脱离本发明的组合物和方法的精神和范围的情况下，可以实践某些变化和修改。因此，该描述不应解释为限制由所附权利要求描述的本发明的组合物和方法的范围。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均特此出于所有目的通过援引以其全文并入本申请。