FRT细胞株及其在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及FRT细胞株及其在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试剂盒中的应用。

背景技术

P2Y受体(purinergic receptor P2Y，P2rys)是一类由胞外核苷酸活化的G蛋白偶联受体，目前已经从人体组织细胞中克隆了8个P2ry亚单位，P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6、P2ry11～14；其中P2ry2(purinergic receptor P2Y,G-protein coupled2，P2ry2)作为P2ry的一个重要亚型，日趋受到人们的重视。P2ry2广泛分布在脾、睾丸、肾、肺、心脏和大脑中，与诸多生理功能密切相关，如冠状动脉平滑肌收缩、慢性支气管炎、动脉粥样硬化、囊性纤维化和对癌症的治疗等。因此P2ry2的调节剂在疾病治疗中发挥重要作用，UTP作为P2ry2天然的激动剂可以介导小鼠冠状动脉收缩；地夸磷索(diquafosol)是P2ry2激动剂在治疗干眼病中的常用药物；激活P2ry2在治疗胃食管反流病、乳腺癌及心肌缺血等疾病方面也有潜在的作用。其拮抗剂可以治疗特发性肺纤维化；改善卵母细胞的发育能力；可抑制炎症反应等。P2ry2在许多病理条件下显示出可塑性，可能是治疗这些疾病的潜在靶标。由于P2Y受体亚型重叠表达，目前发现的激活剂和拮抗剂大多数作用于P2Y受体，缺少P2ry2高特异性、高亲和力的受体激动剂和拮抗剂。

近年来检测细胞内游离Ca

发明内容

有鉴于此，本发明构建了检测细胞内游离钙离子浓度的细胞筛选模型。该模型经济简便快捷高效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了所述的FRT细胞株在检测细胞内游离钙离子浓度中的应用；

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

本发明还提供了所述的FRT细胞株在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试剂盒中的应用；

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

本发明还提供了检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试剂盒，包括所述的FRT细胞株以及可接受的助剂；

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

研究过程中，本发明提供了ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达的FRT细胞株。

黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)可在细胞内长久表达，其相对荧光强度高，重复性好。YFP-H148Q/I152L是对卤族元素敏感YFP的双突变体，已被用作表达钠碘转运体内源性或外源性细胞内I

在上述研究的基础上，本发明提供了所述的FRT细胞株的构建方法，构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体，经脂质体转染、抗生素筛选和稀释，获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。

本发明还提供了所述的FRT细胞株在制备筛选P2ry2调节剂的制剂或试剂盒中的应用；

所述FRT细胞株检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。

在本发明的一些具体实施方案中，所述P2ry2调节剂包括激动剂或拮抗剂；所述激动剂包括ATP；所述拮抗剂包括suramin。

本发明还提供了所述的FRT细胞株在制备预防和/或治疗与P2ry2相关疾病的药物中的应用；

所述FRT细胞株检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。

在本发明的一些具体实施方案中，所述与P2ry2相关疾病包括冠状动脉平滑肌收缩、慢性支气管炎、动脉粥样硬化、囊性纤维化、癌症、干眼病、胃食管反流病、心肌缺血、特发性肺纤维化、卵母细胞发育不良、炎症中的一种或多种。

本发明还提供了筛选P2ry2调节剂的制剂或试剂盒，包括所述的FRT细胞株以及可接受的助剂；

所述FRT细胞株检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。

本发明还提供了预防和/或治疗与P2ry2相关疾病的药物，采用所述的FRT细胞株筛选获得；

所述FRT细胞株检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca

其中，相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内Ca

所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。

本发明采用RT-PCR方法验证FRT细胞中P2ry2的mRNA表达水平，切胶回收PCR扩增产物并进行序列测序和比对，进一步应用Westernblot检测FRT细胞的P2ry2蛋白表达水平；构建钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体，应用脂质体转染、抗生素筛选和有限稀释，获取共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。倒置荧光显微镜观察共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞的情况，并应用荧光淬灭动力学试验验证模型的有效性；荧光淬灭动力学试验验证细胞模型可筛选P2ry2调节剂，并应用Fura-2技术检测细胞内游离钙的变化，探究胞内Ca

FRT细胞内源性表达P2ry2；倒置荧光显微镜中观察到ANO1在细胞膜上表达绿色荧光和YFP-H148Q/I152L在胞浆中表达绿色荧光，成功构建共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L细胞模型；荧光淬灭动力学试验证实该细胞模型可筛选P2ry2调节剂，应用Fura-2表明该细胞模型可敏感地检测胞浆内钙离子浓度的变化且Ca

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示CaCC法筛选P2ry2调节剂原理；其中，A：未加激活剂之前，YFP双突变体荧光未淬灭；B：加激活剂之后，YFP双突变体荧光淬灭；

图2示FRT细胞内源性表达P2ry2；其中，A：RT-PCR检测FRT细胞内P2ry2基因表达；泳道1:marker；泳道2:P2ry2；泳道3:β-actin；B：P2ry2条带的切胶回收产物测序结果；C：核苷酸序列在NCBI-BLAST比对结果图；D：Western blot检测PRT细胞中P2ry2蛋白表达；

图3示倒置荧光显微镜观察稳定转染后蛋白质表达情况；其中，A：ANO1在FRT细胞中的表达；B：YFP-H148Q/I152L在FRT细胞中的表达；

图4示荧光淬灭动力学试验验证细胞模型有效性；n＝3.**P<0.01vs controlgroup

图5示荧光淬灭动力学试验验证细胞模型可筛选P2ry2调节剂；Mean±SD.n＝3.**P<0.01vs control group；

图6示Fura-2荧光探针法的检测结果；其中，A:加入不同浓度ATP检测slope值；B：加入不同浓度ATP检测细胞内Ca

图7示P2ry2激活剂和抑制剂的剂量依赖曲线；其中，A：P2ry2激活剂的剂量依赖曲线；B：P2ry2抑制剂的剂量依赖曲线；

图8示96孔板的Z'因子检测；其中，A：通过Z因子检测的原始数据信号。

B:原始数据散点图；

图9示CaCC法和荧光探针法灵敏度比较结果；其中，A：在细胞内不同Ca

具体实施方式

本发明公开了FRT细胞株及其在制备筛选P2ry2调节剂的制剂或试剂盒中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语：

CaCC法：基于CaCC检测细胞内钙浓度的检测方法。

本发明首次提出了相对荧光强度变化值/slope值/斜率值的概念：

本方法通过动态检测相对荧光强度的变化，并进一步量化相对荧光强度的变化，

每一个荧光强度变化值(也称作slope值/斜率值)对应一个细胞内的Ca

具体相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：

y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。

如图5左是动态检测荧光强度变化值的原始结果，图5右是利用原始结果的数据根据公式计算的结果。

P2ry2作为P2ry重要的亚型，偶联于G蛋白—G

目前常选用检测细胞内Ca

因FRT内源性表达P2ry2，本实验室构建基于钙激活氯离子通道ANO1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L真核表达载体的FRT细胞。实验结果表明，在加入ANO1的激动剂后，荧光信号强度显著下降，加入ANO1的抑制剂后，荧光信号强度无明显变化，说明成功构建ANO1-YFP-H148Q/I152L细胞模型；在加入P2ry2的激动剂后，荧光信号强度显著下降，加入P2ry2的抑制剂后，荧光信号强度无明显变化，说明本模型适用于P2ry2调节剂的筛选；细胞内Ca

本模型为P2ry2调节剂的初筛模型，具体在应用上也会出现很多问题，以下因素可能会影响筛选结果：筛选到的激活剂可能作用于其他内源性表达的Ca

本发明构建的细胞模型为探究P2ry2功能和机制提供了良好的基础。此外还可应用于钙激活氯离子通道ANO1的调节剂筛选，为后续深入研究钙激活氯离子的生理病理过程及钙激活氯离子通道调节剂的发现奠定了基础。

统计学处理：所有样本检测均重复3次以保证检测结果准确性。利用GraphPadPrism 5软件对对照组和实验组进行数据处理，所有样本不服从正态分布，为秩和检验，统计学分析采用Mann-Whitney检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

主要仪器

PCR仪(ABI)；电泳仪、ChemiDoc凝胶成像仪(BIO-RAD)；倒置荧光显微镜(Nikon)；Fluo Star多功能酶标仪(BMG)。

细胞和主要试剂

Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(Fischer rat epithelial，FRT)细胞由中国科学院应用化学研究所关新刚教授馈赠。RT-PCR试剂盒购自南京诺唯赞公司；PCR试剂盒，DNAMarker购自全式金公司；琼脂糖购自OXOID公司；RIPA、DAB显色液购自碧云天公司；兔抗大鼠P2ry2多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin单克隆抗体、山羊抗兔IgG购自Abcam公司；Lipofectamine 3000脂质体、Zeocin抗生素、G418抗生素购自Invitrogen公司；Fura-2/AM、ATP、UTP、ADP、suramin、PPADS、Eact、NFA购自Sigma公司；引物由金唯智公司合成，见表1。

表1引物序列

本发明提供的FRT细胞株及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 RT-PCR法检测P2ry2的mRNA表达

设计P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6、P2ry12～14的引物，选择生长状态良好的FRT细胞株，加入TRIzol，按照说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR，反应条件为94℃预变性5min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃再延伸5min；反应体系温度最终降至4℃。所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

表2

实施例2 PCR产物切胶回收测序

待凝胶尚未干燥时，用干净的手术刀片切取含有目的条带的凝胶，要使切下的凝胶条尽可能细，用小镊子移入0.5mLEP管内并称重；加入3～5倍的溶胶液，50℃水浴5～10min，保证胶块充分溶解，将所得溶液放入吸附柱中，8000×g离心30s后倒掉废液；向吸附柱中加入两次漂洗液，9000×g离心30s后倒掉废液，并将空吸附柱离心，尽量除尽漂洗液；将吸附柱彻底晾干，放入干净的EP管中，向吸附膜中间位置加入适量双蒸水，离心1min后收集DNA溶液；将所得DNA溶液送生工公司进行测序。

实施例3 Western blot法检测细胞P2ry2的蛋白表达

(1)提取蛋白

①取生长状态良好的FRT细胞500万个，用胰酶消化，待消化好后把细胞转移至1.5mL离心管中2000rpm离心5分钟，弃上清，细胞沉淀再用PBS清洗一遍后同样条件离心，弃上清。

②向细胞中加入RIPA裂解液100μL并充分混匀置于4℃层析柜中，放置10分钟。之后，将裂解好的细胞放入4℃预冷离心机中12000rpm离心15分钟，保留上清，即为提取的总蛋白液。

③采用BCA定量试剂盒对提取的蛋白质进行定量。首先将牛血清白蛋白(BSA)进行梯度稀释成终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1和2mg/mL来制备蛋白标准曲线。为保证待测蛋白浓度测定值位于标准蛋白曲线范围内，将待测蛋白溶液稀释5倍；取一个96孔板将标准蛋白和待测定蛋白加入孔中，每个孔上样10μL。随后向每个孔中加入BCA工作液200μL(工作液：试剂A与试剂B按50:1比例混合而成)，然后放置到水平摇床上37℃恒温孵育30分钟。

④孵育结束后，用酶标仪在562nm处读出吸光度并绘制标准曲线，算出蛋白浓度，然后待测蛋白溶液中加入适量5×loading buffer，并置于金属浴中100℃煮样5分钟，加热后的样品可以直接用于SDS-PAGE电泳。

(2)SDS-PAGE电泳

①配胶：配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶；根据待检测蛋白分子量大小选择分离胶所含丙烯酰胺浓度8％-15％(w/v)不等，浓缩胶一般都为5％(w/v)丙烯酰胺浓度。按照下表的配方配置胶，先配制分离胶，待分离胶凝固之后再加入浓缩胶并插入梳子，待浓缩胶完全凝固后拔掉梳子，胶的制备完成。

②电泳：将煮好的适量的蛋白样品加入孔中，电泳条件：浓缩胶阶段恒压80V运行30分钟，分离胶阶段恒压120V运行60分钟。

③转膜：将胶取出并弃掉浓缩胶部分，将分离胶和PVDF膜之间叠在一起固定好(上面是PVDF膜下面是分离胶，转膜前先将孔径大小是0.22μm PVDF膜用甲醇活化1分钟)，进行转膜，转膜条件为恒流250mA运行90分钟。

④封闭：待转膜结束后把PVDF膜取出放入含有5％(w/v)脱脂奶粉封闭液中进行室温封闭1小时。

⑤孵育一抗与二抗：封闭好的膜加入含P2ry2的兔多克隆一抗[比例一般为1:100(v/v)配制]的5％(w/v)脱脂奶粉溶液并转移至摇床上轻轻振摇4℃孵育过夜。第二天取出膜，加入5mL TBST在摇床上洗3遍，每遍5分钟。之后用羊抗兔二抗[比例一般为1：200(v/v)配制]的TBST避光孵育1小时，之后再用TBST避光洗膜3次，每次5分钟。

⑥显影：将结合了一抗与二抗的膜放到免疫印迹成像系统中进行扫描成像，最后得到相应的蛋白条带。

实施例4 ANO1和YFP-H148Q/I152L真核表达载体的构建

提前16h左右消化FRT细胞，使细胞密度在转染时可达到70％～80％，按照Lipofectamine 3000说明书，将ANO1转染到FRT细胞中，48h后倒置荧光显微镜观察细胞膜上可见绿色荧光，Zeocin抗生素筛选，2周后划掉阴性细胞并挑选合适的单细胞克隆团，在96孔细胞培养板中扩大培养，经两次有限稀释后获得阳性克隆细胞株，连续2次传代观察细胞膜上全部表达绿色荧光为稳定表达ANO1的阳性细胞株，进行扩大培养。将YFP-H148Q/I152转染已表达ANO1的FRT细胞中，倒置荧光显微镜下观察胞浆可见绿色荧光信号，G418抗生素筛选，具体步骤同上，获得ANO1和YFP-H148Q/I152L共表达的FRT细胞株。

实施例5荧光淬灭动力学试验验证成功构建细胞模型

将构建好的细胞模型铺于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100μL完全培养液(含20％胎牛血清的F-12Ham培养液)，培养2～3d后，用酶标仪进行检测。设置一组对照组和两组实验组，每组设计3个复孔。对照组用100μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50μL的不加钙镁PBS，泵内加入碘离子PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组1用100μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50μL的ANO1激动剂Eact(100μmol/L)，泵内加入碘化钠PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组2用100μL不加钙镁PBS洗3次，每孔加入50μL的ANO1拮抗剂NFA(300μmol/L)，孵育10min，吸出NFA，加入50μL的Eact(100μmol/L)，泵内加入碘化钠PBS缓冲液，记录荧光淬灭情况。具体设置如下：激发光波长500nm，发射光波长540nm。以每秒5个点的速度动态检测相对荧光强度，其中前2s为基线，2s后以280μL/s的速度向目的孔中注入120μL碘离子PBS缓冲液。

实施例6荧光淬灭动力学试验验证细胞模型可筛选P2ry2调节剂

将构建好的细胞模型铺于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100μL完全培养液(含20％胎牛血清的F-12Ham培养液)，培养2～3d后，用酶标仪进行检测。设置一组对照组和两组实验组，每组设计3个复孔。对照组用100μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50μL的不加钙镁PBS，泵内加入碘离子PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组1用100μL不加钙镁PBS清洗3次，每孔加入50μL的P2ry2激动剂ATP(300μmol/L)，泵内加入碘化钠PBS缓冲液，观察荧光淬灭程度；实验组2用100μL不加钙镁PBS洗3次，每孔加入50μL的P2ry2拮抗剂suramin(1000μmol/L)，孵育10min，吸出suramin，加入50μL的ATP(300μmol/L)，泵内加入碘化钠PBS缓冲液，记录荧光淬灭情况。具体设置同实施例5。

实施例7 Fura-2/AM荧光探针法检测细胞内钙离子浓度的变化

当细胞融合至适宜密度时(本研究选取96孔板检测，因此每孔只要细胞总数超过2万个即可)，用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液消化细胞(例如六孔板，需要200μl胰酶，即含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液，消化15min)，然后用DMEM液终止消化并制成细胞悬液，离心收集细胞。取细胞悬液37℃预温5min，加入终浓度为5μmol/L的Fura-2/AM，37℃恒温避光孵育负载40min，离心并弃上清液，用PBS清洗3次，最后PBS重悬细胞，使用Fluostar多功能酶标仪检测ATP引起的细胞内钙离子浓度的变化，细胞内钙离子浓度以340nm荧光强度与380nm荧光强度(F340/F380)的比值来计算。

实施例8细胞模型高通量筛选的评估

首先将一个黑壁透明96孔板的6列加入300μmol/L的ATP作为阳性对照，同时另外6列加入碘化钠PBS缓冲液作为阴性对照，检测96孔的Z'因子值。

荧光淬灭动力学试验动态检测相对荧光强度，并计算相对荧光强度变化值/slope值/斜率值。

具体操作步骤参照实施例6，计算公式如下：

Z'因子只与实验的重现性与可靠性有关而与实验内容无关，因此是评估高通量筛选的一种重要指标。Z'值可根据以下公式计算：Z'＝1-3×(SDsig+SDback)/(Msig-Mback)，该公式中SD代表信号(sig)或背景(back)的标准差(SD)，M代表信号(sig)或背景(back)的平均值(mean)。一般Z'因子值在0.5～1时，说明高通量筛选模型稳定性高。

效果例1

1 FRT细胞内源性表达P2ry2

RT-PCR结果显示，P2ry2和β-actin分别在365bp和260bp处出现特异性条带，P2ry1、P2ry4、P2ry6、P2ry11～14均未扩增出特异性条带，见图1。证明FRT细胞在mRNA水平上表达P2ry2。将PCR的产物切胶回收送到上海生工公司进行测序，测序结果在Chromas软件上进行分析，并将所测核苷酸序列在NCBI-BLAST进行比对，与GenBank数据库收录的P2ry2的基因序列完全一致，见图2。证明所克隆DNA片段即为目的基因片段。

Westernblot结果分析显示：P2ry2和β-actin相对表达量分别为42kD和42kD，见图1。证明FRT细胞在蛋白水平上表达P2ry2。

2细胞模型构建原理及结果

当P2ry2与其激动剂结合后，通过信号通路使细胞内的滑面内质网释放Ca

FRT细胞膜上可见绿色荧光，结果显示ANO1表达在细胞膜上；FRT细胞胞浆内和膜上均可见绿色荧光证明YFP-H148Q/I152L表达在胞浆中，见图3。

3细胞模型有效性鉴定结果

荧光淬灭动力学试验结果显示，对照组只加入碘化钠PBS缓冲液，相对荧光强度无显著变化，说明ANO1未开放；实验组1加入激动剂Eact后，相对荧光强度显著下降，说明ANO1开放；实验组2加入拮抗剂NFA孵育10min后，再加入激动剂Eact，相对荧光强度无明显变化，说明ANO1未开放。对照组与实验组1的差异有统计学显著性(P<0.01)，对照组与实验组2的差异无统计学显著性(P>0.01)，见图4。证明成功构建ANO1-YFP-H148Q/I152L细胞模型。

表4图4(左)数据

表5图4(右)数据

4荧光淬灭动力学试验验证细胞模型可筛选P2ry2调节剂

荧光淬灭动力学试验结果显示，对照组只加入碘化钠PBS缓冲液，相对荧光强度无显著变化，说明ANO1未开放；实验组1加入ATP后相对荧光强度显著下降，说明ANO1开放；实验组2加入拮抗剂suramin孵育10min后，再加入激动剂ATP，相对荧光强度无明显变化，说明ANO1未开放。对照组与实验组1的差异有统计学显著性(P<0.01)；对照组与实验组2的差异无统计学显著性(P>0.01)，见图5。证明所构建细胞模型可筛选P2ry2调节剂。

表6图5(左)数据

表7图5(右)数据

5 Fura-2/AM荧光探针法检测结果

加入不同浓度ATP后，结果表示ATP浓度越高，slope值越高，即荧光斜率值与ATP浓度呈剂量依赖关系；加入ATP后，细胞内Ca

表8图6A数据

表9图6B数据

表10图6C数据

6不同P2ry2调节剂与相对荧光强度的剂量关系

加入不同的激动剂后，检测到不同的荧光信号，激动剂浓度越高，相对荧光强度越大。结果表明激动剂浓度对与相对荧光强度呈剂量依赖关系，其EC50分别为11.2μM、26.5μM、188.7μM，见图7。加入含有激活剂的碘离子PBS缓冲液后，抑制剂浓度越高，相对荧光强度越小，即抑制剂浓度越大抑制作用越强，其IC50分别为35.12μM和135.6μM，见图7。证明拮抗剂浓度与相对荧光强度呈剂量依赖关系。

表11图7A数据

表12图7B数据

7Z'因子评估

通过对96孔数据分析和计算，SDsig＝7，SDback＝1，Msig＝100，Mback＝5，Z'＝0.75，信噪比为17.48:1，从Z'值和信噪比来看，模型可用于高通量筛选，且敏感性高，见图8。

表13图8B数据

效果例2荧光探针法和基于CaCC检测细胞内钙浓度的检测方法(下面简称为CaCC法)比较

表14

备注：1234比较结果显示CaCC法优于荧光探针法。

详细说明如下：价格：invitrogen公司的检测细胞内钙浓度的荧光探针(Fluo4)市场价格为4196.00人民币。

CaCC法灵敏度高于荧光探针法的原因：

(1)细胞内Ca

(2)CaCC法是通过YFP双突变体的相对荧光信号的变化间接反映细胞内Ca

如图9所示，结果表明：在细胞内Ca

综上所述，CaCC灵敏度高于荧光探针法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林医药学院

<120> FRT细胞株及其在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试剂盒中的应用

<130> MP2020507

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgtcgaca acggctcc 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtctcaaa catgatctgg gt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagatgacgg ggacctaaag ag 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgttccag ttcttcactc g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcgtggcaa tctggatgtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaacatggc cacagtcgtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcactggcct ttgcaagttt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accacagcaa tggtacggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcgtttggc tggttgtgac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctgtcttg gtgatgtgga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccagcaatc ttttgggtgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgttctcgg cattgcagtc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaaacaggcg acaaatgcga 20