一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和方法

技术领域

本发明属于兽医传染病检测技术领域，具体地，涉及一种蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)感染引起的蓝舌病(Bluetongue，BT)是一种严重侵害反刍动物的烈性出血性虫媒病毒病。BT的暴发可给牛羊养殖业带来巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(Office international des epizooties,OIE)列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。BTV主要通过库蠓(Culicoides spp.)的叮咬传播，可感染大多数家养和野生反刍动物。牛和山羊感染BTV后，往往呈隐性感染，成为病毒重要的储存宿主与传染源。BTV感染绵羊可引起明显的BT临床症状，主要表现为高热、消瘦、口唇充血肿胀及糜烂、鼻腔和胃肠黏膜出血溃疡、蹄冠脱落引起跛行等症状。BT疫情暴发时，感染绵羊的发病率可达80％，死亡率可高达40％，给牛羊养殖业带来毁灭性损失。

BTV隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，目前世界范围已发现27种血清型的BTV(BTV-1至BTV-27)。病毒的基因组大小约20kb，由10个节段(Seg-1～Seg-10)的双链RNA(Double stranded RNA，dsRNA)组成，可编码7种结构蛋白(VP1-VP7)与5种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a与NS4)。Seg-2编码的VP2蛋白是构成病毒外层衣壳的主要蛋白，可诱导感染动物产生特异性中和抗体，决定着BTV的血清型。Seg-2/VP2具有高度变异的特性，序列分析显示不同血清型BTV毒株的Seg-2核酸序列差异度在38.6％～59.5％之间，VP2蛋白氨基酸序列差异度在40.5％～70.9％之间；同一种血清型BTV毒株之间Seg-2/VP2的序列差异度也可达31.6％/27.4％，在系统发生树上可将同一种血清型BTV的Seg-2分为“Eastern”(东方)和“Western”(西方)两种地域型。

2012年以来，专利申请人在我国云南省、广东省、广西壮族自治区、江苏省、湖南省、山西省、新疆维吾尔族自治区与内蒙古自治区开展了全国范围的BTV流行病血调查研究，分离出12种血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21、-24型)的BTV共计300余株。对我国流行的不同血清型BTV毒株Seg-2基因序列分析表明，我国流行的BTV-1、-2、-3、-4、-9、-16与-21等七种血清型BTV的Seg-2与日本和澳大利流行毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度>94％，均属于Eastern型；而我国流行的BTV-5、-7与-24的Seg-2与南非毒株具有最近的亲缘关系，核酸序列相似度>92％，属于Western型。多种血清型BTV在我国的广泛流行，给我国BT的防控带来了严峻挑战。建立特异性强、灵敏度高、可进行高通量检测的BTV血清型检测技术，是开展我国BTV流行病学研究，进而制定BTV科学防控策略的前提。

血清中和试验是BTV血清型鉴定的传统方法，存在耗时、费力与实验成本高等方面的不足。常规RT-PCR是病毒核酸检测广泛使用的方法，具有简便快捷的优点，但是该方法灵敏度较差，主要适用于分离病毒的检测，难以有效对病原核酸含量低的临床样本进行检测。

发明内容

针对现有血清中和试验和常规RT-PCR等检测技术在BTV血清型检测中存在耗时长、成本高、检测通量小与灵敏度较低等缺陷，本发明的目的是提供针对中国流行的12种血清型BTV的实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测试剂盒及对应的方法，以实现对中国流行BTV毒株血清型的快速准确鉴定。该试剂盒具有操作简便、花费时间少、成本低廉、检测结果准确等优势，填补了国内尚无BTV血清型的RT-qPCR快速检测试剂盒的空白。为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

1.蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR试剂盒

本发明根据我国已发现的12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24型)毒株的基因节段2(Segment 2,Seg-2)序列特性，根据每种血清型Seg-2序列高度保守区域设计出12套BTV血清型特异性RT-qPCR引物及其相应的探针组合，引物及对应的探针序列如表1所示。

表1中国流行的12种血清型BTV特异性RT-qPCR鉴定引物及探针信息

进一步，优选的是，所述试剂盒中特异性检测12种血清型BTV毒株Seg-2基因扩增片段的探针，5'端标记荧光发生基团(报告基团)的6-羧基荧光素报告荧光基团(6-carboxy-fluorescein,FAM)，3'端标记荧光淬灭(抑制基团)的黑洞淬灭基团1(black holequencher 1,BHQ1)。

本发明还提供了含有所述引物和探针的用于检测中国流行BTV毒株血清型的RT-qPCR试剂盒。

进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒检测的样品为细胞培养物或动物血液中的BTV核酸。

进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒还包括RT-qPCR缓冲液、50×ROXReference DyeⅡ、dNTPs、RNA酶抑制剂、逆转录酶和DNA聚合酶的一种或多种。

进一步，优选的是，所述BTV血清型RT-qPCR检测试剂盒，还包括标准阳性对照样品、标准阴性对照样品、无RNA酶的去离子水。

进一步，优选的是，所述标准阳性对照样品为确定核酸拷贝数的12种血清型(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24型)BTV毒株的核酸样本，所述12种血清型BTV毒株的核酸样本的核酸拷贝数如表2所示。

表2 12种血清型BTV毒株的核酸样本的核酸拷贝数

进一步，优选的是，在一些实施方案中所述标准阴性对照为提取的正常培养的BHK-21细胞总RNA。

进一步，优选的是，在一些实施方案中所述标准阴性对照为未被BTV感染的新生犊牛血液RNA。

用于所述BTV血清型RT-qPCR试剂盒的反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL；5U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL；PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL；50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL；10μmol/L上游引物0.4μL；10μmol/L下游引物0.4μL；10μmol/LTaqMan探针0.8μL；核酸模板4.0μL；补充RNase-free水至20.0μL；上游引物和下游引物组成的引物对为12种血清型BTV引物对中的任意一对；探针为12种血清型BTV的上下游引物对所对应的TaqMan探针。

进一步，优选的是，工作反应体系中，12种血清型BTV的上、下游引物浓度为5～15μmol/反应、TaqMan探针浓度为6～12μmol/反应均可完成反应。

用于所述RT-qPCR试剂盒的反应程序为：42℃逆转录5min，1个循环；95℃预变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，40个循环，在每个循环结束时收集荧光信号。

2.蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR检测方法

本发明进一步提供使用所述RT-qPCR试剂盒进行12种BTV血清型RT-qPCR检测的方法，具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)核酸准备：获取待检测BTV的核酸样本，95℃加热3min，立即冰浴冷却，进行核酸样本的热变性处理，进行双链RNA的解链；

(2)RT-qPCR反应：取变性处理的核酸样品，进行RT-qPCR反应，其中反应体系为：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL；5U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL；PrimeScript RTEnzyme MixⅡ0.4μL；50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL；10μmol/L上游引物0.4μL；10μmol/L下游引物0.4μL；10μmol/L TaqMan探针0.8μL；核酸模板4.0μL；补充RNase-free水至20.0μL；同时设置相应的阴性对照。反应条件为：42℃逆转录5min，1个循环；95℃预变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，40个循环，在每个循环结束时收集荧光信号。

(3)根据RT-qPCR反应产生的扩增曲线与Ct值对待检测BTV的血清型进行判定，当以某一BTV血清型引物和探针进行RT-qPCR反应，可产生扩增曲线，且Ct值小于38，则待检测BTV可判定为该血清型；当以某一BTV血清型引物和探针进行RT-qPCR反应，可产生扩增曲线，但Ct值在38至39之间，判断为该血清型可疑；当以某一BTV血清型引物和探针进行RT-qPCR反应，无扩增曲线，判定为无该血清型BTV核酸。

进一步地，当待检BTV阳性核酸判断为某BTV血清型可疑时(Ct值在38至39之间)，对可疑的BTV血清型重复进行3次RT-qPCR反应，进行BTV血清型的确认。若3次反应Ct值的平均值小于38，判定某血清型BTV核酸阳性；若3次反应Ct值的平均值仍在38至39之间，判定为阴性。

本发明的有益效果

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)具有高度的特异性

本发明根据中国流行的12种BTV血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24型)毒株Seg-2序列特征，设计血清型特异性扩增引物与TaqMan探针。试剂盒中任意一套引物及其探针仅与对应血清型BTV的核酸模板之间产生扩增曲线，对其它血清型BTV的检测结果均为阴性，表明本发明的试剂盒具有良好的特异性。

(2)具有高度的灵敏度

本发明试剂盒提供的RT-qPCR对不同血清型BTV核酸检测的灵敏度下限在25拷贝/μL至48拷贝/μL间(实施例2，表6)，表明本试剂盒提供的BTV血清型鉴定方法具有较高的检测灵敏度，适宜检测病毒载量较低的临床血液样本。

(3)与传统血清中和试验及常规RT-PCR相比较

本发明提供的BTV血清型RT-qPCR检测试剂盒与血清中和试验、RT-PCR技术相比具有明显优势，体现在以下几方面：

表3本发明试剂盒与血清中和试验及常规RT-PCR的比对结果

(4)具有良好的实际应用效果

本发明对中国分离的12种血清型BTV毒株核酸共计163份进行血清型鉴定(实施例3)，结果显示，本发明提供的BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法可准确鉴定出各BTV毒株的血清型，表明本发明建立的BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法具有良好的检测范围覆盖度，可准确检测中国不同时间、不同地域分离的BTV毒株的血清型(表7)。

以本发明开发的BTV血清型特异性RT-qPCR试剂盒，对2013至2020年采集的12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24)感染哨兵动物的EDTA抗凝血液样品共计194份进行检测(实施例4)，鉴定结果与从血液中分离出的病毒毒株血清型一致，表明本发明建立的BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法对于临床血液样品具有良好的检测效果(表8)。

附图说明

图1显示了分别以12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24)代表毒株的核酸作为模板，进行BTV血清型特异性RT-qPCR的扩增曲线。

图2为12种BTV血清型RT-qPCR扩增产物电泳。

M：DNA分子质量标准DL 500；1-12：分别为BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24血清型RT-qPCR扩增产物。

图3为以9.62×10

图4为以1.28×10

图5以3.46×10

图6以4.54×10

图7以7.85×10

图8以2.66×10

图9以8.45×10

图10以6.82×10

图11以1.43×10

图12以2.54×10

图13以7.14×10

图14以8.45×10

图15示出了BTV血清型RT-qPCR对中国不同地域、不同时间分离的12种BTV血清型毒株(共计163株)的血清型RT-qPCR检测结果。图中一个黑点“●”表示每份病毒样品RT-qPCR检测结果的Ct值。数值“n”代表检测的各血清型毒株数量。图中对每种血清型毒株的检测结果的Ct值进行了统计，以Ct值的平均值±标准差进行表示。

图16示出了BTV血清型RT-qPCR对BTV核酸阳性血液的血清型RT-qPCR验证结果。图中一个黑点“●”表示每份血液样品RT-qPCR检测结果的Ct值。数值“n”代表检测的各血清型BTV血液样品数量。图中对每种血清型BTV血液样品的检测结果的Ct值进行了统计，以Ct值的平均值±标准差进行表示。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1蓝舌病病毒血清型鉴定的RT-qPCR试剂盒

1.材料

中国流行的12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-2与BTV-24)代表毒株由申请人分离并保存，毒株信息见表4；BTV-6、-8、-10、-11、-13、-14、-17、-18、-19、-10、-22、-23等12种BTV血清型国际标准参考毒源自OIE南非参考实验室(Onderstepoort Veterinary Institute)；重组质粒pLB-BTV-NS3-T7由申请人制备保存(杨振兴,等.蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2019,49(09):1104-1111)。

表4中国流行的12种BTV血清型代表毒株病毒分离信息

2.主要试剂与仪器

本实施例及以下实施例用到的病毒RNA抽提试剂盒MagMAX-96Viral RNAIsolation Kit购自Thermo公司；病毒RNA/DNA提取试剂盒、RNAiso Plus总RNA提取试剂盒、RT-qPCR试剂盒One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Real Time)、qPCR试剂盒Premix ExTaq Kit(Probe qPCR)、RNase Inhibitor、逆转录酶PrimeScript II ReverseTranscriptase购自大连宝生物公司，核酸自动提取仪KingFisher Flex与实时荧光定量PCR仪Fast 7500购自美国Applied Biosystem公司。

3.病毒核酸准备

(1)核酸提取：取200μL病毒液，使用病毒RNA/DNA提取试剂盒按说明书提取病毒核酸，将提取的核酸于94℃变性3min，立即冰浴5min，保存于-80℃备用。

(2)反转录合成cDNA：取5μL变性后的BTV病毒核酸为模板，使用随机引物(Radom6mers)和PrimeScript II逆转录酶合成病毒cDNA，反应体系为：5×PrimeScript IIBuffer 4μL，dNTP(10mM)1μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，Radom 6mers(50μM)1μL，PrimeScript II RTase(200U/μL)1μL，补水至20μL；反应条件为：30℃10min，45℃30min，72℃10min。合成的cDNA保存于-80℃备用。

4.病毒核酸定量

将pLB-BTV-NS3-T7质粒进行10倍梯度稀释，选择1.3×10

表2 12种血清型BTV毒株的核酸样本的核酸拷贝数

已确定核酸拷贝数的12种BTV血清型代表毒株核酸样本可以作为标准阳性对照样本，并可成为试剂盒的一部分。

5.引物和探针的设计及筛选

(1)引物和探针的设计

根据申请人前期获取的中国流行12种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24)毒株的Seg-2序列(共计72条)进行序列比对，选择在同一血清型内高度保守，在不同血清型间高度变异的Seg-2区域，使用Beacon Designer 8.0软件设计12组针对各BTV血清型的特异性扩增引物与TaqMan探针，各组BTV血清型特异性引物及探针组合序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.36所示的核苷酸序列(如表1)。各组BTV血清型RT-qPCR特异性引物扩增的靶序列如下：

BTV-1血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.37)：

GGTTATGATGGGAAACGAGCGGTGATAGACAGCTCAAAACATAAAACTTTTCACACGGATGAGCGATGGGTACAGTGGATGATGAAAGACTCGATGGATGCGCAGCCTCTGAAGGTTGGATTAGATGATCGAACGCAAAAGATAGCACACTCTTTACATAATTGTGTAGTAAAAA

BTV-2血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.38)：

TAATACATTGGGAGTACCAGTTGTATAAGAGTGAATGGAAGGTTACCCTTGAGCGAGGAAACGCTTGTGACTTGTACCCAGACAGCGATGAGGACGTGATAGTTACAAAATTTGATGAGGCAAAGTATACGGAGA

BTV-3血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.39)：

ATTTACCGATTACACACCCCGTTAAATGTTTGGTTGCTTTTGAGGTTTCAGACGCGCTGATAGATCCAGAAGTAC

BTV-4血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.40)：

GTGCCGAGATTATTGGATATAACATTAAAGGCTTATGATGATAGGAAGAAATCGAATGGTGCTCGTGGAGTTGATTTTTTGACTAATGCGAAGTGGATGAAGTGGGCGATTG

BTV-5血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.41)：

ACTAGTGAGCCGTTCCAGCCTGGAAATCCAAGGATTGGAAGTCTGGGGAGAAGGGCGAGGGTTGACATGGCTGATCCTGGGTATCCGCTTTTCCGCGCAGGGTTACTTCAA

BTV-7血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.42)：

AATATGTTTCCGTGCTTACGAGGTGCTTTAATTGCGAGCGAAACTCAATTCGGCGATGTATATAAAATGCTAAGGGTGCGGTTCGAATGGAGTGTGCGGAATGAATATAGCCCTCAGGCCGACGTTGCGAGACAGAATGAGAATTABTV-9血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.43)：

GTACTCACGTCGCATATGGAGGTCGAATCCATATCCCTGTTTGCGGGGCACGTTGATTGCGGCGGAATGTGTCTTAGGTGACCCGTATAGAACTTTGCGACGGAAATTTAATTGGAGTGTACGCCATTCG

BTV-12血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.44)：

GTTGGCGTATATGGTGGAGTAATCCGTACCCCTGCTTACGAGGAACGATCATTGCGTGTGAG

BTV-15血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.45)：

TTTAGTTCCGACAGAGAGAGGGCCGCGAGTTATCCCAGCGATGGTTGGGAGGGAGCTAGCTGATGGGAGTCTGGGAGATTGGCACGCT

BTV-16血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.46)：

GAGGGAACTTCGAGCGAACACACATTAAATCTCTTGAAATATGTAAGTTATTATCCAGCATTGGAAGAAAGATGGTTAATATGGAGGAGGAACCAAAGGATGAAAGAGACCTATCAGTTAAATTCCAATTTAAACTCGACGACAAATTTTCAACAACCGATCCGGAAAGAAACGTCATCTTTACACATAAAACACACCGTACGAATCAAGATCGTTTCTATGTGTTGCTAATGATTGCGGCGTCGGACACAAATAACGG

BTV-21血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.47)：

ATATTCACATCGAAAGGCCAAAGGAATGACCAACAGCGGTTTTTCGTATTGATTATGATTGCAGCGTCAGATACTTACAACAGTCGCATTTGGTGGACGAATCCGTACCCATGTTTACGCGGCGCTTTAATCGCTTCTGAAACTTCACTTGGAGATGTGTACTGGACAT

BTV-24血清型特异性RT-qPCR引物扩增的Seg-2靶序列如下(SEQ ID No.48)：

TACCGCTTCTTTTCCTTATCCAAGATAACATATCATATTGGCATAGACAGTGGTCTGTCCCAGTGATACTTTATGGCGATATCATTAGGTTAATCCCGGTTGAAGTTGGAGCTTATGCGAAC

6.RT-qPCR反应体系的建立

将提取的12种BTV血清型毒株核酸作为模板，使用对应血清型的引物和探针组合，参照One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Real Time)试剂盒说明书，采用20μL体系进行RT-qPCR，反应体系如下：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL，5U/μL TaKaRa Ex Taq HS0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，50×Rox Reference DyeⅡ0.4μL，上下游引物各0.4μL，探针0.8μL和变性模板RNA 2μL，ddH

结果显示各血清型引物和探针组合，以对应血清型BTV核酸为模板，可产生特异性扩增曲线(图1)，PCR产物电泳条带大小与预期大小相符(图2)，Ct值在18.3(BTV-12)至23.4(BTV-1)之间(表5)。表明我们建立了BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法。

表5以12种BTV血清型毒株核酸为模板进行BTV血清型RT-qPCR的Ct值

实施例2 RT-qPCR检测方法灵敏性试验和标准曲线绘制

分别取实施例1中制备的确定核酸拷贝数的12种血清型BTV(BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21与BTV-24)代表毒株cDNA为标准品，10倍梯度稀释至拷贝数为10

检测结果显示，各稀释度核酸模板的扩增曲线呈等距分布(参见图3A～图14A)，模板核酸拷贝数与Ct值之间具有良好的线性关系(参见图3B～图14B)，不同BTV血清型qPCR反应的扩增效率(E)值在90.32％(BTV-1型qPCR)至106.99％(BTV-4型qPCR)之间，相关系数(R

表6 BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法的标准曲线和灵敏度分析结果

实施例3 RT-qPCR检测试剂盒对BTV分离毒株的血清型定型

1.病毒

申请人自1979至2020年分离的12种血清型BTV毒株共计163株，病毒信息见表7，病毒的血清型通过RT-PCR与测序确认。

2.核酸准备

取50μL BTV病毒液，按RNA抽提试剂盒“MagMAX-96Viral RNA Isolation Kit”说明书，使用核酸自动提取仪“King Fisher Flex”提取核酸。将提取的核酸于94℃变性3min，立即冰浴5min，保存于-80℃备用；同步提取正常BHK-21细胞培养液作为阴性对照。

3.样品检测

取经过变性处理的病毒核酸为模板，按照实施例1中的方法进行RT-qPCR检测，对病毒血清型进行鉴定，验证本发明提供的BTV血清型特异性RT-qPCR试剂盒是否可有效检测出中国分离BTV毒株的血清型。

4.检测结果

结果显示，检测的163个BTV毒株分别属于BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21和BTV-24等12种血清型，与通过中和试验确定的病毒血清型一致；不同血清型毒株的Ct值在16.7±3.1(BTV-24)至20.2±5.0(BTV-7)之间(表7)(参见图15)，表明本发明建立的BTV血清型特异性RT-qPCR检测方法可准确检测中国不同时间、不同地域分离的BTV毒株的血清型。

表7 163株12种血清型BTV毒株的分离信息与RT-qPCR验证结果

注：每种血清型BTV的RT-qPCR检测结果以Ct值的平均值±标准差表示。

实施例4使用BTV核酸阳性血液验证RT-qPCR试剂盒的检测效果

1.临床样品

194份BTV核酸阳性EDTA抗凝血液样品，于2013至2020年采集至12种血清型BTV感染的哨兵动物(保存于恒温4℃冷库)，对动物感染BTV的确认包括：(1)从该动物采集的血液中分离出特定血清型的BTV毒株；(2)动物血液的BTV核酸与抗体检测结果均为阳性，血液样品信息见表8；未被BTV感染的新生犊牛EDTA抗凝血液样品采集至云南-景洪某牛场。

表8 BTV感染动物血液样品BTV血清型RT-qPCR检测结果

注：“a”括号中的数字表示采集血液样品的哨兵牛或羊的数量；

“b”荧光定量检测Ct值<38判定为BTV核酸阳性；

“c”荧光定量检测结果Ct值范围，以“Ct值平均值±标准差”表示。

2.核酸准备

取50μL EDTA抗凝血液样本，按RNA抽提试剂盒“MagMAX-96Viral RNA IsolationKit”说明书，使用核酸自动提取仪“King Fisher Flex”提取核酸。将提取的核酸于94℃变性3min，立即冰浴5min，保存于-80℃备用；同步提取未被BTV感染的新生犊牛血液样品作为阴性对照。

3.样品检测

取经过变性处理的血液核酸5μL为模板，按照实施例1中的方法进行BTV血清型的RT-qPCR检测，以BTV血清型RT-qPCR反应产生扩增曲线，且Ct值＜38判定为阳性结果。

4.检测结果

结果显示，对BTV核酸阳性的血液样品，本发明提供的BTV血清型RT-qPCR试剂盒可准确检测出动物感染BTV的血清型，检测结果与从动物上分离BTV毒株的血清型鉴定结果一致，不同血清型BTV核酸样本RT-qPCR检测结果的Ct值范围在31.4±2.0至34.6±2.0之间(表8，图16)。

实施例5 BTV血清型检测试剂盒的检测应用

1.检测样品

(1)2019年采集自云南省师宗县五龙乡(经纬度：E104°29'65”,N24°60'98”,海拔1000m)牛羊圈舍的库蠓共计500只。

(2)2019年采集自云南省景洪市牛羊养殖场的牛羊EDTA抗凝血液样品40份。

2.核酸准备

2.1库蠓核酸样品准备

将采集的所有库蠓合并为一份样品，转入15mL离心管中，加入10mL无菌PBS漂洗1次，1000rpm离心5分钟，收集库蠓虫体，吸弃PBS，加入3mL RNAiso Plus重悬虫体后转入研钵中充分研磨，按照总RNA提取试剂盒“RNAiso Plus”说明书提取核酸；取20μL提取的核酸，使用随机引物(Radom 6mers)和PrimeScript II逆转录酶合成病毒cDNA，反应体系为：5×PrimeScript II Buffer 8μL，dNTP(10mM)2μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，Radom6mers(50μM)2μL，PrimeScript II RTase(200U/μL)2μL，补水至40μL；反应条件为：30℃10min，45℃30min，72℃10min。合成的cDNA保存于-80℃备用。

2.2血液核酸样品准备

取50μL EDTA抗凝血液样本，按RNA抽提试剂盒“MagMAX-96Viral RNA IsolationKit”说明书，使用核酸自动提取仪“King Fisher Flex”提取核酸。将提取的核酸于94℃变性3min，立即冰浴5min，保存于-80℃备用。

3.样品检测

3.1库蠓样品检测

取合成的库蠓样品cDNA 2μL为模板，按照实施例1中的方法进行12种BTV血清型的qPCR检测。以BTV血清型qPCR反应产生扩增曲线，且Ct值＜38判定为阳性结果。

3.2血液样品检测

(1)以变性处理的5μL血液核酸为模板，按照已经发表的文章(2019年，中国兽医科学，第9期，蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用)进行BTV核酸的群特异性RT-qPCR检测，筛选出BTV阳性核酸样品(Ct值＜38)。

(2)取BTV阳性核酸样本各10μL进行混合，使用异丙醇进行沉淀，以适量无RNA酶水进行溶解，反转录合成cDNA，按照实施例1中的方法进行12种BTV血清型的qPCR检测。

(3)根据BTV血清型检测结果，取每一份BTV阳性核酸5μL为模板，按照实施例1中的方法进行对应血清型BTV的RT-qPCR鉴定，确认每份BTV阳性核酸样本的血清型。以BTV血清型RT-qPCR反应产生扩增曲线，且Ct值＜38判定为阳性结果。分析本发明提供的BTV血清型荧光定量检测试剂盒能否可有效检测动物临床血液样品中的BTV血清型。

4.检测结果

结果显示，采集的库蠓样品中携带BTV-1(Ct值：33.5)、BTV-4(Ct值：32.7)、BTV-5(Ct值：30.8)、BTV-16(Ct值：31.3)与BTV-24(Ct值：34.2)等5种血清型BTV。采集的40份牛羊血液样品中有12份样品为BTV核酸阳性，Ct值在31.4至35.7之间，其中5份核酸为BTV-1型，3份核酸为BTV-2型，4份核酸为BTV-4型。在2份BTV-1核酸阳性样品中同时检测到BTV-4型核酸。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种蓝舌病病毒血清型鉴定的qRT-PCR试剂盒和方法

<130> JIA-2020-1-W-022

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttatgatg ggaarcgagc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtatccgctt tctttgartc aatt 24

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctttcatca tccaytgtac ccatcgctc 29

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taatacattg ggagtaccag ttg 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catytattat ctccccracc at 22

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<212> DNA

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ctatcacgtc ctcatcgctr tctg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atttaccgat tacrcacccc gt 22

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcgtctgaa acctcraaag caaccaaac 29

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<212> DNA

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gtgccgagat tattggatat aac 23

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<212> DNA

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ggttgtatat ccatycgatc gtc 23

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<212> DNA

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tcgcccactt catccacttc gcatta 26

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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actagtgagc cgttccagcc 20

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<212> DNA

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ttgaagtaay cctgcgcgga a 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atacccagga tcagccatgt caaccct 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatatgtttc cgtgcttacg ag 22

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tgcgagcgaa actcaattcg gcgat 25

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gtactcacgt cgyatatgga g 21

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tccgcygcaa tcaacgtgcc ccg 23

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tttagttccr acagagagag g 21

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caatctccca ractcccatc a 21

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agctccctcc caaccatcgc tgg 23

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gagggaactt cgagcgaaca 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccgttatttg tgtccgacgc 20

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caacaaccga tccggaaaga aacg 24

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atattcacrt craaaggcca aag 23

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 37

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gagcgatggg tacagtggat gatgaaagac tcgatggatg cgcagcctct gaaggttgga 120

ttagatgatc gaacgcaaaa gatagcacac tctttacata attgtgtagt aaaaa 175

<210> 38

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

taatacattg ggagtaccag ttgtataaga gtgaatggaa ggttaccctt gagcgaggaa 60

acgcttgtga cttgtaccca gacagcgatg aggacgtgat agttacaaaa tttgatgagg 120

caaagtatac ggaga 135

<210> 39

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atttaccgat tacacacccc gttaaatgtt tggttgcttt tgaggtttca gacgcgctga 60

tagatccaga agtac 75

<210> 40

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

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gctcgtggag ttgatttttt gactaatgcg aagtggatga agtgggcgat tg 112

<210> 41

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<212> DNA

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<400> 41

actagtgagc cgttccagcc tggaaatcca aggattggaa gtctggggag aagggcgagg 60

gttgacatgg ctgatcctgg gtatccgctt ttccgcgcag ggttacttca a 111

<210> 42

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aatatgtttc cgtgcttacg aggtgcttta attgcgagcg aaactcaatt cggcgatgta 60

tataaaatgc taagggtgcg gttcgaatgg agtgtgcgga atgaatatag ccctcaggcc 120

gacgttgcga gacagaatga gaatta 146

<210> 43

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<400> 46

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ttggaagaaa gatggttaat atggaggagg aaccaaagga tgaaagagac ctatcagtta 120

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