包含甘草甜素的组合物及其美容和制药用途

发明领域

本发明涉及一种包含甘草甜素(glycyrrhizin)、透明质酸和增粘剂的组合物。因为根据本发明的组合物显著改善了甘草甜素的生物利用度，该组合物因此在使用甘草甜素的所有那些美容和治疗适应症(cosmetic and therapeutic indication)中具有有利的应用。

背景技术

甘草甜素(或甘草酸(glycyrrhizic acid或glycyrrhizinic acid))是构成甘草提取物的活性成分的三萜皂苷糖苷：

甘草甜素也可以盐的形式获得，诸如甘草酸二钾(dipotassium glycyrrhizate或dipotassium glycyrrhizinate)和甘草酸(单)铵((mono)ammonium glycyrrhizate或(mono)ammonium glycyrrhizinate)或GA)。虽然在酸性形式，它不是特别溶于水，但是，钾盐却是水溶性的：

而(单)铵盐可溶于稀的酸性或碱性溶液：

当甘草甜素水解时，所得的苷元是18β-甘草次酸(glycyrrhetinic acid或glycyrrhetic acid)，也称为enoxolone：

在食品领域，甘草甜素被用作甜味剂，因为它比蔗糖甜高达50倍，而且与后者相比，虽然甜味在口中被较晚感知到，但持续得更长。

在药理学领域，该化合物用作祛痰剂且在消化性溃疡的情况下用作胃保护剂。

此外，甘草甜素具有抗炎和消炎作用；事实上，已经强调甘草次酸抑制11β羟基类固醇脱氢酶将皮质醇转化为可的松，并抑制炎性细胞因子诸如TNF-α和IL-1β的产生。(Xiaoying Huang等人Anti-Inflammatory Effects of Monoammonium Glycyrrhizinateon Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice through RegulatingNuclear Factor-Kappa B Signaling Pathway.EvidBasedComplementAlternatMed.2015；2015:272474。)

最近，已经鉴定出另外的机制，该另外的机制负责该药物的消炎作用，即甘草甜素抑制中性粒细胞产生自由基的能力，自由基是一类强有力的致炎因子(inflammatoryagent)。然而，该分子似乎不能显著影响这些细胞的吞噬作用和趋化性。

令人感兴趣的是，注意到在痤疮和酒渣鼻的情况中，白细胞产生的自由基是毛囊上皮损伤的主要原因之一。

此外，该化合物在临床上用于治疗慢性肝炎和变态反应性紊乱。甘草甜素注射剂被施用至患有慢性丙型肝炎的患者，并且其长期使用有效预防肝细胞癌的发展。然而，反复的令人痛苦的腔内注射降低了患有慢性肝炎的患者的生活质量。注射疗法还涉及医护工作人员感染的风险。因此，已采用口服施用，但已证明甘草甜素的生物利用度是极低的。

文献提供了对改善甘草甜素的生物利用度的多种尝试的描述；例如Sasaki等人(Improvement in the bioavailability of poorly absorbed glycyrrhizin viavarious non-vascular administration routes in rats,Int J Pharm.2003Oct20；265(1-2):95-102)比较了施用甘草甜素的多种途径，得出结论：鼻途径和直肠途径优于口服途径，特别是在脂肪酸盐诸如局部渗透促进剂的存在下。

然而，这些施用途径对患者而言有某种程度不适，并且如果局部治疗是必要的(无论是内用还是外用)，这些施用途径在任何情况下都不合适。

因此，根据本发明的目的是提高甘草甜素的生物利用度，特别是提高甘草甜素在通过外用局部途径施用时的生物利用度。

发明概述

所述目的已通过如权利要求1所述的组合物实现，所述组合物包含甘草甜素、透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，和选自以下的增粘剂：罗望子种子多糖、PVP、羧乙烯基聚合物(carboxyvinyl polymer)、黄原胶、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶、聚丙烯酸酯，及其混合物。

为了本发明的目的，术语“甘草甜素”意指包括甘草酸、其盐，优选钾盐和铵盐，其水解形式，优选甘草次酸，及其混合物。

在另一方面，本发明涉及所述组合物在治疗眼部疾患(ocular affection)中的用途。

在另外的方面，本发明涉及包含所述组合物的眼科产品。

在另一方面，本发明涉及所述组合物在皮肤病症、妇科病症、耳鼻喉科病症或牙科病症的局部治疗中的用途。

在仍另外的方面，本发明涉及所述组合物的美容用途，特别是在用于外用局部使用的产品中作为舒缓剂(soothing agent)的美容用途。

附图简述

本发明的特征和优点将在以下通过非限制性实例的方式提供并且在随附的附图中图示的实施方案的详细描述中变得清楚，其中：

-图1示出了与处于未改变状态的GA的

-图2示出了在水中含有0.1％GA(a)和0.2％GA(b)的组合物的

-图3示出了在柠檬酸缓冲液中含有0.1％GA(a)和0.2％GA(b)的组合物的

发明详述

因此，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含甘草甜素、透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，和选自以下的增粘剂：罗望子种子多糖、PVP、羧乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶、聚丙烯酸酯，及其混合物。

优选地，基于组合物的重量，甘草甜素的浓度为最高5.0wt％。

更优选地，基于组合物的重量，甘草甜素的浓度为0.05wt％-3.0wt％。

关于术语“透明质酸盐”，其意指透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铁、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴、透明质酸铵、透明质酸四丁基铵或其混合物。

术语“透明质酸衍生物”意指包括：

-透明质酸酯，其中部分或全部羧基基团被脂族、芳族、芳脂族、脂环族、杂环系列多元醇酯化(还在EP0216453B1中描述)，

-自交联透明质酸酯，其中部分或全部羧基基团被来自相同多糖链或其他链的醇基团酯化(还在EP0341745B1中描述)，

-交联的透明质酸化合物，其中部分或全部羧基基团被脂族、芳族、芳脂族、脂环族或杂环系列多元醇酯化，通过间隔链(spacer chain)的方式产生交联(还在EP0265116B1中描述)，

-与透明质酸或与部分或全部透明质酸酯的琥珀酸半酯或琥珀酸重金属盐(还在WO96/357207中描述)，

-O-硫酸化衍生物(还在WO95/25751中描述)，或N-硫酸化衍生物(还在WO/1998/045335中描述)，及其混合物。

优选地，所述透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物的重均分子量为200-1500kDa，更优选600-1000kDa。

优选地，基于组合物的重量，所述透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物的浓度最高为5.0wt％。

更优选地，基于组合物的重量，所述透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物的浓度为0.01wt％-3.0wt％。

在优选的实施方案中，组合物包含透明质酸。

在特别优选的实施方案中，基于组合物的重量，透明质酸的浓度为0.1wt％-2.0wt％。

术语“罗望子种子多糖”意指可从罗望子(Tamarindus indica)的种子获得的多糖部分，为了简洁在下文中也称为“TSP”(来自英文术语“Tamarindus indica SeedPolysaccharide”)。

如已知的，罗望子树常见于印度、非洲和整个远东，在这些地方其被种植主要是为了食用目的。种子最初是一种副产品，后来发现了多种用途，有时被磨成粉状产品(目前被称为“粗制罗望子胶(raw tamarind gum)”或“罗望子仁粉(tamarind nut powder)”)，尤其是在纺织和造纸工业中，它被分别用作纱线的上浆剂和用作粘着剂，而在食品产业中，它被用作各种产品中的增稠剂、胶凝剂、稳定剂和粘合剂，与其他多糖产品诸如藻酸盐、果胶、瓜尔胶或槐豆粉(locust bean meal)非常相似。粗制罗望子胶(商购可得，例如，由设于Osaka,Japan的Dai-nippon Pharmaceutical Co.LTD生产的

一个有利的方面是，不像透明质酸发生热裂解，TSP溶液适合于在高压灭菌器中通过(passage)来灭菌(例如在120℃持续20分钟)，而不经历热降解。从生产的角度来看，通过单纯地在高压灭菌器中通过来灭菌的可能性使得基于TSP的制品特别方便。

此外，TSP还展示出显著的粘膜模拟(mucomimetic)、粘膜粘附和生物粘附特性。

TSP是一种纯化的中性水溶性多糖级分，包含非常亲水并且以分枝结构为特征的半乳糖木糖葡聚糖多聚分子：连接到由葡萄糖重复单元形成的主干直链(main linearchain)的是木糖的小单糖单元和木糖-半乳糖的二糖单元，在后一种情况下，半乳糖位于侧链的末端。三种单体以3:1:2的摩尔比存在，并构成种子组分的约65％。

如可以观察到的，“粘蛋白样”分子结构决定了该多糖优异的粘膜粘附特性，该粘附特性来源于与所述粘蛋白形成多种键。

可以通过化学方法和酶方法，使用蛋白酶或者蛋白酶和高强度超声的组合分离TSP。在化学方法中，将20g罗望子种子粉末添加到200ml冷蒸馏水中以制备悬浮液，然后将其倒入800ml沸腾蒸馏水中。将如此形成的溶液煮沸20分钟并持续搅拌；在静置一夜后，对所述溶液进行5000rpm的离心，持续20分钟。分离上清液，并倒入达到体积是所述上清液量的两倍的纯酒精中。因此，获得沉淀，然后用纯乙醇洗涤并风干。最后，将干燥的聚合物研磨、过筛，并储存在干燥器中直至使用。在酶方法中，将从种子获得的粉末与乙醇混合，并且然后用蛋白酶处理；随后，离心所述粉末，并向上清液添加乙醇进行沉淀。最后，将聚合物分离并干燥。

优选地，TSP的重均分子量是450-750kDa。

优选地，基于组合物的重量，所述增粘剂的浓度为最高5.0wt％。

更优选地，基于组合物的重量，所述增粘剂的浓度为0.01wt％-3.0wt％。

在优选的实施方案中，所述增粘剂是TSP、CMC或其混合物，更优选地，基于组合物的重量，浓度为0.05wt％-2.0wt％。

在更优选的实施方案中，所述增粘剂包含TSP，优选地，基于组合物的重量，浓度为0.05wt％-2.0wt％。可选地，所述增粘剂包含TSP与以下中的一种或更多种的混合物：PVP、羧乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶和聚丙烯酸酯。

特别优选的是其中所述增粘剂是TSP的组合物，优选地，基于组合物的重量，TSP的浓度为0.05wt％-2.0wt％。

优选地，甘草甜素与透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物的重量比为1:1至1:20，更优选1:1至1:10。

在优选的实施方案中，甘草甜素与透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物的重量比为1:1至1:5。

优选地，甘草甜素与增粘剂的重量比为5:1至1:15，更优选3:1至1:10。

在优选的实施方案中，甘草甜素与增粘剂的重量比为2:1至1:5。

优选地，透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物与增粘剂的重量比为1:2至10:1，更优选1:1至5:1。

在优选的实施方案中，透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物与增粘剂的重量比为1:1至3:1。

优选地，本发明的组合物具有4-7的pH。

更优选地，本发明的组合物具有5.5-6.5的pH。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包含用于维持选择的pH的缓冲剂。

优选地，基于组合物的重量，缓冲剂的浓度最高为5wt％。

更优选地，基于组合物的重量，缓冲剂的浓度为2.0wt％-4.0wt％。

在特别优选的实施方案中，基于组合物的重量，缓冲剂的浓度为1.5wt％-2.5wt％。

优选地，所述缓冲剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、硼酸-硼酸钠、柠檬酸-磷酸氢二钠(也称‘McIlvaine缓冲剂’)、柠檬酸-磷酸二氢钾-硼酸-二乙基巴比妥酸、TRIS-硼酸盐，及其混合物。

在优选的实施方案中，缓冲剂是柠檬酸-柠檬酸钠。

在特别优选的实施方案中，pH为约6，并且缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠。

在其他实施方案中，本发明的组合物的特征在于在25℃测量的电导率为0.1-2.0mS/cm，优选0.2-1.5mS/cm。如将从以下实施例中观察到的，观察到电导率越高，透明质酸酶的解聚作用越高，而电导率越低，透明质酸酶的解聚作用越低。这意味着，根据需要，对于需要限制产品的剂量的诸如化妆品、草本制剂产品(galenic product)、医疗器械或药物的应用，电导率可以向着接近上述范围的下限的值调节，或者对于于其中需要经常使用美容或药物制品的应用，电导率可以向着接近上限的值调节。

当本发明的组合物包含缓冲剂时，可以通过改变其中包含的酸化合物和盐化合物之间的重量比来调节电导率。例如，当缓冲剂是柠檬酸-柠檬酸钠时，柠檬酸和柠檬酸钠之间的重量比是变化的：通过增加柠檬酸的量，电导率降低；通过增加柠檬酸钠的量，电导率增加。

在本发明的组合物的其他优选的实施方案中，水是其中存在的唯一溶剂。

在其他优选的实施方案中，本发明的组合物不包含防腐剂或着色剂。

优选的组合物具有4-7的pH并且包含，基于组合物的重量：

-最高5.0wt％的甘草甜素，

-最高5.0wt％的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，

-最高5.0wt％的增粘剂，和

-水。

更优选的是组合物具有5.5-6.5的pH并且包含，基于组合物的重量：

-0.05wt％-3.0wt％的甘草甜素，

-0.01wt％-3.0wt％的透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，

-0.01wt％-3.0wt％的增粘剂，

-最高5wt％的缓冲剂，和

水。

仍更优选的是组合物具有5.5-6.5的pH并且包含，基于组合物的重量：

-0.05wt％-3.0wt％的甘草甜素，

-0.01wt％-3.0wt％的透明质酸，

-0.01wt％-3.0wt％的TSP、CMC或其混合物，

-2.0wt％-4.0wt％的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲剂，和

-水。

甚至更优选的是组合物具有5.5-6.5的pH并且包含，基于组合物的重量：

-0.05wt％-3.0wt％的甘草甜素，

-0.01wt％-3.0wt％的透明质酸，

-0.01wt％-3.0wt％的TSP，

-2.0wt％-4.0wt％的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲剂，和

-水。

在一些实施方案中，本发明的组合物主要由甘草甜素、透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，和选自以下的增粘剂组成：罗望子种子多糖、PVP、羧乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶、聚丙烯酸酯，及其混合物。表述“主要由...组成”意指以上列出的三种组分是本发明的组合物中存在的仅有活性成分，同时任何其他组分或赋形剂不干扰其作用，并且是水混溶性和水溶性的。

在其他实施方案中，本发明的组合物由甘草甜素、透明质酸或透明质酸盐或透明质酸衍生物，和选自以下的增粘剂组成：罗望子种子多糖、PVP、羧乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶、聚丙烯酸酯，及其混合物。

本发明的组合物可以通过使用通常已知的方法配制。事实上，所述组分可以例如在搅拌下原样混合或与逐个添加的一种或更多种赋形剂进行混合。

在一些实施方案中，本发明的组合物在使用前是根据通常已知的方法已进行灭菌的，例如，在用γ射线处理下进行灭菌。

在另一方面，本发明涉及所述组合物在治疗眼部疾患中的用途。

术语“眼部疾患”意指影响眼睛表面的炎性状况，诸如干眼综合征、干燥综合征、葡萄膜炎、结膜炎、角膜炎、角膜结膜炎、春季角膜结膜炎(vernal keratoconjunctivitis)、角膜溃疡、特应性角膜结膜炎、瘢痕性结膜炎(cicatrising conjunctivitis)、睑缘炎、角膜炎、兔眼(lagophthalmos)、眼内炎、巩膜外层炎和巩膜炎。

在仍另外的方面，本发明涉及包含所述组合物的眼科产品。

所述眼科产品可以是眼泪替代物、洗眼剂、悬浮剂、眼喷雾、泡沫剂、湿擦拭物(wetwipe)、喷涂贴片(spray-on patch)或其组合。

在优选的实施方案中，所述眼科产品是眼泪替代物。

如将从下文提供的实施例中观察到的，不仅从物理-化学和流变学的角度，而且从来源于其组分的协同作用的有效性的角度，本发明的组合物都提供了许多优点。事实上，首先，本发明的组合物提高了甘草甜素的生物利用度，并且其次，甘草甜素和增粘剂的同时存在抑制了透明质酸酶(一种通常存在于眼睛表面并降解透明质酸的酶)的作用，因此提高了透明质酸的持久性和有效性，从而减少了进行产品的重复施用的需要。

在包含本发明的组合物的眼科产品的优选的实施方案中，增粘剂是TSP、CMC或其混合物，更优选地，基于组合物的重量，浓度为0.05wt％-2.0wt％。

在更优选的实施方案中，所述增粘剂包含TSP，优选地，基于组合物的重量，浓度为0.05wt％-2.0wt％。

可选地，所述增粘剂包含TSP与以下中的一种或更多种的混合物：PVP、羧乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、粘多糖、纤维素及其酯、天然树胶及其酯、果胶和聚丙烯酸酯。

特别优选的是其中所述增粘剂是TSP的组合物，优选地，基于组合物的重量，TSP的浓度为0.05wt％-2.0wt％。

也呈单位剂量形式的根据本发明的眼科产品还可以包含眼科学上可接受的赋形剂。术语“眼科学上可接受的赋形剂”意指适合在组合物中使用以施用到眼睛外表面的化合物或混合物。例如，这种赋形剂通常不会引起使用者的不良反应，也不会显著抑制活性物质对眼睛表面的作用。

合适的赋形剂是抗氧化剂、胶凝剂、螯合剂、粘合剂、润滑剂、增稠剂、张力调节剂、成膜物质(filmogenic substance)及其混合物。

因此，合适的抗氧化剂是焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠、葡萄糖、半胱氨酸及其混合物。

合适的螯合剂是EDTA及其单钠盐、二钠盐和钾盐，二乙烯三胺五亚甲基膦酸，六亚甲基二胺四亚甲基膦酸，乙二胺四亚甲基膦酸，氨基三亚甲基膦酸及其混合物。

优选地，螯合剂是EDTA、其单钠盐、二钠盐和钾盐及其混合物。

合适的张力调节剂是无机盐，诸如氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化钙，或多元醇或糖，诸如甘油、丙二醇、赤藓糖醇、甘露醇、山梨醇和海藻糖，或氨基酸，诸如肉碱和甜菜碱。

在另外的方面，本发明涉及所述组合物在皮肤病症、妇科病症、耳鼻喉科病症或牙科病症的局部治疗中的用途。

在仍另外的方面，本发明涉及所述组合物的美容用途，特别是在用于外用局部使用的产品中作为舒缓剂的美容用途。

本发明的组合物中包含的甘草甜素确实可用于意在治疗和保护敏感和娇嫩皮肤的产品中，因为它有效地用作舒缓剂，例如，用于儿童的制剂、须后水(aftershave)和晒后产品中的舒缓剂、用于发炎、发红的皮肤或通常易患特应性和脂溢性皮炎和刺激的皮肤的产品中的舒缓剂。它甚至在小剂量(0.5％和1％之间)也发挥其活性，在该水平它不具有任何副作用。因此，它使得含有低百分比的18β-甘草次酸并且可以使最终产品呈现不吸引人的深色的甘草提取物的使用被淘汰。

当药物或美容组合物通过外用或内用局部途径施用时，所述组合物优选为溶液、洗剂、乳液、悬浮液、凝胶、软膏、乳膏、糊剂、溶液喷雾、透皮贴剂、喷涂贴片、泡沫或湿擦拭物的形式，其中组合物优选为悬浮液或溶解于一种或更多种合适的赋形剂中。

适用于这些施用形式的赋形剂的实例是矿物油，液体石蜡，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯，乳化蜡，硬脂醇，异硬脂醇，十六十八醇(cetylstearyl alcohol)，硬脂酸，硬脂酸甘油酯，十二烷基肌氨酸钠，甘油，二乙二醇单乙醚，聚乙二醇，聚乙二醇硬脂酸酯，淀粉，卡波普(carbopol)，卡波姆(carbomer)，对羟基苯甲酸甲酯，泊洛沙姆407，聚乙二醇400(Macrogol 400)，纯化膨润土，对羟基苯甲酸丙酯，肉豆蔻醇丙酸酯(myristylpropionate)，二甲聚硅氧烷(dimethicone)，二氧化钛，阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，水，及其混合物。

优选地，根据本发明的药物或美容组合物通过局部外用途径施用。

还应理解，如上文报告的，组合物的组分以及包含其的产品、其制备和用途的优选方面的所有组合，都应被认为在此被公开，并且是类似地是优选的。

还应理解，上文公开的本发明的组合物、制备方法和用途的优选方面的所有组合都应被理解为本文描述的。

下文出于说明性目的提供了本发明的工作实施例。

实施例

材料

包含HAS、TSP和GA的组合物的制备

在d-H

-10ml的具有0.2％GA的组合物；

-5ml的具有0.1％GA的组合物；

-2.5ml的具有0.05％GA的组合物。

在添加后，将组合物在d-H

实施例1：

在完全溶解后，并且使储备溶液冷却后，将5ml的步骤3添加至步骤2。

最后，将溶液在d-H

实施例2：

在完全溶解后，并且使储备溶液冷却后，将5ml的步骤3添加至步骤2。最后，将溶液在d-H

包含HAS、CMC和GA的组合物的制备

在d-H

-10ml的具有0.2％GA的组合物；

-5ml的具有0.1％GA的组合物；

-2.5ml的具有0.05％GA的组合物。

在添加后，将组合物在d-H

实施例3：

在完全溶解后，并且使储备溶液冷却后，将5ml的步骤3添加至步骤2。最后，使溶液在d-H

实施例4：

在完全溶解后，并且使储备溶液冷却后，将5ml的步骤2添加至步骤1。最后，将溶液在d-H

缓冲剂修改评估

制备了其中柠檬酸钠的浓度被修改的组合物，最终含量(以重量/体积百分比给出)达到0.4％HAS和0.2％TSP；同时，以不同的浓度(0.05％、0.1％和0.2％重量/体积)添加GA。

-10ml的具有0.2％GA的组合物；

-5ml的具有0.1％GA的组合物；

-2.5ml的具有0.05％GA的组合物。

在添加后，将组合物在d-H

实施例5：

在完全溶解后，并且使储备溶液冷却后，将5ml的步骤3添加至步骤2。最后，将溶液在d-H

表征：

尺寸排阻色谱法

在以下色谱条件下，通过尺寸排阻色谱法结合多检测器系统，对HAS、TSP、GA、CMC的分子量分布、组合物的分子量分布以及最后对酶消化产物的分子量分布进行表征：

获得数据并使用OmniSEC v 10.31软件处理数据，并设置以下dn/dc值：HAS为0.155，TSP为0.164，CMC为0.16，并且组合物为0.159。

用标准分子量和已知的多分散性和特性粘度(intrinsic viscosity)校准仪器(PolyCAL-Pul57k,MalvernPanalytical Instruments,UK)。

样品的制备：

称量HAS、TSP和CMC样品，并且溶解于流动相中，浓度分别为约4mg/ml、2mg/ml和2mg/ml；注射前，在流动相中稀释为约0.5mg/ml。组合物和酶消化产物在流动相中稀释至0.8和0.6mg/ml之间的最终浓度。

电导率、动态光散射(DLS)和δ电位

在以下仪器条件下用Zetasizer(MalvernPanalytical)获取HAS、TSP、GA、CMC和组合物的尺寸测量值(Rh,nm)和表面负载测量值(δ电位,Zp,mV)：

尺寸测量

δ电位的测量

样品的制备：

分析了处于未改变状态的组合物，并在去离子水中稀释至1:10。称量HAS、TSP和CMC的样品并溶解于柠檬酸盐缓冲液中，获得约4mg/ml、2mg/ml和2mg/ml的浓度，并使之在搅拌下保持2小时以分析处于未改变状态的组合物，并且然后将组合物在H

核磁共振(NMR)

在以下条件下用在500MHz(

用EM函数(指数函数)并且用LB 0.3Hz处理所有光谱，以降低背景噪声。

T1-NMR

在以下条件用在500MHz(

对于数据的再处理，使用Bruker TOPSPIN 4.02作为软件，该软件具有T1T2计算例程(T1T2 calculation routine)或具有动态中心。

T2-NMR

在以下条件下用在500MHz(

对于数据的再处理，使用Bruker TOPSPIN 4.02作为软件，该软件具有T1T2计算例程或具有动态中心。

用于

称量4mg(HAS)和2mg(TSP和CMC)，并溶解于1ml D

最后，从每个样品中取出0.6ml，然后转移到5mm NMR管中。

尺寸排阻色谱法

如从以上示出的色谱数据可以观察到的，在实验中使用的浓度的GA的存在不改变HAS+TSP复合物或HAS+CMC复合物的化学-物理性质，诸如分子量和粘度。

动态光散射(DLS)和ζ电位

从以上示出的数据可以观察到，相对于仅具有HAS和TSP的组合物，GA的存在显著改变了聚合物基质的构象：随着GA的浓度增加，流体动力学半径和表面载荷两者都减小。

核磁共振(NMR)

观察到，在高于0.05％的浓度，GA具有的光谱与凝胶的相容性比与溶液的相容性更大。

在HAS(0.4％)和TSP(0.2％)的存在下，GA的NMR谱发生变化，表明两种多糖使其更容易分散，尤其是在水中并且优选浓度高于0.05％时更容易分散。

NMR也被证明是用于对制剂进行表征和定量的良好分析方法。事实上，如从图1中可以观察到的，在从0.1％浓度(a)变化到0.2％浓度(b)时，可以观察到GA信号的加宽，这归因于在HAS和TSP的存在下分子在溶液中更大的溶解度和溶出。

参考图2和图3，在存在HAS(0.4％)和TSP(0.2％)的情况下，观察到：

1)在水和柠檬酸盐缓冲液两者中，仅添加HAS或仅添加TSP，GA信号的平均T2都增加，在HAS+TSP混合物中获得了更大的值。这种增加归因于在HAS+TSP存在下GA分子的更大的迁移率和在溶液中更好的分散性。

2)在水中(图2)，T2值大于T1值表明与液体行为相比与凝胶行为更相容的速度。

3)在水中(图2)，制剂HAS+TSP+GA中的GA信号的平均T1值小于处于未改变状态的GA。这一结果证实了与固体/凝胶而不是溶液的运动速度相容的表现。

4)在柠檬酸盐缓冲液中(图3)，在不同的制剂中，GA信号的平均T1和T2值是可比较的，其中GA处于未改变状态。

5)缓冲液中(图3)的T2值大于水中(图2)的T2值，表明在离子力的变化后，GA分子的分散性更好。

6)在缓冲液中(图3)，在水中发现的差异(图2)不太显著。

酶消化

对遵循早先描述的方法制备的d-H

称量20mg Hya并且在室温溶解于2ml水中；然后取0.1ml并添加到50ml组合物样品中(HAS/Hya比按重量计达到10/0.1)。消化在38℃进行24小时的时间段，分子量的降低通过15分钟和30分钟取1ml样品，然后在前6h内每小时取1ml样品，并且24小时后取1ml样品一次来监测。在每次取样后，使酶变性，将取样溶液在100℃搅拌5分钟，并且然后过滤以去除酶沉淀物(过滤器：LLG-注射器式滤器，CA孔径0.20μm，

如下计算分子量随时间的降低(作为百分比)：

HAS的消化

HAS+TPS的消化

HAS+TPS+GA 0.1％的消化

HAS+TPS+GA 0.2％的消化

基于以上示出的结果，将对于不同组合物观察到的按百分比计的下降比较如下：

-H

-柠檬酸盐缓冲液中：

HAS+CMC的消化

HAS+CMC+GA 0.1％的消化

基于以上示出的结果，将对于不同组合物观察到按百分比计的下降比较如下：

-H

-柠檬酸盐缓冲液中：

修改的柠檬酸盐缓冲液中的HAS的消化

修改的柠檬酸盐缓冲液中的HAS+TPS的消化

修改的柠檬酸盐缓冲液中的HAS+TPS+GA 0.1％的消化

从以上示出的数据观察到柠檬酸盐缓冲液浓度的修改对HAS的解聚有显著的减速作用；特别地，在HAS+TSP+GA 0.1％的制剂中，在22h后，分子量的降低仅为57％。

然后用不同的缓冲液进行测试，以评估对根据本发明的组合物的影响。

制备并使用了以下缓冲液：

缓冲液1：2.8％甘露醇、0.8％柠檬酸钠、0.01％柠檬酸

缓冲液2：2.8％甘露醇、0.2％柠檬酸钠、0.01％柠檬酸

缓冲液3：2.8％甘露醇、0.2％柠檬酸钠、0.0025％柠檬酸

缓冲液4：2.8％甘露醇、0.4％柠檬酸钠、0.005％柠檬酸

缓冲液5：2.8％甘露醇、0.266％柠檬酸钠、0.0033％柠檬酸

然后制备了包含HAS、TSP、GA的组合物，用上文指出的不同缓冲液配制它们。

这些测试的结果在下表中示出：

观察到，在多糖和GA的存在下，电导率增加，例外是，一般来说，当GA以0.2％存在时，对比之下，电导率显示降低。降低乙酸钠，电导率降低，而未观察到柠檬酸的影响。

在存在不同缓冲液的情况下，进一步检查包含HAS+TSP+GA 0.2％的组合物，以评估平均分子量随时间变化的趋势：

从上文说明的数据观察到，在柠檬酸盐缓冲液中消化的前6小时期间，GA和TSP的存在使透明质酸酶对HAS的解聚减速；然而，在22小时后，解聚完成。

同时，在水中的制剂中，GA和TSP的联合作用几乎完全屏蔽了透明质酸酶的作用，因此没有观察到HAS分子量的减少。

因此，根据需要，除了透明质酸酶对HAS的作用之外，还可以调节pH和离子力两者，以及缓冲液的存在与不存在，从而调节GA的生物利用度。