用于寿光鸡种鉴定的分子标记引物组合及鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物技术及家禽种质鉴定领域，具体涉及一种用于寿光鸡种鉴定的分子标记引物组合及鉴定方法。

背景技术

寿光鸡是中国优良地方品种，主要分布在寿光的弥河流域，遗传性能稳定，外貌特征一致，具有体型硕大、黑羽、黑腿、黑嘴、白皮肤，肉质细嫩，风味鲜美，蛋大皮红等特性，被列入国家品种志和山东省地方品种保护名录。寿光鸡的形成与当地社会的文化与经济活动息息相关，有一个较长的发展过程。然而近年来随着养鸡生产商品化的发展和专业化品种的大量引进，寿光鸡养殖受到巨大冲击。种群数量大幅度减少，造成多年封锁繁育和近亲繁殖现象，生产力明显降低，甚至到了濒临灭绝的边缘。为更好的了解和保护这一宝贵的品种资源，也为了解决品种认定、知识产权纠纷，需要一种对寿光鸡种进行有效鉴定的方法。

发明内容

本发明主要目的是提供用于寿光鸡种鉴定的分子标记引物组合及鉴定方法，采用所述引物组合鉴定寿光鸡，准确性高。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一组用于寿光鸡种鉴定的分子标记位点，包括以下所述特异性SNP位点：

SG_tag1位于鸡1号染色体31485093处，基因AMIGO2与RPAP3之间，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag2位于鸡1号染色体67871578处，ITPR2基因第9内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag3位于鸡1号染色体16298794处，CERK基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag4位于鸡1染色体56917556处，LOC100858131基因第1外显子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag5位于鸡2染色体11691648处，基因PITRM1与LOC100858869之间，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag6位于鸡3号染色体37591801处，RYR2基因第1内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag7位于鸡3号染色体96734173处，HPCAL1基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag8位于鸡3染色体40423167处，PGBD5基因第3内含子，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag9位于鸡5号染色体52272095处，基因GPR132与JAG2之间，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag10位于鸡10号染色体12814544处，ABHD17C基因第6内含子，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag11位于鸡14号染色体12121436处，基因RBFOX1与IL20RB之间，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag13位于鸡Z号染色体32408065处，BNC2基因第4内含子，寿光鸡基因型为GG。

进一步地，所述分子标记位点还包括以下特异性INDEL位点：

SG_tag12位于鸡20号染色体9205365-9205367处，基因MYT1与LOC419250之间，寿光鸡基因型为--缺失CTT；

SG_tag14位于鸡Z号染色体1436834处，ZBTB7C基因第2内含子，寿光鸡基因型为--缺失T。

本发明提供一种寿光鸡种鉴定方法，采用以下任意一个或几个特异性位点进行鉴定：

SG_tag1位于鸡1号染色体31485093处，基因AMIGO2与RPAP3之间，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag2位于鸡1号染色体67871578处，ITPR2基因第9内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag3位于鸡1号染色体16298794处，CERK基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag4位于鸡1染色体56917556处，LOC100858131基因第1外显子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag5位于鸡2染色体11691648处，基因PITRM1与LOC100858869之间，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag6位于鸡3号染色体37591801处，RYR2基因第1内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag7位于鸡3号染色体96734173处，HPCAL1基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag8位于鸡3染色体40423167处，PGBD5基因第3内含子，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag9位于鸡5号染色体52272095处，基因GPR132与JAG2之间，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag10位于鸡10号染色体12814544处，ABHD17C基因第6内含子，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag11位于鸡14号染色体12121436处，基因RBFOX1与IL20RB之间，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag12位于鸡20号染色体9205365-9205367处，基因MYT1与LOC419250之间，寿光鸡基因型为--缺失CTT；

SG_tag13位于鸡Z号染色体32408065处，BNC2基因第4内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag14位于鸡Z号染色体1436834处，ZBTB7C基因第2内含子，寿光鸡基因型为--缺失T。

本发明还提供用于寿光鸡鉴定的分子标记引物组合，所述引物组合包括以下任意一对或几对引物的组合：

用于检测所述标记SG_tag1的引物为SG_P1f和SG_P1r：

SG_P1f：TCAGGTCGCATAGGTAGG；

SG_P1r：GTTCAGATGTGGATTCTTCAG；

用于检测所述标记SG_tag2的引物为SG_P2f和SG_P2r：

SG_P2f：AACTTGAACACAGACCAGAT；

SG_P2r：GCAGACATTGGAATAGATACTC；

用于检测所述标记SG_tag3的引物为SG_P3f和SG_P3r：

SG_P3f：TCTGCCTCTACCACTTCC；

SG_P3r：GTTATTGTCCTCTTGCTGTC；

用于检测所述标记SG_tag4的引物为SG_P4f和SG_P4r：

SG_P4f：CACACTTGGTTACACTGAG；

SG_P4r：TTGAGGAAGGACATGAAGAA；

用于检测所述标记SG_tag5的引物为SG_P5f和SG_P5r：

SG_P5f：GGTGGTAGGACAGTGGAT；

SG_P5r：TCAAGGCAATGTTAGAGCAT；

用于检测所述标记SG_tag6的引物为SG_P6f和SG_P6r：

SG_P6f：GGCAGTAGTTAGGTGATGAT；

SG_P6r：CGTAGTCTGTTAGTTATGAAGG；

用于检测所述标记SG_tag7的引物为SG_P7f和SG_P7r：

SG_P7f：GGTCAGTCTATTATCAGCATTG；

SG_P7r：CCAAGGTTCATCAGCACTT；

用于检测所述标记SG_tag8的引物为SG_P8f和SG_P8r：

SG_P8f：CCACAGTTCTGACCTTGA；

SG_P8r：CACCTTCCTCTGCTCATC；

用于检测所述标记SG_tag9的引物为SG_P9f和SG_P9r：

SG_P9f：TCCAGTCCATTCAGGTATTAG；

SG_P9r：CTCACAGTCTCCAGTTCATT；

用于检测所述标记SG_tag10的引物为SG_P10f和SG_P10r：

SG_P10f：AGACCAACCTTCTTATACTACC；

SG_P10r：TTCATCACTGCTTCTACCAA；

用于检测所述标记SG_tag11的引物为SG_P11f和SG_P11r：

SG_P11f：TGCCTACACTGACTTGGA；

SG_P11r：TATTGCCTCTGATGCCTTC；

用于检测所述标记SG_tag12的引物为SG_P12f和SG_P12r：

SG_P12f：CATGAATCACAGCCTCCAA；

SG_P12r：AGCAGCCAACAGAAGAAC；

用于检测所述标记SG_tag13的引物为SG_P13f和SG_P13r：

SG_P13f：CTGACTTCACTGAGATGCTA；

SG_P13r：GGAGAATGGACTGGAGGA；

用于检测所述标记SG_tag14的引物为SG_P14f和SG_P14r：

SG_P14f：AATGTCTTGCCACTACTGAT；

SG_P14r：GGATGCGGTGTTATCTGAT。

进一步地，所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P2f和SG_P2r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P5f和SG_P5r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P7f和SG_P7r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P10f和SG_P10r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P12f和SG_P12r，SG_P13f和SG_P13r，SG_P14f和SG_P14r。

进一步地，所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P2f和SG_P2r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P5f和SG_P5r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P7f和SG_P7r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P10f和SG_P10r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P13f和SG_P13r。

进一步地，所述引物组合由以下引物对组成：SG_P12f和SG_P12r，SG_P14f和SG_P14r。

进一步地，所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P12f和SG_P12r。

本发明还提供以上所述引物组合在寿光鸡分子标记位点鉴定、寿光鸡品种鉴定中的应用。

本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括以上任一项所述引物组合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明筛选得到了关于寿光鸡的多个品种特异性分子标记位点，包括多个特异性SNP位点和两个特异性INDEL位点。本发明首次筛选到关于寿光鸡的特异性INDEL位点，且所述INDEL位点用于寿光鸡品种鉴定率分别高达90％、100％，能够实际有效地将寿光鸡鉴定出来。同时，本发明筛选得到的特异性SNP位点对寿光鸡的鉴定也具有较高的鉴定率。因此，将本发明所述特异性分子标记位点进行组合，可有效用于寿光鸡的鉴定。

本发明还提供了各特异性分子位点的鉴定引物及其组合，所述引物特异性强，准确率高，更有利于大规模推广用于寿光鸡的鉴定。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为基于约束最大似然法构建的地方鸡种系统进化树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1寿光鸡特异性分子标记位点

以最小等位基因频率-连锁不平衡方法分析259个地方鸡简化基因组序列，筛选得到19个寿光鸡品种特异性SNPs/INDELs标记。19个SNPs/INDELs位点的物理位置是基于鸡全基因组参考序列比对确定的，所述鸡全基因组标准序列的版本号为(Gallus gallusGRCg6)。

所述鸡种包括寿光鸡(20只)、济宁百日鸡(20只)、琅琊鸡(20只)、太湖鸡(20只)、汶上芦花鸡(20只)、如皋黄鸡(20只)、鹿苑鸡(20只)、狼山鸡(20只)、溧阳鸡(20只)、徐海鸡(20只)、龙胜凤鸡(20只)、闽清毛脚鸡(20只)、淮北麻鸡(20只)，每个品种公母各半。其中，龙胜凤鸡1个体因质控不合格，将其从测序数据中剔除。

寿光鸡品种特异性SNPs标记具体如下:

SG_tag1位于鸡1号染色体31485093处，基因AMIGO2与RPAP3之间，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag2位于鸡1号染色体67871578处，ITPR2基因第9内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag3位于鸡1号染色体16298794处，CERK基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag4位于鸡1染色体56917556处，LOC100858131基因第1外显子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag5位于鸡2染色体11691648处，基因PITRM1与LOC100858869之间，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag6位于鸡3号染色体37591801处，RYR2基因第1内含子，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag7位于鸡3号染色体96734173处，HPCAL1基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag8位于鸡3染色体40423167处，PGBD5基因第3内含子，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag9位于鸡5号染色体52272095处，基因GPR132与JAG2之间，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag10位于鸡10号染色体12814544处，ABHD17C基因第6内含子，寿光鸡基因型为TT；

SG_tag11位于鸡14号染色体12121436处，基因RBFOX1与IL20RB之间，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag13位于鸡Z号染色体32408065处，BNC2基因第4内含子，寿光鸡基因型为GG。

SG_tag15位于鸡1号染色体186039622处，基因CNTN5与CCDC82之间，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag16位于鸡8号染色体21367992处，ZSWIM5基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG；

SG_tag17位于鸡15号染色体10425909处，基因PRODH与RTN4R之间，寿光鸡基因型为CC；

SG_tag18位于鸡15号染色体11620262处，FBXO21基因第6内含子，寿光鸡基因型为AA；

SG_tag19位于鸡21号染色体5126764处，LOC112529925基因第3内含子，寿光鸡基因型为AA。

寿光鸡品种特异性INDEL标记具体如下:

SG_tag12位于鸡20号染色体9205365-9205367处，基因MYT1与LOC419250之间，寿光鸡基因型为--缺失CTT；

SG_tag14位于鸡Z号染色体1436834处，ZBTB7C基因第2内含子，寿光鸡基因型为--缺失T；

SG_tag15位于鸡1号染色体186039622处，基因CNTN5与CCDC82之间，寿光鸡基因型为GG。

SG_tag16位于鸡8号染色体21367992处，ZSWIM5基因第1内含子，寿光鸡基因型为GG。

SG_tag17位于鸡15号染色体10425909处，基因PRODH与RTN4R之间，寿光鸡基因型为CC。

SG_tag18位于鸡15号染色体11620262处，FBXO21基因第6内含子，寿光鸡基因型为AA。

SG_tag19位于鸡21号染色体5126764处，LOC112529925基因第3内含子，寿光鸡基因型为AA。

用于检测所述标记SG_tag1的引物为SG_P1f和SG_P1r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag2的引物为SG_P2f和SG_P2r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag3的引物为SG_P3f和SG_P3r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag4的引物为SG_P4f和SG_P4r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag5的引物为SG_P5f和SG_P5r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag6的引物为SG_P6f和SG_P6r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag7的引物为SG_P7f和SG_P7r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag8的引物为SG_P8f和SG_P8r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag9的引物为SG_P9f和SG_P9r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag10的引物为SG_P10f和SG_P10r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag11的引物为SG_P11f和SG_P11r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag12的引物为SG_P12f和SG_P12r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag13的引物为SG_P13f和SG_P13r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记SG_tag14的引物为SG_P14f和SG_P14r所示两条单链DNA。

用于检测所述标记SG_tag15的引物为SG_P15f和SG_P15r所示两条单链DNA。

用于检测所述标记SG_tag16的引物为SG_P16f和SG_P16r所示两条单链DNA。

用于检测所述标记SG_tag17的引物为SG_P17f和SG_P17r所示两条单链DNA。

用于检测所述标记SG_tag18的引物为SG_P18f和SG_P18r所示两条单链DNA。

用于检测所述标记SG_tag19的引物为SG_P19f和SG_P19r所示两条单链DNA。

以上所述引物长度、扩增片段长度及退火温度，如下表1所示。

表1.检测寿光鸡品种特异性标记所用扩增引物

应用上述19个标记及相应引物，对20份寿光鸡血样和370份非寿光鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：

以CTAB法提取390份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各l0ng，5μL 2×power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序：首先94℃变性30s，51.3-59.1℃退火30s，72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s，50.8-58.6℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行DNA序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。各特异性位点的鉴定率如下表2所示。

表2.寿光鸡品种特异性标记鉴定率

根据表2所述结果，筛选SG_tag1-14特异性分子标记位点用于寿光鸡种的鉴定。

实施例2一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P2f和SG_P2r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P5f和SG_P5r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P7f和SG_P7r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P10f和SG_P10r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P12f和SG_P12r，SG_P13f和SG_P13r，SG_P14f和SG_P14r。

利用所述引物组合进行寿光鸡特异性分子标记位点鉴定及寿光鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

所述引物组合包括了筛选得到的可用于寿光鸡鉴定的分子标记引物。

实施例3一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P2f和SG_P2r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P5f和SG_P5r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P7f和SG_P7r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P10f和SG_P10r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P13f和SG_P13r。

利用所述引物组合进行寿光鸡特异性分子标记位点鉴定及寿光鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

所述引物组合包括了筛选得到的可用于寿光鸡鉴定的特异性SNP分子标记引物。

实施例4一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：SG_P12f和SG_P12r，SG_P14f和SG_P14r。

利用所述引物组合进行寿光鸡特异性分子标记位点鉴定及寿光鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

所述引物组合包括了筛选得到的可用于寿光鸡鉴定的特异性INDEL分子标记引物。

实施例5一种引物组合

所述引物组合由以下引物对组成：SG_P1f和SG_P1r，SG_P3f和SG_P3r，SG_P4f和SG_P4r，SG_P6f和SG_P6r，SG_P8f和SG_P8r，SG_P9f和SG_P9r，SG_P11f和SG_P11r，SG_P12f和SG_P12r。

利用所述引物组合进行寿光鸡特异性分子标记位点鉴定及寿光鸡种的鉴定。所述引物组合还可用于制备检测试剂盒。

所述引物组合包括了筛选得到的可用于寿光鸡鉴定的特异性INDEL、SNP分子标记引物。所述各对引物用于寿光鸡鉴定，鉴定率均在95％及以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。