伊拉非诺盐

技术领域

本发明涉及伊拉非诺(elafibranor)的盐，其制备方法及其用途。

背景技术

式(I)的伊拉非诺

是目前在III期临床研究中评估的用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的分子。伊拉非诺、其制造和用途在WO2004005233和WO2011144579中有所描述。

本发明人进行的研究已表明，伊拉非诺的物理化学性质例如其稳定性(特别是其光稳定性)和溶解性可以得到改善。

现已发现，通过将伊拉非诺的游离酸转化为伊拉非诺的盐，可以进一步改善伊拉非诺的物理化学性质。

发明内容

本发明涉及伊拉非诺的盐及其制备方法。

本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的盐和药学上可接受的载体。

本发明进一步提供了包含本发明的盐和一种或多种其他治疗剂的组合。

本发明还提供了用于疗法中的本发明的盐。特别是，本发明的盐可以用于治疗肝脏疾病，特别是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化或肝硬化。

本发明还提供了本发明的盐在制造药物中的用途，所述药物例如用于治疗肝脏疾病，特别是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化或肝硬化的药物。

本发明还提供了一种用于治疗患有肝脏疾病，特别是NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、肝纤维化或肝硬化的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的盐。

在一个特定的实施方式中，本发明可以用于治疗NAFLD(非酒精性脂肪肝疾病)、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)或肝硬化。

附图和表格的说明

附图、表格和文本中使用的缩写：

AcOEt 乙酸乙酯

CH3CN 乙腈

c.p.s. 每秒计数

DSC 差示扫描量热仪

EtOH 乙醇

H2O 水

IPA 异丙醇

KCl 氯化钾

Na

NAFLD 非酒精性脂肪肝疾病

NaOH 氢氧化钠

NASH 非酒精性脂肪性肝炎

OM 光学显微镜检查

RH 相对湿度

THF 四氢呋喃

XRPD X射线粉末衍射

图1显示了在交叉偏振光下在EtOH/AcEt中结晶的盐I的光学显微镜检查(放大倍数上图x81和下图x325)。

图2a显示了在交叉偏振光下在IPA中重结晶的盐II的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图2b显示了在交叉偏振光下在IPA/H2O中重结晶的盐II的光学显微镜检查(放大倍数x81)。

图2c显示了在交叉偏振光下在CH3CN中重结晶的盐II的光学显微镜检查(放大倍数x81)。

图3显示了在交叉偏振光下在丙酮中结晶的盐III的光学显微镜检查(放大倍数x81)。

图4a显示了在交叉偏振光下在丙酮中重结晶的盐IV的光学显微镜检查(放大倍数x81)。

图4b显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐IV的光学显微镜检查(放大倍数x81)。

图5显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐V的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图6显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐VI的光学显微镜检查(放大倍数x25)。

图7显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐VII的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图8显示了在交叉偏振光下在丙酮中重结晶的盐VIII的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图9显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐IX的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图10显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐X的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图11显示了在交叉偏振光下在EtOH/H2O中重结晶的盐XI的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图12显示了在交叉偏振光下在丙酮/H2O中重结晶的盐XII的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图13示出了在交叉偏振光下在THF/H2O中重结晶的盐XIII的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图14显示了在交叉偏振光下在H2O中重结晶的盐XIV的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图15显示了在交叉偏振光下在H2O中重结晶的盐XV的光学显微镜检查(放大倍数x84)。

图16显示了盐I在5℃/min下的DSC曲线。

图17显示了盐II在5℃/min下的DSC曲线。

图18显示了盐III在5℃/min下的DSC曲线。

图19显示了盐IV在5℃/min下的DSC曲线。

图20显示了盐I(在EtOH/AcEt中结晶)的X射线衍射曲线。

图21显示了盐II(在CH3CN中结晶)的X射线衍射曲线。

图22显示了盐IV(在丙酮/H2O中结晶)的X射线衍射曲线。

图23显示了盐IV二水合物(在丙酮/H2O中结晶)的X射线衍射曲线。

图24显示了盐I(在EtOH/AcEt中结晶)的HPLC曲线。

图25显示了盐II(在CH3CN中结晶)的HPLC曲线。

图26显示了盐III(在丙酮中结晶)的HPLC曲线。

图27显示了盐IV(在丙酮/H2O中结晶)的HPLC曲线。

图28显示根据本发明的化合物以剂量依赖性方式抑制通过用PDGF-BB处理诱导的hHSC的增殖。

图29显示根据本发明的化合物减少了TGFβ1激活的hHSC中的α-SMA蛋白分泌。

图30显示根据本发明的化合物减少了TGFβ1激活的hHSC中的COL1A1分泌。

图31显示根据本发明的化合物减少了TGFβ1激活的hHSC中的COL4A1分泌。

具体实施方式

通过参考以下结合附图和实施例的详细描述，可以更容易地理解本发明，所述附图和实施例构成了本公开的一部分。应当理解，本发明不限于在此描述和/或显示的特定产品、方法、条件或参数，并且本文使用的术语仅出于以举例的方式描述特定实施方式的目的，而并非旨在限制所要求保护的发明。

本文件中引用或描述的每个专利、专利申请和出版物的全部公开内容通过引用并入本文。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。

如上文和整个公开内容中所使用，除非另外指出，否则以下术语和缩写应理解为具有以下含义。

在本公开中，不带具体数量的指称物包括复数个所指物，并且除非上下文另有明确说明，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。因此，例如，对“溶剂”的引用是本领域技术人员对一种或多种这样的溶剂及其等同物的引用，等等。

如上所述，术语“疾病”是指疾病、病症、疾患、症状或适应症。该术语可与短语“疾病或病症”互换使用。

如本文所用，术语“治疗”或“疗法”(以及其不同的单词形式)包括预防性(preventative)(例如预防性(prophylactic))、治愈性或姑息性治疗。这样的预防性、治愈性或姑息性治疗可以是完全或部分的。例如，完全消除不希望的症状，或部分消除一种或多种不希望的症状将代表本文所考虑的“治疗”。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生在组织、系统、动物、个体或人体内寻求的生物学或医学反应的活性化合物的量，所述反应包括以下中的一项或多项：

(1)预防疾病或疾患；例如，预防可能易患疾病、疾患或病症但尚未经历或未显示所述疾病的病理或症状的个体中的所述疾病、疾患或病症；

(2)抑制疾病或疾患；例如，抑制正在经历或显示疾病、疾患或病症的病理或症状的个体中的所述疾病、疾患或病症(即，包括阻止病理和/或症状的进一步发展)；以及

(3)改善疾病或疾患；例如，改善正在经历或显示出疾病、疾患或病症的病理或症状的个体的所述疾病、疾患或病症(即包括逆转病理和/或症状)。

“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏性反应或与合理的益处/风险比相称的其他问题并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本发明提供伊拉非诺的盐。尽管伊拉非诺以其游离酸形式在本领域普通技术人员中是众所周知的，但是本公开涉及不同盐形式的该分子。伊拉非诺盐可能具有有利的特性，包括化学纯度、流动性、溶解性、形态或晶体习性，以及稳定性(例如储存稳定性、对脱水的稳定性、对光的稳定性、对多晶型转化的稳定性、低吸湿性和低残留溶剂含量)。

当提及本文所公开的伊拉非诺的一种盐时，术语“纯度”是指特定盐形式未稀释或未与另一种盐和/或降解副产物和/或外来物质混合的程度，并以重量百分比(重量％)表示。

当提及本文公开的伊拉非诺的一种盐的配制物或剂型(所述配制物或剂型包含特定的结晶形式作为活性医药剂(以及一种或多种其他物质如药学上可接受的媒介物))时，术语“纯度”是指配制物或剂型中的活性医药剂包含特定盐而不包含伊拉非诺的其他盐的程度，并且也以重量百分比(重量％)表示。

由于特定盐的重量百分比可以随由不同仪器、不同校准和/或不同软件包进行的测量而变化，因此本领域技术人员将理解，任何测量的纯度水平将显示出一定的可变性。由于这些可变性的来源，当提及盐形式的纯度百分比时，通常使用词语“约”或“至少”来叙述纯度。在一个特定的实施方式中，“约”是指数值±10％、特别是±5％的变化。

为了确定所述化合物用于所建议用途的最适当形式，已经研究了所述化合物的各种盐的存在。

现在已经合成和表征了式(I)化合物的新型盐。

一些新型盐具有非常好的稳定性，有利于它们用于制备药物剂型。

在盐的研究期间，本发明人发现了目标盐命中物清单，即与伊拉非诺缔合时最有可能形成盐的药学上可接受的抗衡离子的清单。

本文公开了伊拉非诺的十五种不同的盐。表1呈现了所测试碱的清单。

抗衡离子可以选自以下非穷举性清单：氨、L-精氨酸、苯乙胺、苄星(benzathine)、叔丁胺(特丁胺(erbumine))、氢氧化钙、氢氧化胆碱、丹醇、二乙醇胺(2,2'-亚氨基双(乙醇))、二乙胺、依泊胺(epolamine)(1-(2-羟乙基)吡咯烷)、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺(2-氨基乙醇)、乙二胺、甘氨酸、哈胺、1H-咪唑、L-赖氨酸、氢氧化镁、葡甲胺(N-甲基-葡糖胺)、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、氢氧化钠、三乙醇胺(2,2',2"-腈基-三(乙醇))、缓血酸胺(tromethamine)、氢氧化锌，特别是缓血酸胺、钾、钠、苯乙胺、苄星、L-精氨酸、乙醇胺、葡甲胺、甘氨酸、特丁胺、L-赖氨酸、依泊胺、胆碱，优选缓血酸胺、钾、钠、苯乙胺、苄星、L-精氨酸，更优选缓血酸胺、钾、钠、L-精氨酸，更特别是缓血酸胺。

在特定的实施方式中，本发明涉及伊拉非诺的氨、L-精氨酸、苯乙胺、苄星、叔丁胺(特丁胺)、钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺(2,2'-亚氨基双(乙醇)、二乙胺、依泊胺(1-(2-羟乙基)吡咯烷)、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺(2-氨基乙醇)、乙二胺、甘氨酸、哈胺、1H-咪唑、L-赖氨酸、镁、葡甲胺(N-甲基-葡糖胺)、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、钾、钠、三乙醇胺(2,2',2"-腈基-三(乙醇))、缓血酸胺或锌盐。

在另一个特定的实施方式中，伊拉非诺的盐选自伊拉非诺的缓血酸胺、钾、钠、L-精氨酸盐、苯乙胺、苄星、乙醇胺、葡甲胺、甘氨酸、特丁胺、L-赖氨酸、胆碱、依泊胺、镁或2-氨基-2-甲基-丙烷-1-醇盐。在另一个实施方式中，伊拉非诺的盐选自缓血酸胺、钾、钠和L-精氨酸伊拉非诺盐。在另一个实施方式中，伊拉非诺的盐选自缓血酸胺、钾和L-精氨酸伊拉非诺盐。在另一个实施方式中，伊拉非诺的盐是伊拉非诺的缓血酸胺盐。

在另一个实施方式中，伊拉非诺盐选自以下的盐I至XV，其可以是结晶形式：

I.结晶伊拉非诺缓血酸胺盐(盐I)的X射线衍射图包含以下衍射峰(角度2θ±0.2°)：6.5°、12.2°、15.0°、15.3°、16.9°、17.3°、17.6°、18.4°、19.4°和22.6°。

通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺缓血酸胺盐(盐I)的熔点为148℃。

II.结晶伊拉非诺钾盐(盐II)的X射线衍射图包含以下衍射峰(角度2θ±0.2°)：4.6°、8.0°、11.7°、13.1°和13.6°。

通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺钾盐(盐II)的熔点为247℃。

III.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺钠盐(盐III)的熔点为261℃。

IV.结晶伊拉非诺L-精氨酸盐(盐IV)的X射线衍射图包含以下衍射峰(角度2θ±0.2°)：3°、5.9°、8.8°、11.7°、13.2°、19.8°和19.9°。

通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺L-精氨酸盐(盐IV)的熔点为167℃。

V.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺苯乙胺盐(盐V)的熔点为125-158℃，对应于多晶簇的熔融。

VI.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺苄星盐(盐VI)的熔点为138-148℃，对应于棒晶和多晶簇的熔融。

VII.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺乙醇胺盐(盐VII)的熔点为118-160℃，对应于等径晶体的熔融。

VIII.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺葡甲胺盐(盐VIII)首先在35-88℃熔融，然后在133-158℃熔融，对应于两种多晶簇的熔融。

IX.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺甘氨酸盐(盐IX)首先在148-188℃熔融，对应于等径晶体的熔融，然后在178-223℃熔融，对应于链/板晶的熔融。

X.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺特丁胺盐(盐X)的熔点为148-161℃，对应于多晶簇的熔融。

XI.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺L-赖氨酸盐(盐XI)的熔点为104-162℃，对应于多晶簇的熔融。

XII.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺胆碱盐(盐XII)的熔点为116-159℃，对应于多晶簇的熔融。

XIII.通过差示扫描量热法，在5℃/min的加热速率下，伊拉非诺依泊胺盐(盐XIII)的熔点为108-158℃，对应于多晶簇的熔融。

XIV.伊拉非诺镁盐(盐XIV)。镁盐显示142-162℃的熔点，对应于多晶簇的熔融，接着是棒晶的熔融(163-215℃)。

XV.伊拉非诺2-氨基-2-甲基-丙-1-醇盐(盐XV)。盐XV的熔点为138-161℃，对应于等径晶体和片晶的熔融。

在另一个实施方式中，伊拉非诺盐选自结晶形式的盐I至XV、缓血酸胺、钾和L-精氨酸伊拉非诺盐。在另一个实施方式中，伊拉非诺的盐是结晶形式的伊拉非诺的缓血酸胺盐。

差示扫描量热法或DSC是一种热分析技术，其中根据温度测量增加样品和参考物的温度所需的热量差异。DSC数据显示了针对温度绘制的差示热流。当样品经历热事件时，由于与热事件相关的潜热，它有效地改变了热流，然后反映为峰值或基线漂移。DSC可以用于表征结晶形式的热性能，例如熔融温度或熔融热。因此，本文公开的伊拉非诺盐的熔点可以通过DSC表征。

单晶X射线衍射提供关于结晶形式的原子和键的位置的三维结构信息。然而，由于例如不足的晶体尺寸或难以制备足够质量的晶体用于单晶X射线衍射，因此从结晶形式获得这种结构并非总是可能或可行的。但是，可以从其他固态技术(例如X射线粉末衍射和拉曼光谱)获得结构鉴定信息。这些技术用于生成固态结晶形式的数据。一旦收集了已知结晶形式的数据，就可以将所述数据用于鉴定其他材料中该结晶形式的存在。因此，这些数据有效地表征了结晶形式。例如，X射线粉末衍射图或其一部分可以用作表征结晶形式的指纹。X射线粉末衍射图是x-y图，x轴上为散射角2θ(衍射)并且y轴上为强度。该图内的峰可以用于表征结晶形式。尽管整个衍射图中的峰可以用于表征结晶形式，但更多特征峰的子集也可以用于精确表征结晶形式。数据通常由x轴上的峰的位置而不是y轴上的峰的强度表示，因为峰强度可能会随样品取向而变化。x轴上的峰位置也有可变性。这种可变性有若干种来源，其中之一来自样品制备。

在不同条件下制备的相同结晶材料的样品可能会产生略有不同的衍射图。例如粒度、水分含量、溶剂含量和取向的因素可以影响样品衍射X射线的方式。可变性的另一个来源来自仪器参数。不同的X射线仪器使用不同的参数进行操作，并且这些参数可能导致相同结晶形式的衍射图略有不同。同样，不同的软件包以不同方式处理X射线数据，并且这也导致可变性。这些和其他可变性来源是本领域普通技术人员已知的。由于这些可变性的来源，通常在2θ的峰值之前使用词语“约”来叙述X射线衍射峰。词语“约”包含了这种可变性，这种可变性在大多数采样条件以及大多数数据收集和数据处理条件下会导致峰位置的可变性为约±0.2散射角(2θ)。因此，当一个峰被称为在约10.5散射角(2θ)下时，在大多数采样、数据收集和数据处理条件下，所述峰将出现在10.3(2θ)与10.7(2θ)之间的任何位置。

高效液相色谱法或HPLC是一种用于分离混合物中的化合物，鉴定每种化合物并定量每种化合物的色谱技术。HPLC是本领域已知的确定化合物纯度的技术。

如本领域普通技术人员众所周知的，伊拉非诺的盐I至XV的纯度可以使用HPLC确定。

在本发明的一个优选实施方式中，盐I至XV基本上不含杂质。“基本上不含”在本发明中是指盐I至XV包含少于10％，优选少于5％并且更优选少于2％的一种或多种杂质，甚至更优选少于1％的一种或多种杂质。

在某些实施方式中，基本上不存在杂质是指基本上不存在外来物质，例如成盐的酸、残留溶剂或可能由伊拉非诺的制备和/或分离产生的任何其他杂质。

本发明人获得了具有以下色谱纯度的化合物的盐形式，该纯度以在350nm处测得的面积百分比表示：

-盐I具有99.9％的纯度。

-盐II具有100％的纯度。

-盐III具有99.7％的纯度。

-盐IV具有99.8％的纯度。

本发明的另一方面提供了生产基本上纯的伊拉非诺盐的方法。如本文所用，短语“基本上纯”是指所述盐具有约90重量％、优选约95重量％并且更优选约98重量％的纯度。

通常，在一些实施方式中，用于制备伊拉非诺的基本上纯的盐I至XV的方法包括使伊拉非诺与溶剂接触以形成饱和或接近饱和的溶液。因此，通过在成熟步骤中将伊拉非诺溶解在不同类型的溶剂中来制备此处公开的所有晶体形式。一些盐可以在重结晶步骤之后获得。

所述方法中使用的溶剂可能不同。特别地，溶剂可以是质子溶剂、非质子溶剂或其组合。与溶剂接触的伊拉非诺可以是固体形式(例如粉末)或液体形式(例如在包含助溶剂的溶液中，或在浓缩的油/凝胶/胶中)。所述方法的温度也可能不同。

在本发明的一个特定实施方式中，溶解避光进行。

在一些实施方式中，伊拉非诺的盐，例如选自盐I-XV的盐，是至少部分溶剂化的，例如部分水合的。在其他实施方式中，伊拉非诺的盐，例如选自盐I-XV的盐，不被溶剂化，所述盐特别是无水的。

根据本发明的一个特定实施方式，盐I、II、III和IV是优选的。根据另一个实施方式，结晶形式的盐I、II和IV是优选的。

根据另一个实施方式，本发明涉及伊拉非诺的缓血酸胺盐(盐I)。在另一个实施方式中，本发明涉及结晶形式的伊拉非诺的缓血酸胺盐(盐I)。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含伊拉非诺的盐，例如上述盐，特别是选自盐I-XV的盐。

在一个特定的实施方式中，药物组合物包含盐I、盐II、盐III或盐IV。在另一个特定的实施方式中，药物组合物包含结晶形式的盐I、盐II或盐IV。

在一个更特定的实施方式中，药物组合物包含盐I。

药物组合物可包含上述任何实施方式中的伊拉非诺的盐和药学上可接受的赋形剂。

药物组合物包含治疗有效量的伊拉非诺盐。

可以配制本发明的组合物用于任何类型的施用。例如，可以将组合物配制成用于经口、局部、肠胃外、肠内或通过吸入施用。伊拉非诺的盐可以配制成纯净形式施用，或者与常规药物载体、稀释剂或赋形剂(可以是液体或固体)组合施用。适用的固体载体、稀释剂或赋形剂可尤其用作粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、助流剂、压缩助剂、加工助剂、颜料、甜味剂、防腐剂、悬浮/分散剂、片剂崩解剂、包封材料、成膜剂或涂料、调味剂或印刷油墨。用于制备任何单位剂型的任何材料优选是药学上纯的，并且在使用量上是基本上无毒的。

另外，伊拉非诺的盐可以掺入持续释放制剂和配制物中。在这方面，施用尤其包括通过以下途径施用：口服；静脉内、肌内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮(包括经皮)、经眼、舌下和经颊；局部，包括经眼、皮肤、眼部、直肠和经由吹入经鼻吸入，气雾剂，和经直肠全身施用。

在散剂中，载体、稀释剂或赋形剂可以是细粉状固体，其与细粉状活性成分混合。在片剂中，将活性成分与具有必要压缩特性的载体、稀释剂或赋形剂按合适比例混合，并压制成所需的形状和大小。对于口服治疗性施用，可以将活性化合物与载体、稀释剂或赋形剂结合，并以可摄入片剂、颊片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。在这类治疗上有用的组合物中的一种或多种活性化合物的量优选使得将获得合适的剂量。

液体载体、稀释剂或赋形剂可以用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂等。本发明的活性成分可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体、赋形剂或稀释剂可以含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、颜料、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。

合适的固体载体、稀释剂和赋形剂可以包括例如磷酸钙、二氧化硅、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂、交联羧甲基纤维素碳、阿拉伯胶、预胶化淀粉、交聚维酮、HPMC、聚维酮、二氧化钛、多晶纤维素、偏氢氧化铝、琼脂、黄蓍胶或其混合物。

例如用于经口、局部或肠胃外施用的液体载体、稀释剂和赋形剂的合适实例包括水(特别是含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油(例如分馏椰子油和花生油)或其混合物。

对于肠胃外施用，载体、稀释剂或赋形剂也可以是油性酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。还考虑了无菌液体载体、稀释剂或赋形剂，其以无菌液体形式组合物用于肠胃外施用。可以在适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的水中制备作为游离碱或药理学可接受的盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及油中制备分散体。在正常的储存和使用条件下，这些制剂可能含有防腐剂以防止微生物的生长。

适合于注射用途的药物形式包括例如无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式优选地是无菌且流动的以提供容易的可注射性。它优选在制造和储存条件下是稳定的，并且优选被保存以抵抗例如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体、稀释剂或赋形剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射组合物的延长吸收。

可以通过将药学上适当量的伊拉非诺盐根据需要与上文列举的各种其他成分并入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，可通过将灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法可包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生一种或多种活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。

还公开了制备此类药物组合物的方法，所述方法包括将伊拉非诺的盐与药学上可接受的赋形剂组合。可以根据本发明的方法使用将活性剂与药学上可接受的赋形剂组合的任何可接受的方法，并且本领域普通技术人员可以容易地理解适当的组合技术。在一些实施方式中，组合步骤可以简单到将所需量的伊拉非诺盐加入到例如液体饮料或粉末状饮料混合物的现有物质中即可。在其他实施方式中，组合步骤包括常规地根据制备药物剂型(例如，固体、半固体、液体或适于吸入的形式)、化妆品(例如粉剂、乳膏、乳液或润肤剂)或食品(例如固体、半固体或液体)用于将活性剂与赋形剂混合的任何技术。

在其他方面，本公开提供了用于在有需要的受试者中治疗疾病的治疗方法，其包括向所述受试者施用伊拉非诺的盐。伊拉非诺盐的施用可以通过与本发明药物组合物有关的上述任何途径进行。

受试者是哺乳动物受试者，优选是人类受试者。然而，受试者也可以是任何动物，包括实验动物。因此，如本领域普通技术人员容易理解的，本发明的盐、结晶形式和组合物特别适合施用于任何动物，特别是哺乳动物，并且包括但决不限于人类，家畜如猫科动物或犬科动物受试者，农场动物如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪科动物受试者，野生动物(无论在野外还是在动物园中)，研究用动物如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、猪、狗、猫等，禽类如鸡、火鸡、鸣禽等，即用于兽医学用途。

本发明的盐可以用于治疗多种疾病或疾患的方法中。特别是，将本发明的伊拉非诺的盐施用于有需要的受试者，以治疗WO 2004/005233、WO 2004/005243、WO 2011/064350或WO 2014/111584中公开的任何疾病或疾患。

特别是，伊拉非诺的盐可用于治疗疾病，例如免疫性、炎性、代谢性、纤维化和胆汁淤积性疾病。在一个特定的实施方式中，所述疾病选自：代谢性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，药物引起的肝病，酒精引起的肝病，感染因子引起的肝病，炎症性肝病，免疫系统功能障碍介导的肝病，血脂异常，心血管疾病，再狭窄，X综合征，代谢综合征，糖尿病，肥胖症，高血压，慢性胆管病如原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆源性胆管炎(PBC)，胆道闭锁，进行性3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)，炎症性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，瘢痕疙瘩，老年性心肌梗塞，硬皮病/全身性硬化症，炎症性疾病，神经退行性疾病，癌症，肝癌，肝细胞癌，胃肠道癌，胃癌，与神经纤维瘤病相关的脑膜瘤，胰腺神经内分泌肿瘤，胰腺外分泌肿瘤，白血病，骨髓增生/骨髓增生异常疾病，肥大细胞增多症，皮肤纤维肉瘤，实体瘤包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或结直肠癌、前列腺癌，任何来源的肝纤维化或肝硬化，代谢性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，NAFLD引起的纤维化或肝硬化，NASH引起的纤维化或肝硬化，酒精引起的肝纤维化或肝硬化，药物引起的肝纤维化或肝硬化，感染因子引起的肝纤维化或肝硬化，寄生虫感染引起的肝纤维化或肝硬化，细菌感染引起的肝纤维化或肝硬化，病毒感染引起的纤维化或肝硬化，HBV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，双重HCV和HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，放射线或化学疗法引起的纤维化或肝硬化，胆道纤维化，由于任何慢性胆汁淤积性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，任何病因的肠道纤维化，克罗恩病引起的纤维化，溃疡性结肠炎引起的纤维化，肠道(例如小肠)纤维化，结肠纤维化，胃纤维化，皮肤纤维化，表皮纤维化，内皮纤维化，由于硬皮病/全身性硬化引起的皮肤纤维化，肺纤维化，继发于慢性炎症性气道疾病如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者肺纤维化、肺结核的肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)，心脏纤维化，肾脏纤维化，肾源性全身纤维化，肌肉纤维化，软组织(例如纵隔或腹膜后)纤维化，骨髓纤维化，关节纤维化，腱纤维化，软骨纤维化，胰腺纤维化，子宫纤维化，神经系统纤维化，睾丸纤维化，卵巢纤维化，肾上腺纤维化，动脉纤维化，静脉纤维化，眼纤维化，心内膜纤维化，纵隔纤维化，骨髓纤维化，腹膜后纤维化，进行性大规模纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)，增生性纤维化，赘生性纤维化，植入物周围纤维化和石棉沉着症，关节纤维化，粘连性关节囊炎。

在一个特定的实施方式中，所述疾病选自：代谢性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，药物引起的肝病，酒精引起的肝病，感染因子引起的肝病，炎症性肝病，免疫系统功能障碍介导的肝病，血脂异常，心血管疾病，再狭窄，X综合征，代谢综合征，糖尿病，肥胖症，高血压，慢性胆管病如原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆源性胆管炎(PBC)，胆道闭锁，进行性3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)，炎症性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，肝癌，肝细胞癌，胃肠道癌，胃癌，结直肠癌，代谢性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，NAFLD引起的纤维化或肝硬化，NASH引起的纤维化或肝硬化，酒精引起的肝纤维化或肝硬化，药物引起的肝纤维化或肝硬化，感染因子引起的肝纤维化或肝硬化，寄生虫感染引起的肝纤维化或肝硬化，细菌感染引起的肝纤维化或肝硬化，病毒感染引起的纤维化或肝硬化，HBV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV和HIV双重感染引起的肝纤维化或肝硬化，放射线或化学疗法引起的纤维化或肝硬化，胆道纤维化，由于任何慢性胆汁淤积性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，任何病因的肠道纤维化，克罗恩病引起的纤维化，溃疡性结肠炎引起的纤维化，肠(例如小肠)纤维化，结肠纤维化，胃纤维化，肺纤维化，继发于慢性炎症性气道疾病如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者肺纤维化、肺结核的肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)。

在另一方面，伊拉非诺盐用于抑制成纤维细胞的增殖和/或活化，所述成纤维细胞负责胶原纤维的产生和/或负责细胞外基质的产生。

根据本发明，术语“自身免疫性疾病”用于表示由于身体对体内正常存在的物质和组织的异常免疫应答而产生的状况。所述疾病可能仅限于某些器官(例如在I型糖尿病或自身免疫性甲状腺炎中)，或者涉及不同地方的特定组织(例如在古德帕斯彻病(Goodpasture's disease)中对肺和肾脏基底膜的影响)。

术语“炎症”用于表示由涉及宿主细胞、血管、蛋白质和其他介体的保护性反应产生的状况，所述反应可以用于消除细胞/组织损伤的原因，以及由原始损伤产生的坏死细胞/组织，并启动修复过程。炎症反应可能表现为疼痛、发热、发红、肿胀、血管扩张、血流量增加和功能丧失。

根据本发明，术语“纤维化”、“纤维化疾病”、“纤维化病症”及其偏差表示在器官或组织中纤维结缔组织过度沉积的病理状况。更具体地说，纤维化是一种病理过程，其包括持续的纤维化瘢痕形成和结缔组织对细胞外基质的过度产生，作为对组织损伤的应答。从生理上讲，结缔组织的沉积可能会破坏基础器官或组织的结构和功能。

根据本发明，纤维化或纤维化病症可能与任何器官或组织纤维化相关。特定器官纤维化的说明性非限制性实例包括肝、肠、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、阴茎、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后)、骨髓、关节或胃的纤维化，特别是肝、肾、皮肤、表皮、内皮、肌肉、腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、肠(例如小肠)、胆道、软组织(例如纵隔或腹膜后)、骨髓、关节、眼睛或胃的纤维化。

根据本发明，术语“胆汁淤积”或“胆汁淤积性疾病”或“胆汁淤积性病症”及其偏差表示由于肝细胞分泌受损或由于胆汁流动通过肝内或肝外胆管的阻塞而引起的胆汁流量减少所定义的病理状况。因此，胆汁淤积的临床定义是通常排泄到胆汁中的物质滞留的任何状况。

在一个特定的实施方式中，纤维化病症选自：肝、肠、肺、心脏、肾脏、肌肉、皮肤、软组织(例如纵隔或腹膜后)、骨髓、肠和关节(例如膝盖、肩膀或其他关节)的纤维化。

在一个特定的实施方式中，纤维化病症选自：肝、肺、皮肤、肾脏和肠纤维化。

在本发明的一个更特定的实施方式中，所治疗的纤维化病症选自以下纤维化病症的非详尽清单：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肺纤维化，特发性肺纤维化，皮肤纤维化，眼纤维化(例如荚膜纤维化)，心肌内膜纤维化，纵隔纤维化，骨髓纤维化，腹膜后纤维化，进行性大规模纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)，增生性纤维化，赘生性纤维化，继发于慢性炎症性气道疾病(COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者肺、肺结核)的肺纤维化，酒精或药物引起的肝纤维化，肝硬化，感染引起的肝纤维化，放射线或化学疗法引起的纤维化，肾源性全身纤维化，克罗恩病，溃疡性结肠炎，瘢痕疙瘩，老年性心肌梗塞，硬皮病/全身性硬化，关节纤维化，某些形式的粘连性关节囊炎，慢性纤维化胆管病如原发性硬化性胆管炎(PSC)和原发性胆源性胆管炎(PBC)，胆道闭锁，进行性3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)，植入物周围纤维化和石棉沉着症。

胆汁淤积被定义为由于肝细胞分泌受损(肝细胞胆汁淤积)或通过肝内或肝外胆管的胆汁流动阻塞(阻塞性胆汁淤积)而导致的胆汁流量减少。在临床实践中，胆汁淤积是任何从肝脏中胆汁流动减慢或受阻的状况。根据本发明的一个特定实施方式，胆汁淤积性疾病选自：原发性胆汁性胆管炎(PBC)，原发性硬化性胆管炎(PSC)，妊娠肝内胆汁淤积症，进行性家族性肝内胆汁淤积症，胆道闭锁，胆石症，感染性胆管炎，与朗格汉斯细胞(Langerhans cell)组织细胞增生症相关的胆管炎，阿拉吉勒综合征(Alagillesyndrome)，非综合征性导管狭窄，药物引起的胆汁淤积以及全胃肠外营养相关的胆汁淤积。在一个优选的实施方式中，胆汁淤积性疾病是PBC或PSC，特别是PBC。

炎性疾病、纤维化疾病、代谢性疾病和胆汁淤积性疾病的实例包括代谢性肝病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，药物引起的肝病，酒精引起的肝病，感染因子引起的肝病，炎症性肝病，免疫系统功能障碍介导的肝病，血脂异常，心血管疾病，再狭窄，X综合征，代谢综合征，糖尿病，肥胖症，高血压，慢性胆管病如原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆源性胆管炎(PBC)，胆道闭锁，进行性3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)，炎症性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，瘢痕疙瘩，老年性心肌梗塞，硬皮病/全身性硬化症，炎症性疾病，神经退行性疾病，癌症，肝癌，肝细胞癌，胃肠道癌，胃癌，与神经纤维瘤病相关的脑膜瘤，胰腺神经内分泌肿瘤，胰腺外分泌肿瘤，白血病，骨髓增生/骨髓增生异常疾病，肥大细胞增多症，皮肤纤维肉瘤，实体瘤包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌或结直肠癌、前列腺癌，任何来源的肝纤维化或肝硬化，代谢性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，NAFLD引起的纤维化或肝硬化，NASH引起的纤维化或肝硬化，酒精引起的肝纤维化或肝硬化，药物引起的肝纤维化或肝硬化，感染因子引起的肝纤维化或肝硬化，寄生虫感染引起的肝纤维化或肝硬化，细菌感染引起的肝纤维化或肝硬化，病毒感染引起的纤维化或肝硬化，HBV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，双重HCV和HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，放射线或化学疗法引起的纤维化或肝硬化，胆道纤维化，由于任何慢性胆汁淤积性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，任何病因的肠道纤维化，克罗恩病引起的纤维化，溃疡性结肠炎引起的纤维化，肠道(例如小肠)纤维化，结肠纤维化，胃纤维化，皮肤纤维化，表皮纤维化，内皮纤维化，由于硬皮病/全身性硬化引起的皮肤纤维化，肺纤维化，继发于慢性炎症性气道疾病如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者肺纤维化、肺结核的肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化(IPF)，心脏纤维化，肾脏纤维化，肾源性全身纤维化，肌肉纤维化，软组织(例如纵隔或腹膜后)纤维化，骨髓纤维化，关节纤维化，腱纤维化，软骨纤维化，胰腺纤维化，子宫纤维化，神经系统纤维化，睾丸纤维化，卵巢纤维化，肾上腺纤维化，动脉纤维化，静脉纤维化，眼纤维化，心内膜纤维化，纵隔纤维化，骨髓纤维化，腹膜后纤维化，进行性大规模纤维化(煤矿工人尘肺的并发症)，增生性纤维化，赘生性纤维化，植入物周围纤维化和石棉沉着症，关节纤维化，粘连性关节囊炎。

特别是，所述疾病选自：代谢性肝病，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，药物引起的肝病，酒精引起的肝病，感染因子引起的肝脏疾病，炎症性肝病，免疫系统功能障碍介导的肝病，血脂异常，心血管疾病，再狭窄，X综合征，代谢综合征，糖尿病，肥胖症，高血压，慢性胆管病如原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆管性胆管炎(PBC)，胆道闭锁，进行性3型家族性肝内胆汁淤积症(PFIC3)，炎症性肠病，克罗恩病，溃疡性结肠炎，肝癌，肝细胞癌，胃肠道癌，胃癌，结直肠癌，代谢性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，NAFLD引起的纤维化或肝硬化，NASH引起的纤维化或肝硬化，酒精引起的肝纤维化或肝硬化，药物引起的肝纤维化或肝硬化，感染因子引起的肝纤维化或肝硬化，寄生虫感染引起的肝纤维化或肝硬化，细菌感染引起的肝纤维化或肝硬化，病毒感染引起的肝纤维化或肝硬化，HBV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HIV感染引起的肝纤维化或肝硬化，HCV和HIV双重感染引起的肝纤维化或肝硬化，放射线或化学疗法引起的纤维化或肝硬化，胆道纤维化，由于任何慢性胆汁淤积性疾病引起的肝纤维化或肝硬化，任何病因的肠道纤维化，克罗恩病引起的纤维化，溃疡性结肠炎引起的纤维化，肠(例如小肠)纤维化，结肠纤维化，胃纤维化，肺纤维化，继发于慢性炎症性气道疾病如COPD、哮喘、肺气肿、吸烟者肺纤维化的肺纤维化。

可以基于与炎性、代谢性、纤维化和胆汁淤积性疾病相关的几种标准例如先前的药物治疗、相关的病理学、基因型、暴露于危险因素、病毒感染以及可以通过成像方法和免疫学、生化、酶促、化学或核酸检测方法评估的任何其他相关生物标志物，来选择根据本发明待治疗的受试者。

通过参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例详细阐述了本发明的盐形式的制备。

实施例

HPLC分析在Water柱Waters，柱Phenomenex Synergi Polar-RP，4.6×150mm上进行。表1显示了用于分析盐样品，特别是确定母体含量以确认化学计量的HPLC参数。

表1：HPLC条件

样品的制备：

将约1mg的固体再结晶残留物放入10mL容量瓶中，然后用MeOH溶解至10ML。将样品溶于MeOH后，立即对溶液进行处理，包装和避光保存。

结果：

所有结晶样品(形式I至IV)对应于伊拉非诺盐，纯度百分比为至少99.7％。

使用铜反阴极、单晶硅样品架和Lynxeye检测器，在θ-θ配置的BrükerAXS D2Phaser上进行X射线粉末衍射(XRPD)分析。表2中描述了用于获取X射线图的仪器操作条件。

表2：

样品的制备：

将粉末样品以避免优选取向(非随机取向晶体)并确保试样表面的平面度的方式分散在硅样品架上。

形式I、II和IV(无水和脱水)的X射线衍射分别显示在图20、图21和图22中。

通过光学显微镜检查表征是在配备有数码相机和电动载物台的LEICA DMIRB显微镜上进行的。显微镜图案的采集是通过Microvision Instruments图像分析站进行的。

样品制备：

将几毫克的测试样品放在具有硅油的显微镜玻璃板上，用显微镜载玻片覆盖，通过施加在载玻片上的软压力分散，然后进行分析。

用交叉偏振光记录各种图像。

形式I的光学显微镜检查示于图1中。形式II的光学显微镜检查示于图2a、图2b和图2c中。形式III的光学显微镜检查示于图3中。形式IV的光学显微镜检查示于图4a和图4b中。形式V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV和XV的光学显微镜检查分别示于图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14和图15中。

差示扫描量热仪(DSC)分析在Q1000 TA Instruments分析仪上进行。样品在非密闭的铝制容器中称重，然后压接并放入量热仪烘箱中。将样品从室温加热到200℃。使用的匀变升温速率为5℃/分钟，并且烘箱在50mL/min流速下连续进行氮气吹扫(空气液化气，Alphagaz N2品质)。

表3中描述了用于DSC曲线获取的仪器操作条件。

形式I、II、III和IV的DSC热分析图分别示于图16、图17、图18和图19中。

表3：

伊拉非诺盐粉末根据ICH准则Q1B通过暴露于紫外光而受压，这对应于在HeraeusSUNTEST CPS设备上最大暴露于紫外光下17h。

对于每种伊拉非诺盐，将约15mg的试样放置在石英池中。为了在仅由于SUNTEST装置室内的温度引起的降解与仅由于紫外光暴露引起的降解之间产生差异，也将避光的第二伊拉非诺盐样品放置在SUNTEST室中。然后通过HPLC分析所有样品。

为了证明每种盐与母体化合物相比任何光稳定性的改善，在与针对伊拉非诺盐样品所述条件相同的条件下，通过暴露于紫外光也可对伊拉非诺游离酸施压。

在pH 1、pH 3、pH 5和pH 7.4的缓冲水溶液中测定化合物的溶解性。

通过将过量的活性成分加入到给定体积的测试介质中来获得饱和。在避光的条件下，于20℃通过轨道搅拌在24小时内搅拌悬浮液。

对于伊拉非诺游离酸和在所有介质中，在24小时后评估可溶性级分。

对于伊拉非诺缓血酸胺盐和在所有介质中，在30分钟、1小时、2小时和24小时后评估可溶性级分，以确定所研究盐可达到的最大溶解性水平。

在30分钟、1小时、2小时和/或24小时后，通过离心分离上清液，并在溶剂混合物中稀释，使其注入色谱系统。通过HPLC(外部标准化)确定每种介质在溶液中的浓度(表示为母体浓度)。

24小时后，对通过离心分离的不溶性级分进行XRPD分析。

制备测试介质：

-pH 1HCl/KCl缓冲液：在100mL容量瓶中，用去离子水将0.373g KCl和13.4ml HCl的混合物补充至100mL。

-pH 3柠檬酸盐缓冲液：将1.051g单水合柠檬酸溶解在250mL去离子水中。用NaOH将pH调节至3。

-pH 5柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液：制备溶液I：用去离子水将100mL容量瓶中的2.8392g Na2HPO4补充至100mL。制备溶液II：用去离子水将100mL容量瓶中的2.1004g单水合柠檬酸补充至100mL。向48.5mL溶液II中加入51.5mL溶液I。

-pH 7.4磷酸盐缓冲液：用去离子水将1L容量瓶中的38g Na2HPO4,12H2O和3.8gNa2HPO4,2H2O的混合物补充至1L。

宏观观察

可以分离出若干固体残留物，用于伊拉非诺与所有抗衡离子的缔合。

对于每个测试的抗衡离子，观察到的固体残留物没有都呈现出相同的特性(颜色、大小/数量、固体残留物的形状以及晶体的形态(如果可见))。考虑这些特性以为每个抗衡离子选择要进一步表征的相关样品。

当与伊拉非诺缔合时，4种碱(苯乙胺、L-精氨酸、氢氧化钾和氢氧化钠)会导致在若干结晶介质中形成明显的固体残留物。

另外11种将物质带入伊拉非诺的抗衡离子的缔合会在某些结晶介质中导致固体残留物，但固体物质量较低，或者仅导致液体/玻璃状残留物，这些玻璃状残留物中仅存在少量固体。

分离固体的颜色

重要的是要注意，当与伊拉非诺缔合时，令人惊讶的是，15种测试碱中的5种(苯乙胺、苄星、L-精氨酸、氢氧化钾和氢氧化钠)产生白色固体，并在若干结晶介质中具有大量的物质。

光学显微镜检查

选择一定数量的“抗衡离子/结晶介质”对，以便在交叉偏振光下通过光学显微镜检查观察。可以比较不同样品之间的晶体形态(当观察到明确界限的晶体形状时)。在当前情况下，对不同样品(固体残留物)进行光学显微镜分析可导致鉴定出所有观测样品中充分结晶的物质。

其他物理表征

已对每种潜在的目标盐命中物进行了进一步的光谱和熔融温度范围比较，以最终确定所有测试的抗衡离子之间的排序。

对于热台显微镜实验，所分析样品的热行为总结在表4中(也对从各种介质中单独结晶的伊拉非诺样品进行了分析，以用于比较目的)。

根据WO2011144579中所述的方法实现了伊拉非诺(以下实验部分中的“化合物”)的合成，然后将粗物质在异丙醇中重结晶。

表4呈现了所测试的碱(抗衡离子)以及相应的反应物及其供应商的清单。

表4：

向1020.13mg的伊拉非诺游离酸中加入321.45mg的量的缓血酸胺，对应于1:1化学计量。加入4.05mL乙醇，并在避光下在70℃搅拌悬浮液，直到20分钟内完全溶解。然后加入54mL乙酸乙酯。将所述溶液在70℃下搅拌，并且在60分钟内(始终避光)发生结晶：当在交叉偏振光下观察时，聚集的白色颗粒出现双折射。

使缓血酸胺盐的悬浮液在室温下(避光)冷却，并通过过滤除去上清液。在过滤期间，固体材料用几毫升的第一滤液洗涤一次(送回到结晶气球中以去除固体残留物)，然后用几毫升的乙酸乙酯洗涤一次。最后将粉末在真空下于90℃干燥2小时。

所得产率为约92％(回收约1.3g)。

分离样品的显微镜观察结果报告在图1上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的高双折射表明样品充分结晶。

结晶的样品热分析图仅显示一个强烈的吸热事件，该事件是在149℃的起始温度下检测到的，该温度对应于伊拉非诺缓血酸胺盐的熔点。

HPLC曲线(图24)显示，与参考母体化合物相比，分离固体中的活性成分没有降解。批纯度为99.96％。

图20显示了盐I(在EtOH/AcEt中结晶)的X射线衍射曲线，并且表5列出了图20衍射图的XRPD峰位置的数值。

表5：

根据XRPD和HPLC结果，我们可以得出结论：伊拉非诺:缓血酸胺的化学计量为1:1。

在不同的pH下进行了不同的溶解度测试。在pH 7.4下，伊拉非诺缓血酸胺盐似乎比伊拉非诺更易溶(参见表6)。

表6：

将42.29mg的量的氢氧化钾加入到约243mg的伊拉非诺游离酸中，对应于1:1的化学计量。为了溶解，加入4mL乙醇(在70℃下在旋转蒸发仪上搅拌)。连续搅拌几分钟以完成溶解。然后将溶剂(乙醇)在70℃蒸发至干，形成膜。将所述膜用4mL乙腈重悬，导致立即结晶。然后将所得的悬浮液在低于环境温度下保持2小时，以允许更重要的结晶。从烧瓶中移出上清液，并用乙腈洗涤样品两次，然后将粉末最终在动态真空下于90℃干燥约1小时。

所得产率为约75％。

通过外部标准化确定，通过HPLC测得该盐样品中伊拉非诺的百分比为89.6％，与目标伊拉非诺钾盐中的91.0％理论伊拉非诺级分没有显著差异(图25)。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图2c上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

结晶样品热分析图显示两个主要事件(参见图15)：

-在起始温度为185℃时检测到的宽而小的吸热转变可能对应于与焓弛豫相关的玻璃化转变或固-固转变；

-检测到强烈吸热事件，起始温度为247℃；该第二事件很可能对应于伊拉非诺钾盐的熔融。

图21示出了盐II(在CH3CN中结晶)的X射线衍射曲线，并且表7列出了图21衍射图的XRPD峰位置的数值。

表7：

根据XRPD和HPLC结果，我们可以得出结论：伊拉非诺:钾的化学计量为1:1。

首先将约103mg的伊拉非诺游离酸溶解在1mL丙酮中(在50℃下在旋转蒸发仪上搅拌)。然后加入体积为268μL的1N氢氧化钠，对应于1:1的化学计量，并保持搅拌几分钟。使所得溶液冷却至室温，然后保持在低于环境温度。4天的储存期后，观察到大量结晶。

从烧瓶中除去上清液，最后将粉末在动态真空下于90℃干燥约2小时。所得产率为约93％。

通过HPLC测得该盐样品中伊拉非诺的百分比为87.3％。HPLC曲线显示，与参考母体化合物相比，分离固体中的活性成分没有降解(图26)。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图3上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的高双折射表明样品充分结晶。

结晶样品热分析图显示三个主要事件(参见图16)：

-在起始温度为22℃时检测到宽的吸热转变，这对应于干燥的结束或散装物上吸附水的损失；

-在起始温度为209℃时检测到小放热事件，这可对应于盐的无定形部分结晶为结晶盐形式或对应于固-固转变；

-在起始温度为261℃时检测到强烈的吸热事件；该第三事件对应于伊拉非诺钠盐的熔融

根据DSC和HPLC结果，我们可以得出结论：伊拉非诺:钠的化学计量为1:1。

一般程序：向约214mg的伊拉非诺游离酸中加入97.10mg的量的L-精氨酸，对应于1:1的化学计量。为了溶解，加入6mL的丙酮和1.5mL的水(在50℃下在旋转蒸发仪上搅拌)。在两种化合物完全溶解之前，发生重结晶并出现白色和片状固体残留物。

使所得的悬浮液冷却至室温，然后用丙酮和1,4-二

最后通过真空过滤分离出粉末。

所得产率为约84％。

所产生的样品的显微镜照片报告在图4a上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

结晶样品热分析图显示3个吸热事件，表明该批次含有天然的伊拉非诺游离酸。

继续搅拌至30分钟以发生更重要的结晶。最后通过真空过滤分离出粉末。

所得产率为约82％。

通过HPLC测得该盐样品中伊拉非诺的百分比为68％，与目标伊拉非诺精氨酸盐中的71.1％理论伊拉非诺级分没有显著差异。HPLC曲线显示，与参考母体化合物相比，分离固体中的活性成分没有降解(图26)。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图4b上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

结晶样品热分析图仅显示一个强烈的吸热事件，该事件在167℃的起始温度下检测到，其对应于伊拉非诺精氨酸盐的热分解(不稳定的信号)所伴随的熔融。

图22示出了盐IV(在丙酮/H2O中结晶)的X射线衍射曲线，并且表8列出了图22衍射图的XRPD峰位置的数值。

表8：

根据DSC和HPLC结果，我们可以得出结论：伊拉非诺:精氨酸的化学计量为1:1。

将约20mg的实施例4a的样品送入动态气相吸附(DVS)循环，在解吸阶段终止于60％RH。然后将相对湿度保持在60％，以便可以表征生成的水合物形式。

将为了获得水合分析样品的水吸附实验与在无水盐形式批次(实施例4a)上进行的第一个DVS循环进行比较，证实已经发生了相同的转化。

所分析的水合伊拉非诺L-精氨酸盐粉末显示出几个衍射峰，表明所研究的物质是结晶的。

图23示出了盐IV二水合物(在丙酮/H2O中结晶)的X射线衍射曲线，并且表9列出了图23衍射图的XRPD峰位置的数值。

表9：

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的苯乙胺在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图5上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的苄星在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图6上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的乙醇胺在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图7上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的葡甲胺在丙酮中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图8上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的甘氨酸在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图9上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的叔丁胺在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图10上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的L-赖氨酸在EtOH/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图11上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的胆碱-OH在丙酮/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图12上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的羟乙基-吡咯烷在THF/H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图13上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的氢氧化镁在H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图14上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

使伊拉非诺游离酸(1当量)与1摩尔当量的2-氨基-2-甲基-丙-1-醇在H2O中结晶。

所产生的样品的显微镜观察结果报告在图15上。在交叉偏振器与分析仪之间观察到的颗粒的双折射表明样品已结晶。

实施例16：光稳定性

根据上述光稳定性方案，通过暴露于紫外光对结晶样品施压。

进行了不同的光稳定性测试。下表10显示了从伊拉非诺游离酸和伊拉非诺盐获得的结果。

在测试条件下暴露于紫外光17小时后，仅4％降解，相比于伊拉非诺游离酸(27％降解)、伊拉非诺钠盐(形式III；89％降解)、伊拉非诺钾盐(形式II；13％降解)和伊拉非诺缓血酸胺盐(形式I；10％降解)，发现伊拉非诺L-精氨酸盐(形式IV；实施例4a)是最稳定的测试散装物。

所测试的伊拉非诺L-精氨酸盐(形式IV)、伊拉非诺钾盐(形式II)和伊拉非诺缓血酸胺盐(形式I)与伊拉非诺游离酸相比，呈现光稳定性的显著改善。

将化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO，Sigma Aldrich目录#276855)中。SB525334(Sigma Aldrich目录#S8822)、克莱拉尼(Crenolanib)(Selleckchem目录#S2730)、TGFβ1(PeproTech目录#100-21)、PDGF-BB(Peprotech目录#100-14B)和罗格列酮(Rosiglitazone)(Yick-Vic Chemicals&Pharmaceuticals目录#PH-4472B)可商购获得。非诺贝酸和GW501516由Genfit合成。

将猴肾COS-7细胞在37℃下在5％CO

将人原代肝星状细胞(hHSC)(ScienCell,Innoprot)在STeCM培养基(ScienCell目录#5301)中进行培养，该培养基补充有2％胎牛血清(FBS，ScienCell目录#0010)、1％青霉素/链霉素(ScienCell目录#0503)和星状细胞生长补充剂(SteCGS；ScienCell目录#5352)。细胞培养瓶用Poly-L赖氨酸(Sigma目录#P4707)包被，以获得更好的粘附性。

如上所述，在标准条件下培养hHSC。随后将细胞以每孔1.2×10

如上所述，在标准条件下培养hHSC。随后将细胞以每孔7×10

使用夹心ELISA测量α-SMA的水平。简而言之，首先将ELISA板的孔在4℃下用捕获抗体(小鼠单克隆抗ACTA2，Abnova)进行包被过夜。在PBS+0.2％Tween 20中洗涤3次后，加入由PBS+0.2％BSA组成的封闭溶液一小时，接着进行另一个洗涤循环。将细胞裂解物转移至孔中，以在室温下与捕获抗体结合2小时的时期。在洗涤程序后，在室温下加入检测抗体(生物素化的小鼠单克隆抗ACTA2，Abnova)持续2小时，接着洗涤3次。为了进行检测，首先在室温下应用HRP缀合的链霉亲和素(R&D Systems目录#DY998)持续30分钟。洗涤后，加入HRP底物TMB(BD Bioscience，目录#555214)，并在室温下在黑暗中温育7分钟。氧化后，TMB形成水溶性蓝色反应产物，在添加硫酸时变为黄色(溶解停止)，从而可以使用分光光度计精确测量450nm处的强度。显色与裂解物中存在的α-SMA量成正比。

按照制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用1x RT缓冲液(Invitrogen)中的M-MLV RT(Moloney鼠类白血病病毒逆转录酶)(Invitrogen目录#28025)、0.5mM DTT(Invitrogen)、0.18mM dNTPs(Promega)、200ng pdN6(Amersham)和30URNA酶抑制剂(Promega)将总RNA(体外样品为200ng)逆转录为cDNA。

然后使用CFX96 Touch

表11：人类引物

使用36B4基因的表达作为人类样品中的参考对表达水平进行归一化。

对于每个基因，通过选择最佳点(至少三个点)绘制标准曲线，以使PCR反应效率接近100％并且相关系数接近1。使用标准曲线方程式确定管家基因和目标基因的表达水平(考虑到每个目标基因的特定PCR效率)。

表12和表13显示根据本发明的化合物对三种PPAR同工型(分别为人类和鼠类)具有活性，类似于游离酸伊拉非诺。

表12：

表13：

PDGF的过度活性与若干人类病症相关，包括器官纤维化和肿瘤发生。PDGF通过刺激成肌纤维细胞的增殖、迁移和存活，在成肌纤维细胞的扩增中起关键作用。出乎意料的是，我们的实验数据表明，根据本发明的化合物以剂量依赖的方式抑制了通过用PDGF-BB的处理诱导的hHSC的增殖(图28)。如图28所示，根据本发明的化合物的功效与选择性PDGFR抑制剂克莱拉尼的功效相当。

分化的成肌纤维细胞的异常持续存在是许多纤维化疾病的特征。肝损伤后，静止的HSC经历活化过程，其特征是分化为(α-SMA)阳性的成肌纤维细胞。根据本发明的化合物减少了TGFβ1活化的hHSC中的α-SMA蛋白分泌(图29)或基因表达。通过根据本发明的化合物降低了TGFβ1刺激的其他标志物，包括细胞外基质胶原蛋白1A1(COL1A1)(图30)和基质胶原蛋白4A1(COL4A1)(图31)。毒性测定证实α-SMA的降低水平不是由于hHSC的毒性或凋亡。

总之，本申请人已证实根据本发明的化合物的抗纤维化活性。这些结果表明，根据本发明的化合物可以在多种类型的纤维化疾病中提供治疗益处。

序列表

<110> 基恩菲特公司（GENFIT）

<120> 伊拉非诺盐

<130> B2810PC00

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 1

catgctcaac atctccccct tctcc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 2

gggaaggtgt aatccgtctc cacag 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 3

aatggtgctc ctggtattgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

accaggttca ccgctgttac 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

catgctcaac atctccccct tctcc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

catgctcaac atctccccct tctcc 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

gttggtctac cgggactcaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

gttcacctct gatcccctga 20