检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法

技术领域

本发明属于电化学发光检测领域，涉及一种检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，简称ENR)，又称乙基环丙沙星、恩氟沙星，属于氟喹诺酮类化学合成抑菌剂。恩诺沙星被国家指定为动物专用药，它因具有抗菌性强、作用迅速、体内分布广及与其他抗生素间无交叉耐药性等特点而在动物和水产养殖业中被广泛应用。目前恩诺沙星己经列为兽药残留监控的重点，2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所有食品动物的肌肉、脂肪中最高残留限量为100μg/kg，在所有食品动物的肝、肾中最高残留限量为200μg/kg，欧盟也规定了动物源性食品中ENR的最大残留检测限为0.3μg/g。由于过量使用这种药物，使得其在动物体内大量的积累、残留，使得动物体的排泄物中也存在该物质，并且对周围的环境也产生了影响。其中水资源就遭受了严重的污染。然而，一旦水资源受到污染，那么人类的健康、公共安全和野外环境的安全都将受到威胁，因此需要一种高效准确地方法来监测水源的安全。

目前，已经被报道的测定恩诺沙星的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)，毛细血管电泳法(CEP)，荧光光度法(FL)，化学发光免疫分析法(CLIA)，酶联免疫法(ELISA)等。但这些分析方法存在很多局限性，比如，高效液相色谱法与毛细血管电泳法具有较高的准确度，但仪器昂贵，分析灵敏度低；荧光光度法与化学发光法虽然具有较高的灵敏度，但是其需要特殊试剂且方法的选择性较差；而酶联免疫法，制备的抗体与多种残留药物进行反应，不宜作为单一检测方法，仅适用于对大量样品的快速筛选与检测；而免疫分析方法均是基于抗原-抗体特异性识别反应建立起来的，其原料抗体生产成本高、免疫活性易受离子强度、pH等环境因素影响。核酸适配体(Aptamer)，又称为模拟抗体，合成简单快速、成本低、选择性好、性质稳定且易于修饰标记，是一种新型的优良抗体替代识别元件。因此，开发一种简单快速、选择性好的检测恩诺沙星的方法是必要且极其重要的。

电化学发光(ECL)也称为电致化学发光，是一种将电能转化为光能的分析技术，无需引入外部光源，在光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，并建立其与待测物关系从而实现微量分析的一种方法。它是化学发光和电化学方法的结合，具有操作简便、灵敏度高、背景低和检测时间短等优点。将电化学发光法与生物识别分子结合起来，可显著提高分析检测灵敏度和选择性，特别适用于被测物浓度低，组分复杂，干扰物多的环境样品。

发明内容

本发明的目的在于针对恩诺沙星检测现有技术的不足，提供一种检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法。本发明采用湿化学法制备碳化钛-溴化银纳米复合材料(Ti

为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：

一种检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器，所述电化学发光适配体传感器是由含有3’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATTTCA GGG GGA-5’COOH碱基序列的适配体负载于Ti

如上所述的检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用湿化学法制备Ti

(2)将玻碳电极抛光，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干，获得前处理后的玻碳电极待用；用移液枪移取步骤(1)制得的分散液滴涂在前处理后的玻碳电极表面，自然晾干，得到所述Ti

进一步的，步骤(1)所得分散液中Ti

进一步的，所述步骤(2)中将适配体负载在Ti

进一步的，所述适配体溶液中适配体的浓度为2.0～5.0μmol/L，更进一步优选2.5μmol/L。

一种检测恩诺沙星的方法，所述方法包括如下步骤：

以如上所述的检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极组成三电极体系，待测样品中的恩诺沙星被定量捕捉到传感器的表面，通过产生的发光信号进行检测。

进一步的，还包括如下步骤：

步骤1，含K

用pH为7.0～8.0的0.1mol/L的PBS缓冲溶液配制含0.05～0.1mol/L K

步骤2，不同浓度的恩诺沙星标准溶液的配制：首先配制恩诺沙星溶液，然后将恩诺沙星溶液加入步骤1中的含K

步骤3，标准曲线的绘制：

将所述电化学发光适配体传感器置于步骤2配制的不同浓度的恩诺沙星标准溶液中浸泡相同时间，使电化学发光适配体传感器结合恩诺沙星，然后取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步骤1中的含K

步骤4，待测样品中恩诺沙星的检测

所述样品先过滤再用步骤1中的含K

进一步的，步骤3中所述的浸泡时间为20～40min，更进一步优选30min。

进一步的，步骤1中PBS缓冲溶液的pH为7.4，配制的含K

步骤3中所述的浸泡时间为30min，光电倍增管高压800V，扫速0.1V/s。

相比于现有技术，本发明的有益效果有：

本发明设计了一种基于二维层状材料Ti

附图说明

图1为实施例1中所构建的电化学发光适配体传感器在与不同浓度的恩诺沙星结合后的ECL响应图，其中恩诺沙星的浓度从左到右依次为：(a)0；(b)1×10

图2为实施例1加入恩诺沙星前后发光强度的差值与恩诺沙星浓度对数值的标准曲线；

图3是实施例1中制备的Ti

具体实施方式

以下实施例中，含有3’-CCC ATC AGG GGG CTA GGC TAACAC GGT TCG GCT CTCTGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-5’COOH碱基序列的适配体购自生工生物工程(上海)股份有限公司，将该适配体负载在Ti

以下实施例中不同浓度的恩诺沙星标准溶液的配制方法为：配制恩诺沙星溶液，然后将恩诺沙星溶液加入含有0.1mol/L K

实施例1：

(一)组装Aptamer/Ti

(1)Ti

以Ti

(2)Aptamer/Ti

首先将玻碳电极用抛光粉(Al

(二)基于Aptamer/Ti

(1)标准曲线的绘制

将(一)中的Aptamer/Ti

(2)样品的检测

取某池塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K

本实施例以二维层状材料Ti

对比实施例1：

(1)Aptamer/Ti

移取2mL Ti

用移液枪移取6μL 2mg/mL的Ti

(2)标准曲线的绘制

将步骤(1)制得的Aptamer/Ti

(3)样品的检测

取某池塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K

对比实施例2：

(1)Aptamer/AgBr/GCE传感器的制备

在离心管中称取87.74mg硝酸银并将其溶于2mL氨水中，得反应液；在50mL圆底烧瓶中加入8mL乙二醇和200.10mg 1-十六烷基-3-甲基咪唑溴盐，在室温下搅拌30min，然后将反应液缓慢滴加至上述圆底烧瓶中，在90℃下油浴6h；油浴后离心得沉淀物后水洗，冷冻干燥12h，将其分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，制得2mg/mL AgBr分散液。

用移液枪移取6μL 2mg/mL AgBr的DMF分散液，滴涂到预处理过的玻碳电极(预处理方法同实施例1)表面，得到AgBr/GCE化学修饰电极，自然晾干待用；在AgBr/GCE化学修饰电极表面再滴涂6μL 2.5μmol/L恩诺沙星适配体，自然晾干6h，得到Aptamer/AgBr/GCE传感器，作为电化学发光测试的传感元件。

(2)标准曲线的绘制

将步骤(1)制得的Aptamer/AgBr/GCE传感器作为传感元件，将其置于不同浓度的恩诺沙星标准溶液中浸泡30min，取出后淋洗，作为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，并以含有0.1mol/L K

(3)样品的检测

取某池塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.1mol/L K

表1某池塘水水样的测定结果

备注：

如表1所示，样品平行测定3次，加标回收率在96.6％～101.6％之间，相对标准偏差小于5％，回收效果较好。上述实验结果说明，不用Ti

以上实施例仅用于本发明说明使用，并非对本发明的限制，有关领域的技术人员可在不脱离本发明的范围内，还可以作出相应的各种变化，因此所有等同替换或等效变型的方式形成的技术方案均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 常州大学

<120> 检测恩诺沙星的电化学发光适配体传感器及其制备方法和检测恩诺沙星的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gly

1 5 10 15

Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys

20 25 30

Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Thr

35 40 45

Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys His

50 55 60