蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及蓝舌病毒检测技术领域，具体涉及一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

蓝舌病毒（Bluetongue virus）属于呼肠孤病毒科、环状病毒属，是一种以库蠓为主要传播媒介感染包括牛、绵羊、山羊、反刍动物等发生蓝舌病（Bluetongue，BT）的病原体。蓝舌病可引起发热、极度呼气困难、口腔溃疡、皮肤和黏膜出血性病灶和重度出血性腹泻等不同临床症状，同时还会引起怀孕的反刍动物流产或产下先天感染和畸形后代，感染动物的平均病死率高达30%。自19世纪在南非发现首例感染蓝舌病的细毛羊后，由于其具有非接触传染性，可以在一些国家或地区传播、流行，同时造成反刍动物的大批死亡，带来巨大的经济损失，对畜牧业的发展构成了严重的威胁，因而引起了世界卫生组织的高度重视，WHO也将该传染病列为动物A类传染病。

蓝舌病毒存在多个不同的血清型，迄今为止全世界已发现27个血清型，而我国已鉴定出其中12个血清型的蓝舌病毒，分别为BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、15、16、21以及23型，其中BTV-1型和BTV-16型在自然感染发病的绵羊体内分离获得，是主要的致病血清型。由于蓝舌病毒具有多种血清型，各血清型之间不存在交叉免疫，且具有变异较快，传播迅速等特点。因此早期的检测和诊断，是有效预防和限制该病毒流行的关键。

目前，蓝舌病毒的检测和鉴定需要在库蠓细胞、反刍动物组织细胞或者鸡胚中培养接种，从中分离扩增病毒，再通过血清学方法检测。但此类方法存在步骤繁琐、耗时长、成本高等缺陷，同时血清学检测灵敏性和特异性稍差，容易出现交叉反应，导致出现假阳性结果。近年来，随着分子生物学的发展，分子检测技术也有了进一步的提升，分子技术也普遍应用于病毒检测和诊断。

BTV基因大小约为19kb，由10分子双链RNA（dsRNA）组成，可编码12种不同的蛋白，包括7种结构蛋白VP1-VP7和5种非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS3a和NS4。其中VP2是病毒的主要特异型抗原和血凝素蛋白，可与受体结合、参与血凝，引导宿主特异性免疫，参与病毒毒力和细胞吸附作用，同时决定着BTV的血清型。不同血清型病毒之间VP2氨基酸序列差异在22.7%到72.9之间，研究表明VP2基因可用于血清型的检测。VP2由基因组片段L2编码，长度约为3000bp，本发明中提供一种检测蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因片段特异引物及其检测方法，有利于实现蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的快速、准确的检测和诊断，缩短检测时间，对蓝舌病毒的早期检测、诊断、预防和限制该病毒的流行具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的试剂盒和检测方法。通过利用蓝舌病毒1型和16型特异性引物PCR扩增其VP2基因片段，比对PCR产物条带大小，实现两种蓝舌病毒血清型的快速、准确检测。

为实现上述目标，所采用的技术方案如下：

一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒，所述试剂盒含有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：

a、蓝舌病毒1型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACAGGCACAGTCCACTTACG3’；下游引物：5’ CATCTCGCGTGCAATCTTGG 3’；扩增片段长度为：700 bp；

b、蓝舌病毒16型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACTGACGGAGCCAGAGGAT3’；下游引物：5’ TGACGTGGTATCCGCTTTCC 3’；扩增片段长度为：367 bp；

c、如a或b所示的核苷酸序列经替换、删除或增加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与a和b所示核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还揭示了一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：合成上述蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的引物组；

步骤2：制备阳性对照和阴性对照：阳性对照为分别携带有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的质粒，由生物公司合成；阴性对照为去离子水；

步骤3：制备待测样品：提取待测样品的RNA,经反转录为cDNA后进行PCR扩增；

步骤4：分别以上述cDNA、阴性对照和阳性对照为模板，配制PCR反应体系，即将步骤2，3中所得DNA溶液加入到PCR反应体系中，分别加入2种引物组进行PCR扩增；反应体系如下：

2×Es Taq MasterMix 12.5 μL；

引物p1（100 pmol/L） 0.5 μL；

引物p2（100 pmol/L） 0.5 μL；

模板DNA 2 μL；

加ddH

反应条件为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性30 sec，61℃起第5个循环开始每个循环降低0.2℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后12℃，保存；

步骤5：取出5-10 μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像仪照相分析，与DNA Marker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，将阳性对照与待测样品进行比对，即当样品中有蓝舌病毒1型存在时，在700 bp附近出现特异性条带，当样品中有蓝舌病毒16型存在时，在367 bp附近出现特异性条带。

采用上述技术方案的有益效果是：

1、此试剂盒采用分子技术的方法，对BTV-1型和BTV-16型蓝舌病毒VP2基因的快速检测，由于引物的特异性，可确保鉴定的准确性和可靠性；

2、此方法操作简单、快速，有效缩短了病毒检测时间，重复性好，适宜推广；

3、本发明直接提取待测样本RNA,经反转录为cDNA后进行PCR扩增，检测过程简单，检测成本低，具有更强的适用性。

附图说明

图1为本发明中BTV-1型和BTV-16型蓝舌病毒检测方法的技术流程图。

具体实施方式

一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒，所述试剂盒含有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因特异性扩增引物，引物序列及产物大小如下：

a、蓝舌病毒1型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACAGGCACAGTCCACTTACG3’；下游引物：5’ CATCTCGCGTGCAATCTTGG 3’；扩增片段长度为：700 bp；

b、蓝舌病毒16型VP2基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACTGACGGAGCCAGAGGAT3’；下游引物：5’ TGACGTGGTATCCGCTTTCC 3’；扩增片段长度为：367 bp；

c、如a或b所示的核苷酸序列经替换、删除或增加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与a和b所示核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

本发明还揭示了一种蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型的检测方法，包括如下步骤：

步骤1：合成上述蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的引物组；

步骤2：制备阳性对照和阴性对照：阳性对照为分别携带有蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型VP2基因的质粒，由生物公司合成；阴性对照为去离子水；

步骤3：制备待测样品：提取待测样品的RNA,经反转录为cDNA后进行PCR扩增；

步骤4：分别以上述cDNA、阴性对照和阳性对照为模板，配制PCR反应体系，即将步骤2，3中所得DNA溶液加入到PCR反应体系中，分别加入2种引物组进行PCR扩增；反应体系如下：

2×Es Taq MasterMix 12.5 μL；

引物p1（100 pmol/L） 0.5 μL；

引物p2（100 pmol/L） 0.5 μL；

模板DNA 2 μL；

加ddH2O至25 μL；

反应条件为：94℃预变性2 min，1个循环；94℃变性30 sec，61℃起第5个循环开始每个循环降低0.2℃退火30 sec ，72℃延伸30 sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后12℃，保存；

步骤5：取出5-10 μL的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，凝胶成像仪照相分析，与DNA Marker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，将阳性对照与待测样品进行比对，即当样品中有蓝舌病毒1型存在时，在700 bp附近出现特异性条带，当样品中有蓝舌病毒16型存在时，在367 bp附近出现特异性条带。

1、样品中RNA的提取

将待测组织或细胞用RNAsimple RNA Kit试剂盒按照其操作说明提取基因组RNA，该RNA提取试剂盒可购自天根生化科技有限公司或其他生物公司。提取的RNA需立即进行反转录扩增或置于-80℃冰箱保存备用。

2、cDNA的合成

在Eppendorf管中加入8 µL上述RNA以及2 µL 5×RT Master Mix，进行反转录，反转录条件为：37℃ 25min、50℃ 5min、98℃ 5min、4℃保存。序列表

<110> 遵义医科大学

<120> 蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 蓝舌病毒(Bluetongue virus)

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tgacgtggta tccgctttcc 20。

序列表

<110> 遵义医科大学

<120> 蓝舌病毒1型和蓝舌病毒16型检测试剂盒及其检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 蓝舌病毒(Bluetongue virus)

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acaggcacag tccacttacg 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 蓝舌病毒(Bluetongue virus)

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catctcgcgt gcaatcttgg 20

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