一种基于微通道芯片的细菌富集装置及其制备方法及细菌鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物鉴定领域，特别是一种基于微通道芯片的细菌富集装置及其制备方法及细菌鉴定方法。

背景技术

细菌感染可以导致尿路感染、肾炎、脑膜炎及败血症等疾病，威胁着患者的生命。致病菌的快速准确鉴定是临床诊断与治疗的关键。目前临床上细菌鉴定仍以传统的表型检测方法为主，主要通过细菌的形态、培养及生长特征辅以生化试验实现细菌鉴定。近年来，基于分子生物学的PCR技术、16S rRNA测序等基因检测技术以及基于蛋白质组学的质谱分析技术开始被应用于细菌的鉴定分析。

传统的表型分析方法虽然能够满足临床的部分需要，但是操作繁琐、经验依赖性强、往往需要2-5天甚至更长的时间才能得到鉴定结果，十分耗时，且不适用于难培养细菌的分析。基于分子生物学的PCR及基因测序技术等可以在5-12个小时内得到鉴定结果，但需要复杂的前处理，费用昂贵，易受样品污染的干扰，且结果分析复杂，不适合基层医院对临床病原菌的快速鉴定。

质谱技术尤其是激光辅助解析离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)可以对细菌的蛋白质指纹图谱进行检测。结合现在已有的基于蛋白质组的细菌鉴定系统(如Biotyper),可以在几分钟之内实现已处理细菌样本的快速检测及鉴定。但质谱检测细菌前仍需要经过培养及预处理过程，临床液体样本如血液、尿液中细菌的浓度不足以直接用于质谱分析。目前，临床样本中细菌的质谱鉴定主要基于对固体培养基分离菌株的检测，而细菌的培养分离仍需24小时左右的时间。质谱鉴定仍受限于细菌的培养。因此，亟需一种临床样本中细菌的有效富集方法，减少或消除细菌培养所需的时间，实现临床样本中细菌的快速鉴定。目前微生物质谱鉴定基本流程是：获取生物样本→微生物培养→挑取菌落鉴定或用裂解液处理菌落→质谱鉴定；步骤反复，耗时且成本高，检测效率低，市场需要一种过程简单，时间短，效率高的细菌鉴定方法，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法及细菌鉴定方法，采用本发明的装置能够直接富集生物样本中的细菌，且富集后可以直接进行质谱鉴定，无需进行细菌培养、裂解，缩短检测时间提高效率，能够有效增强质谱信号及提高峰数量，提高检测质量。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种基于微通道芯片的细菌富集装置，包括：微通道芯片，覆盖于微通道芯片上的弹性膜，连接于微通道芯片的液体输送装置，连接于液体输送装置的注射装置和收集装置；微通道芯片包括：带有氧化层的硅片基底，设置于带有氧化层的硅片基底上的氧化层微通道结构，设置于氧化层微通道结构内部的纳米结构。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置，弹性膜包括：PDMS膜，橡胶膜。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置，液体输送装置包括：连接于氧化层微通道结构两端的液体输送通道；液体输送通道为石英毛细管，石英毛细管一端通过特氟龙管与注射装置连接作为样品输入端，另一端通过特氟龙管和收集装置连接作为富集后样品输出端。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置，氧化层微通道结构的深度为40μm±；纳米结构为一维纳米阵列，纳米线长度大于等于12μm。

一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，制备具有纳米结构的微通道芯片；

1，在带有氧化层的硅片基底表面先保护部分氧化层，再刻蚀未受保护的氧化层及基底硅片部分得到表面具有氧化层微通道结构的芯片；

2,在氧化层微通道结构的内部制备纳米结构；

步骤二，在纳米结构表面修饰化学基团或生物基团；

步骤三，搭建细菌富集装置，包括如下步骤：

1，在微通道芯片表面覆盖一层弹性膜，与芯片表面紧密贴合；

2，在微通道芯片的两端设置两个液体输送装置，用固定板压紧；

3，液体输送装置一端连接于注射装置另一端连接收集装置，液体从注射装置进入微通道芯片富集后从收集装置排出。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法，步骤一，制备具有纳米结构的微通道芯片；

1，在带有氧化层的硅片基底表面先保护部分氧化层，再刻蚀未受保护的氧化层及基底硅片部分得到表面具有氧化层微通道结构的芯片；

a，在带有氧化层的硅片基底的表面上旋涂光刻胶，再经过加热、固化，得到表面覆盖光刻胶的芯片；

b，将表面覆盖光刻胶的芯片经过曝光、显影；

c，置于加热板坚膜后将芯片浸没于缓冲液中刻蚀，取出后冲洗和吹干；

d，洗去芯片表面的光刻胶，吹干后得到表面有图案化氧化层的硅片；

e，将具有图案化氧化层的硅片浸入碱溶液中刻蚀，得到具有氧化层微通道结构的芯片；

2，在氧化层微通道结构内部制备纳米结构；

a，在具有氧化层微通道结构的芯片表面沉积银颗粒，清洗去除芯片表面残余的银离子后，将芯片浸没于氧化剂和弱酸的混合液中刻蚀、清洗；

b，将芯片浸没于强酸溶液中，除去纳米线表面的银颗粒后清洗，吹干。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法，在纳米结构表面修饰化学基团的具体方法包括如下步骤：

将获得的微通道硅纳米线芯片浸没于3-氨基丙基三乙氧基硅烷的溶剂溶液中，反应后，取出芯片冲洗、吹干；

将芯片置于双N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的溶剂溶液中反应，反应结束后冲洗吹干；

将芯片浸没于伴刀豆蛋白的缓冲剂溶液中，反应后冲洗、保存。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法，对于细菌生物基团为具有特异性亲和力的分子；具有特异性亲和力的分子包括：伴刀豆蛋白，适配体，抗体。

前述的一种基于微通道芯片的细菌富集装置的制备方法，细菌样本流入微通道硅纳米线芯片的流速为15μL/min。

一种基于微通道芯片的细菌鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，使用细菌富集装置对液体样本中细菌捕获富集；

将样品通入液体输送通道，样品中的细菌被芯片表面捕获，通入灭菌水，对捕获后的硅纳米线进行清洗；

细菌富集装置的制备过程包括：

步骤A，制备具有纳米结构的微通道芯片；

1，在带有氧化层的硅片基底表面先保护部分氧化层，再刻蚀未受保护的氧化层及基底硅片部分得到表面具有氧化层微通道结构的芯片；

2,在氧化层微通道结构的内部制备纳米结构；

步骤B，在纳米结构表面修饰化学基团或生物基团；

步骤C，搭建细菌富集装置，包括如下步骤：

1，在微通道芯片表面覆盖一层弹性膜，与芯片表面紧密贴合；

2，在微通道芯片的两端设置两个液体输送装置，用固定板压紧；

3，液体输送装置一端连接于注射装置另一端连接收集装置，液体从注射装置进入微通道芯片富集后从收集装置排出；

步骤二，在捕获细菌后的芯片表面滴加基质溶液，干燥后在MALDI-TOF质谱仪上采集指纹图谱；

步骤三，将得到的指纹图谱与细菌鉴定软件数据库中的标准图谱进行比较，根据鉴定分数得出细菌鉴定结果。

前述的一种基于微通道芯片的细菌鉴定方法，液体样本包括：血液，尿液，唾液，脑脊液。

本发明的有益之处在于：

本发明通过采用氧化层硅片作为基底，改进芯片的结构、尺寸，新增微通道，在通道内构建纳米结构，实现在芯片内有效富集液体样本中的低浓度细菌，与未经富集的检测结果相比，其质谱信号强度及峰数量显著提升；

经过实验四验证，本发明可以实现尿液样本中低浓度细菌(4×10

若经过4小时的预先培养，可以实现对于尿液样本中浓度低至4×10

本发明通过不同的表面修饰构建对不同细菌均有选择性修饰的芯片阵列，能够实现液体样本中混合菌的同时捕获鉴定。

附图说明

图1为本发明中微通道硅纳米线芯片制备的一种实施例的流程示意图；

图2为本发明的微通道硅纳米线芯片结构表征图(A：表征微通道硅纳米线芯片结构的体视镜图片，B：微通道硅纳米线芯片的截面的SEM图，C：微通道硅纳米线芯片通道底部硅纳米线的45°斜面SEM图)；

图3为本发明细菌富集装置的一种实施例的示意图；

图4中A是未经捕获与经微通道硅纳米线芯片富集后的质谱谱图对比，B是未经捕获与经微通道硅纳米线芯片的质谱图在3-15kDa范围内，信噪比≥5的质谱峰数量；

图5为本发明中微通道硅纳米线芯片捕获细菌前后的电子显微镜图(A：捕获前，B捕获后)；

图6为本发明中各个芯片结构(A)、各个硅纳米线长度(B)及各个流速(C)的条件下所得到质谱图在3-15kDa范围内，信噪比≥5的质谱峰数量；

图7中A为本发明中不同浓度大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮液经微通道硅纳米线芯片富集后所得到的质谱图；B是所得质谱图(4×10

图8为本发明中各个浓度大肠杆菌的尿液样本经微通道硅纳米线芯片富集后所得的质谱谱图。

图中的标号的含义：

1固定板，2弹性膜，3微通道硅纳米线芯片。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

如图3所示，一种基于微通道芯片的细菌富集装置，包括：微通道芯片，覆盖于微通道芯片上的弹性膜2，连接于微通道芯片的液体输送装置，连接于液体输送装置的注射装置和收集装置；微通道芯片包括：带有氧化层的硅片基底，设置于带有氧化层的硅片基底上的氧化层微通道结构，设置于氧化层微通道结构内部的纳米结构。作为一种实施例，弹性膜2包括：PDMS膜，橡胶膜；需要说明的是：只要是不与液体发生反应且具有弹性的膜层都可以应用于本发明，此处并非穷举。

液体输送装置包括：连接于氧化层微通道结构两端的液体输送通道。作为一种优选，液体输送通道为石英毛细管，石英毛细管一端通过特氟龙管与注射装置连接作为样品输入端，另一端通过特氟龙管和收集装置连接作为富集后样品输出端；要说明的是：只要是能够完成液体输送都可以应用于本发明，此处并非穷举。

如果氧化层微通道结构的深度过浅，则可容纳的液体样本量较少；如果氧化层微通道结构的深度过深，会导致质谱检测分子量偏差较大，所以优选氧化层微通道结构的深度为40μm±。

纳米结构为一维纳米阵列，作为一种优选为纳米线，纳米线长度大于等于12μm。

如图1所示，一种基于微通道硅纳米线芯片3的细菌富集装置的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，制备具有纳米结构的微通道芯片；

作为一种优选，带有氧化层的硅片基底的参数为1cm×1cm，氧化层厚度1μm。

1，在带有氧化层的硅片基底表面先保护部分氧化层，再刻蚀未受保护的氧化层及基底硅

片部分得到表面具有氧化层微通道结构的芯片；

a，将表面覆盖光刻胶的芯片经过曝光、显影；

作为一种优选，将表面覆盖光刻胶的芯片置于加热板上，前烘固化光刻胶，在芯片表面覆盖光掩模，置于紫外曝光机下曝光，浸入0.7％NaOH溶液中显影，洗去曝光区的光刻胶。需要说明的是这些选择；只是一种实施例，并非穷举，只要是能实现保护部分氧化膜的都适用于本发明。

b，置于加热板坚膜后将芯片浸没于缓冲液中刻蚀，取出后冲洗和吹干；

作为一种优选，缓冲液为BHF缓冲液，冲洗为去离子水冲洗，吹干采用氮气吹干；目的是为了除去没有光刻胶保护部分的氧化膜；需要说明的是这些选择只是一种实施例，并非穷举，只要是能除去保护部分的氧化膜的试剂都适用于本发明。如通过溅射刻蚀(SE)或CF

c，洗去芯片表面的光刻胶，吹干后得到表面有图案化氧化层的硅片；

d，将具有图案化氧化层的硅片浸入碱溶液中刻蚀，得到具有微通道的硅片；

作为一种实施例，碱溶液为30％KOH水溶液；该步骤的目的是：刻蚀没有氧化层保护的硅，这步刻蚀结束之后表面还存在氧化层；需要说明的是这些选择只是一种实施例，并非穷举，只要是能完成刻蚀没有氧化层保护部位的硅的都适用于本发明。如选用乙二胺邻苯二酚(EDP)、四甲基氢氧化铵(TMAH)进行湿法刻蚀。或通过六氟化硫(SF

以上举例并非穷举：只要是能够在带有氧化层的硅片基底表面得到氧化层微通道结构的方法都适用于本发明。

2,在氧化层微通道结构的内部制备纳米结构；

作为一种实施例包括如下步骤：

a，将具有氧化层微通道结构的芯片在表面沉积银颗粒，清洗去除芯片表面残余的银离子后，将芯片浸没于氧化剂和弱酸的混合液中刻蚀、清洗；

作为一种优选，将具有氧化层微通道结构的芯片在表面沉积银颗粒的方法为：将具有氧化层微通道结构的芯片浸没于0.02M AgNO

作为一种优选，氧化剂和弱酸的混合液为0.4M H

b，作为一种实施例，将芯片浸没于强酸溶液中，除去纳米线表面的银颗粒后清洗，吹干，

得到的芯片如图2所示。

作为另一种实施例，将具有氧化层微通道结构的芯片浸没于含4.8M HF和0.02MAgNO

以上举例并非穷举：只要是能够在氧化层微通道结构的内部制备纳米结构的方法都适用于本发明。

步骤二，在纳米结构表面修饰化学基团或生物基团；

化学修饰微通道硅纳米线芯片包括如下步骤：

将获得的微通道硅纳米线芯片3浸没于3-氨基丙基三乙氧基硅烷的溶剂溶液中，反应后，取出芯片冲洗、吹干；

将芯片置于双N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的溶剂溶液中反应，反应结束后冲洗吹干；

将芯片浸没于伴刀豆蛋白的缓冲剂溶液中，反应后冲洗、保存；

本发明通过不同的表面修饰构建对不同细菌均有选择性修饰的芯片阵列，能够实现液体样本中混合菌的同时捕获鉴定；作为一种优选，选用伴刀豆蛋白修饰芯片，对多种革兰氏阴性菌具有亲和力，扩大测试菌种的范围。需要说明的是：这里修饰选用的试剂都只是一种优选，只要是基于本发明的芯片的修饰的试剂都在本发明的保护范围内。

为了提高硅纳米线与微生物的亲和力进行修饰。

若微生物为细菌，生物基团包括：对于细菌具有特异性亲和力的分子包括伴刀豆蛋白、适配体及抗体等。

步骤三，搭建细菌富集装置，包括如下步骤：

在微通道硅纳米线芯片3表面覆盖聚二甲基硅氧烷弹性膜2，在图案化通道的两端设置连接于注射器、废液瓶的液体输送通道，用固定板1压紧，如图3所示。作为一种优选，固定板1为亚克力板。

一种基于微通道芯片3的细菌鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一，使用上文描述的细菌富集装置中的微通道硅纳米线芯片3对液体样本中细菌的捕获富集；

将样品通入液体输送通道，样品的细菌被芯片表面捕获，通入灭菌水，对捕获后的硅纳米线进行清洗；液体在芯片微通道内得到富集，细菌样本流入微通道硅纳米线芯片的最佳流速为15μL/min。

步骤二，在捕获细菌后的芯片表面滴加基质溶液，干燥后采用MALDI-TOF MS采集蛋白质指纹图谱。作为一种优选，基质溶液为：滴加1μLα-氰基-4-羟基肉桂酸在乙腈、三氟乙酸和去离子水的混合溶液中的饱和溶液；乙腈、三氟乙酸和去离子水的体积比为50:2.5:47.5。

以下用实验验证本发明的有益效果；

按照如下的方式制备微通道硅纳米线芯片运用于实验一、二、三、四：

(1)通过旋涂仪在带有氧化层的硅片基底(1cm×1cm，氧化层厚度1μm)表面旋涂光刻胶(4000rpm,40s)。将表面覆盖光刻胶的芯片置于加热板上，前烘固化光刻胶。然后在芯片表面覆盖具有特定图案的光掩模，置于紫外曝光机下曝光。浸入0.7％NaOH溶液中显影约40s，洗去曝光区的光刻胶。置于加热板坚膜。随后将芯片浸没于BHF缓冲液中，室温刻蚀10min，除去无光刻胶保护部分的二氧化硅层。取出后采用去离子水冲洗后，氮气吹干。采用丙酮洗去芯片表面的光刻胶，氮气吹干后得到表面有图案化氧化层的硅片。

(2)将具有图案化氧化层的硅片浸入30％KOH水溶液中，90℃，刻蚀20min。得到具有微通道的硅片。将具有氧化层微通道结构的芯片浸没于0.02M AgNO

(3)将获得的微通道硅纳米线芯片3浸没于3-氨基丙基三乙氧基硅烷(4％，v/v)的乙醇溶液中，室温下反应1h后，取出芯片。乙醇冲洗后，氮气吹干。然后将芯片置于双N,N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈溶液中(10mM)，室温反应15min。反应结束，用乙腈冲洗芯片后氮气吹干。最后将芯片浸没于伴刀豆蛋白的PBS溶液中(30μg/mL)，室温反应1h后，PBS缓冲液冲洗后置于4℃保存。。

将得到的微通道硅纳米线芯片3用于如下实验：

实验一，对微通道硅纳米线细菌富集性能的验证，具体实验如下：

将0.5mL，大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮液(4×10

实验结果：图4A是本发明中未经富集与经微通道硅纳米线芯片3富集后的质谱谱图对比，图4B是这两个质谱图在3-15kDa范围内，信噪比≥5的质谱峰数量。图5是本发明中微通道硅纳米线富集大肠杆菌后的电子显微镜图。

结果分析：由图4可知，当细菌浓度为4×10

实验二，捕获效率影响因素优化；

对于液体样本中细菌的捕获，细菌与捕获平台之间的相互作用十分重要。本实验优化了芯片结构、纳米线长度及流速对于捕获效率的影响。对芯片结构的优化中，将0.5mL大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮液(4×10

对于纳米线长度的优化，将0.5mL大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮(4×10

对于流速的优化，将0.5mL大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮(4×10

实验结果：图6是本发明不同结构芯片、不同硅纳米线长度以及不同流速下芯片捕获细菌所得质谱图在3-15kDa之间信噪比≥5的峰数量对比。

结果分析：由图6可知，微通道硅纳米线芯片3的氧化层微通道结构、硅纳米线结构及表面修饰的协同作用提高了细菌的捕获效率。微通道中硅纳米线长度的增加可以增加与细菌的接触面积及结合位点，进而提高了捕获效率。当纳米线长度在12μm以上时，捕获效率随纳米线长度增加的增长较小，且更长的纳米线需要较长的刻蚀时间，因此本发明中实验均采用12μm的硅纳米线。当样品流通速度在5-15μL/min范围内时，细菌的捕获效率随着流速的增加而上升。这是因为随着流速增加，捕获通道内的压力会相应上升，使得样品会浸入纳米线更深处，增加了细菌与纳米线的接触面积，进而提高了捕获效率。当流速进一步提高时，细菌与样品结合时间降低，捕获效率明显下降。因此，本发明中采用15μL/min的流速。

实验三，液体样本中低浓度细菌的直接捕获鉴定，具体实验如下：

将0.5mL，大肠杆菌在PBS中的悬浮液及健康人尿液加标大肠杆菌的样品(浓度分别为4×10

实验结果：

如图表1和图7所示，图7中A为本发明中不同浓度大肠杆菌在PBS缓冲液中的悬浮液经微通道硅纳米线芯片富集后所得到的质谱图；B是所得质谱图(4×10

表1是不同浓度大肠杆菌在PBS中的悬浮液富集后的鉴定得分及健康人尿液样本中不同浓度大肠杆菌富集后的鉴定得分。

表1

结果分析：表1中的鉴定得分表明，基于图案化硅纳米线的富集鉴定方法实现了液体样本中低浓度细菌的免培养检测。对于PBS中细菌的检测限为4×10

实验四，液体样本中低浓度细菌短时间培养后的富集鉴定，具体实验如下：

取3mL加标大肠杆菌的健康人尿液样本，加入等体积的LB液体培养基(加入培养基后细菌浓度分别为4×10

实验结果：

如表2和图8所示；

图8是本发明中加标不同浓度大肠杆菌的尿液样本经微通道硅纳米线芯片富集后所得的质谱谱图；

表2是加标不同浓度大肠杆菌的尿液样本培养4h后富集鉴定得分。

表2

结果分析：经4h的培养，尿液中加标4×10

本发明通过改进芯片的结构、尺寸，新增微通道，将通道内设为纳米结构，实现可在芯片内有效富集液体样本中的低浓度细菌，使得质谱信号强度及峰数量显著提升；缩短富集与检测的整个流程和时间，提高检测效率。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。